光（化）遺傳技術基礎與轉基因小鼠的應用

徐敬楊

摘 要|光遺傳學和化學遺傳學均為人工調節神經元活性的相關技術，分別興起于 21 世紀初和 20 世紀 90 年代。這兩項技術的主要路線相似，通過遺傳學手段使目標

腦區的神經元表達出光敏離子通道蛋白或者人工受體蛋白，再利用外加刺激影響重組通道蛋白的活性，從而改變神經元動作電位的產生與抑制，最后觀察動物行為的變化，討論動物行為的變化和腦區神經元活性的關系，換言之，技術目的為分析心理或行為的腦內機制。該類技術的使用往往還需要依靠其他生物學工具，如使腦內神經元表達出外源光敏離子通道蛋白或者人工受體蛋白所需的重組腺相關病毒，以及 Cre 鼠相關的轉基因技術等。此外，光遺傳學和化學遺傳學在行為神經科學中備受青睞，但應用范圍不僅僅局限于此，它們還可以應用于胞內信號轉到、疾病研究或者藥物設計學等多個領域。雖然該技術仍存在些許不足，但總體瑕不掩瑜，未來在行為神經科學研究和神經及精神領域疾病的治療中具有可觀的潛力。

關鍵詞|光遺傳學;化學遺傳學;重組腺相關病毒;轉基因小鼠;基本原理;技術路線

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1?????? 光遺傳與化學遺傳概述

1.1?? 光遺傳學的發明和基本原理

光遺傳學的概念于 2006 年首次被斯坦福大學的卡爾·迪賽羅斯（Karl Deisseroth）提出，他與麻省理工學院的愛德華·博伊登于 2004 年 8 月獲得了該技術實驗的成功，自此兩人共同開創了光遺傳學的時代[1]。

光遺傳學是以 DNA 重組為代表的遺傳學與光學相結合的一種細胞生物學研究技術方法，通常利用轉基因技術或者病毒侵染使受體細胞在細胞膜上表達出光敏通道蛋白，如視紫紅質通道蛋白 2（channel rhodopsin-2，ChR2）和嗜鹽菌視紫紅質（halorhodopsin，HR）等視蛋白。如圖1 所示，這些特殊的通道蛋白活性可以被特定波長的光調節，進而定向激活神經元膜電位的去極化或者超極化， 如前述的 ChR2 和 NpHR 光敏通道蛋白可分別由藍色或者黃色的光進行調節，不同通道蛋白不僅需要特定波長的光，在接受光刺激后也會存在不同離子向不同方向的流動，例如 HR 接受黃光刺激后會出現氯離子內流從而產生膜電位超極化的結果，而 ChR 接受藍光刺激后會出現鈉離子、鉀離子和氫離子的內流從而產生膜電位去極化的結果[2]。這一技術的優越性在于優秀的特異性，可以特異性地針對某一類細胞，即帶有特定光敏離子通道的神經元[3]。該技術被 Nature Method 評為 2010 年的“年度技術”，它行為神經科學研究和神經及精神領域疾病的治療提供了更多的可能[4]。

1.2?? 化學遺傳學的背景和基本原理

相比之下，化學遺傳學的研究要早于光遺傳學，它在 20 世紀 90 年代中期就已經興起，是一種小分子化合物和基因編輯融合的新興技術，利用遺傳學方法改造的內源性受體蛋白使其能夠被特定小分子藥物調節[6]，因此受體蛋白的活性變得可以人為控制，換言之，這也意味著受體蛋白所在的神經細胞的活性也可以控制。

在該技術中， 只由特定藥物激活的受體（designer receptor sexclusively activated by designer drugs，DREADDs）是使用最為廣泛的一種，這是一類只由氯氮平 -N- 氧化物（Clozapine-N-oxide，CNO） 激活的受體， 其中，Gq- DREADD 和 Gi-DREADD 是使用最多的兩種人工受體。Gq-DREADD 又稱為hM3Dq，這是一種從人毒蕈堿乙酰膽堿受體 M3（hM3D）改造的僅對 CNO 有反應的人工受體，當 CNO 和 hM3D 結合后，可打開神經元的外向鉀離子通道， 使該神經元去極化，從而形成動作電位;Gi-DREADD 又稱為 hM4Di，這是一種從人毒蕈堿乙酰膽堿受體M4（hM4D）改造的僅對 CNO 有反應的人工受體， 當 CNO 和 hM4D 結合后，可打開神經元的內向鉀離子通道，使該神經元超極化從而抑制動作電位的產生[5，7，8]，如圖2 所示。

此外，化學遺傳學也為藥物篩選與開發奠定了基礎，調節用小分子藥物或能稱為治療疾病靶點的潛在藥物[9]。化學遺傳學和光遺傳學類似，人工改造后的受體蛋白在神經元中的表達可通過rAAV 轉染細胞實現。這項技術的一個優越性在于調節是可逆的，通過目標腦區給藥、腹腔注射或者口服特定藥物實現即可受體蛋白的人工調節[5]，待藥物被全部代謝后，對受體蛋白的調節作用則會消失。

2?????? 腺相關病毒在光遺傳學和化學遺傳學中的應用

腺相關病毒（AAV）是一種無被膜且無法自主復制的二十面體微小病毒， 遺傳物質為單鏈線性 DNA。重組腺相關病毒載體（rAAV）常用于基因編輯中，它的優勢在于廣泛的宿主細胞、免疫原性低、體內表達時間長等。在光遺傳學和化學遺傳學中，利用腦立體定位注射的方法將 rAAV 注射入目標腦區，rAAV可通過膜受體介導的內吞作用進入并侵染神經元，病毒經核孔再進入細胞核后在核內裂解，裸露的重組單鏈 DNA 逆轉錄形成雙鏈 DNA，最終在胞內表達出重組蛋白，即光敏離子通道蛋白或目標人工受體[10]，如圖3 所示。事實上， rAAV 中往往不止整合入了光敏離子通道蛋白的編碼基因，還有上游的特異啟動子和下游的熒光標簽蛋白的編碼基因，如紅色熒光蛋白（RFP）或綠色熒光蛋白

（GFP）等。啟動子因 rAAV 侵染組織或下游功能基因的不同而不同，下游熒光蛋白的意義在于證明光敏離子通道蛋白的存在，光遺傳學相關實驗結束后可通過腦切片中有無熒光信號來證實。

rAAV 根據可侵染組織的不同被分為很多種，可被神經系統中的細胞膜受體識別的 rAAV 有 rAAV2/1、rAAV2/2、rAAV2/4、rAAV2/5 等多種重組腺病毒，其中 rAAV2/1 在高滴度時可憑借囊泡順向跨突觸。還有其他親和肝臟、胰臟或肌肉等組織的 rAAV[10]，如圖4 所示。

3?????? 光遺傳學的技術路線

如圖5 所示，該技術從重組腺病毒的獲得到數據分析的全程技術操作可分成三大板塊，即光感基因病毒載體技術、光 / 神經界面技術以及光電極陣列技術（若選用轉基因小鼠則可進行第二板塊的操作）。

3.1?? 光感基因病毒載體技術

按第一部分所述的光遺傳學原理，激光只能調節成功表達出光敏離子通道蛋白的神經元，因此，使神經元帶上光敏離子通道蛋白是光遺傳學的基本。rAAV 轉染法中，重組病毒的構建采用的是將重組 DNA 鏈直接導入病毒蛋白衣殼的方法，這一步可以不自行操作，重組腺病毒直接購買比較容易，實驗室中需要做的是將重組腺病毒注射入目標腦區，常采用的是腦立體定位注射技術， 一段時間后病毒表達完成，此時方可繼續開展后續的實驗步驟。這一板塊除了為光遺傳學技術的開展奠定必要基礎之外，還能夠實現光遺傳學中優秀的特異性，即神經細胞的選擇性。

3.2?? 光 / 神經界面技術

完成光敏離子通道蛋白特異性表達后可以向目標腦區中埋入光纖，并用特定顏色的激光刺激目標腦區中的神經元，如藍光可使 ChR 打開，鈉離子向神經元內流動，最終產生了去極化的結果。這一板塊可實現信息的寫入。

3.3?? 光電極陣列技術

光遺傳學直接的實驗結果為一系列的神經元膜電位和被試動物行為的變化， 在生理心理學中，光遺傳學用于分析心理或行為的腦內機制，常用的模式即為 探究目標腦區神經元的激活或抑制和特定行為的聯系，例如利用藍光激活右側 次級運動皮層（M2）中表達了ChR 的神經元后，小鼠會產生持續轉圈的行為特征， 當激光關閉時小鼠自發活動方向恢復正常。這一板塊實現了光遺傳學結果的信 息讀取[11]，如圖5 所示。

4?????? 化學遺傳學的技術路線

化學遺傳學的技術路線和光遺傳學相似，從病毒轉染到記錄實驗結果大致也分為三個板塊，即人工受體蛋白表達、給予 CNO 和結果記錄。

4.1?? 人工受體蛋白表達

鑒于 DREADDs 的種類繁多，根據實驗目的選取合適的人工受體十分重要， 和光遺傳學相同，可采用重組腺相關病毒注射的方法或直接使用轉基因小鼠模 型使神經元表達出人工受體蛋白。當采用病毒注射的方法時，所用 rAAV 中同樣帶有特異的啟動子、人工受體蛋白編碼基因以及熒光蛋白編碼基因等，若重組 載體需為 Cre 依賴的 DIO 系統，人工受體蛋白編碼基因與啟動子方向相反且兩端還需要帶有 loxp 位點。設計好的 rAAV 通過腦立體定位注射的方式進入目標腦區，侵染細胞，以前述方式使目標腦區的神經細胞表達出特定的人工受體蛋白。

4.2?? 給予 CNO

在特定時間通過腹腔注射、目標腦區直接給藥或者口服給予小鼠小分子藥物 CNO，激活或抑制目標腦區中表達的人工受體蛋白，從而達成調節目標腦區中神經元活性的目的。

4.3?? 記錄膜電位及行為變化[11]

同樣的，化學遺傳學也被用于分析心理或行為的腦內機制，在小分子藥物藥效時間內，觀察并記錄目標腦區中神經元的膜電位以及動物特定行為的變化， 即可證明該腦區中神經細胞活性的變化和動物行為的聯系，如圖6 所示。實驗結束后取腦切片，觀察目標腦區中是否存在熒光信號，可進一步證明實驗結論。

5?????? 轉基因小鼠的應用

5.1?? Cre-LoxP 系統的基本原理

Cre-LoxP 是一種常用于基因工程的技術，如圖7 所示，其中的 Cre 指環化重組酶，它是一種具有核酸內切酶活性的蛋白質，能夠特異性識別 LoxP 位點并且在該位點處切斷 DNA 鏈，最終使 DNA 鏈發生重組，可能造成 DNA 片段缺失、插入、易位、翻轉等結果。Cre 酶的編碼基因可由任何一種啟動子調控，使用不同的啟動子可以實現 Cre 酶在特定器官、組織或細胞中表達，這一點也是該系統在應用過程很重要的特點。LoxP 指一段特殊的 DNA 序列，每一個 LoxP 位點由兩個 13bp 反向重復序列和中間間隔的 8bp 序列組成，應用于基因編輯的LoxP 位點在目標基因的 5 和 3 兩端各存在一個。其中 8bp 的中間間隔序列決定了 LoxP 位點的方向性，13bp 的反向重復序列是 Cre 酶的結合位點[12，13]。

DNA 重組結果的不同是由兩端 LoxP 方向的不同所造成的，當某基因兩端的LoxP 方向相同時，會造成該基因的翻轉;當某基因兩端的 LoxP 方向相反時，則會造成該基因的敲除缺失;當兩組 LoxP 位點分別位于兩條染色體上時，會造成DNA 序列的易位。

5.2?? 化學遺傳學中的 Cre-LoxP

如前文所述，在神經元的遺傳改造中，除了單一 rAAV 轉染的方法以外也可以由轉基因小鼠的參與，而在光遺傳學和化學遺傳中更多需要的是基因敲入或者條件性基因表達，Cre-LoxP 或者 Cre-FloxP 基因編輯系統可以較好地實現條件性表達，Cre 工具鼠在這兩項技術中的應用十分廣泛。

根據雙元轉基因系統理論，目標基因兩端帶有 LoxP 序列的動物和帶有 Cre 重組酶編碼基因的動物雜交后代會出現目標基因兩端帶有 LoxP 同時又能夠表達Cre 重組酶的個體[12]。據前文所述，Cre 重組酶編碼基因上游的啟動子可以決定蛋白表達的組織特異性，則可在制作 Cre 工具鼠時根據實驗目的所需，選取能夠在腦組織中特異啟動的啟動子。如 4.1 中所述，目標腦區的病毒注射可以得到帶有反向目標蛋白編碼基因的親本動物，當它與經基因編輯得到的 Cre 工具鼠雜交時，即可得到能夠將人工受體蛋白編碼基因翻轉回正向的子代個體，進而該個體能夠表達出目標蛋白。

6?????? 以光遺傳學或化學遺傳學為研究手段的實例

6.1?? 光遺傳學相關研究

2020 年的一項研究利用光遺傳學的方法證明了中腦腹側被蓋區（VTA） 中的 GABA 能神經元參與調控了小鼠的捕獵行為。作者首先監測了在小鼠捕食蟋蟀時 VTA 腦區內 GABA 能神經元活性的變化，其次利用光遺傳學的方法人工激活了該神經元并觀察行為變化。研究者選用了 AAV-VGAT-Cre 和 AAV- hEF1α-DIO-ChR2-mCherry 兩種重組腺相關病毒，利用腦立體定位注射將病毒打入了小鼠的 VTA 腦區中。根據前述 Cre-LoxP 系統的基本機理，在 VTA 中被兩種病毒侵染的 GABA 能神經元內，Cre 酶表達進而翻轉 rAAV 中 ChR2 的編碼基因，進而使這一光敏離子通道蛋白能夠表達并出現在細胞膜上。病毒充分表 達一段時間后，開始進行小鼠捕獵相關的行為實驗，即使用波長為 473nm 的藍光刺激 VTA 腦區，觀察光刺激開啟和關閉時小鼠行為的變化。行為實驗結束后， 進行取腦、切片及 c-Fos 蛋白免疫熒光染色，觀察 c-Fos 表達情況。最后用前述光遺傳學的實驗方法探究 VTA 到外側下丘腦（LH）之間的 GABA 神經環路與捕獵行為的聯系。實驗結果顯示，小鼠在捕獵行為中 VTA 內 GABA 能神經元的活性確有提高，并且人為激活該神經元能夠觸發動物的捕獵行為，在行為實驗中體現為捕獵潛伏期縮短，主動覓食和攻擊的概率增加，持續啃咬飼料的時間延長等。另外 VTA 內的 c-Fos 蛋白量存在明顯升高，當特異性激活 VTA 和 LH 之間的 GABA 能神經環路時，能夠促使小鼠捕獵行為的發生[14]。

6.2?? 化學遺傳學相關研究

2019 年一項研究利用化學遺傳學的方法研究了基底前腦—海馬膽堿能神經環路對阿爾茲海默癥早期認知功能障礙的影響。該研究首先分析了阿爾茲海默癥模型小鼠在行為和代謝的異常所在，指出了基底前腦和海馬內存在 Aβ 斑塊的沉積。接下來分析了人工激活基底前腦—海馬膽堿能神經環路后小鼠行為的變化，利用腦立體定位注射向基底前腦注射了 rAAV-ChAT-Cre-2a-EGFP- WPRE-pA 和 rAAV-efla-Dio-hM3Dq-mCherry-WPRE-pA 兩種重組腺相關病毒， 則在被兩種病毒侵染的神經元內存在人工受體蛋白 hM3Dq 的表達，一段時間后通過腹腔注射給予 CNO 來激活神經環路，同時設置生理鹽水注射組平行對照， 而后同樣開展行為和代謝情況的檢驗。最后通過激光共聚焦掃描成像技術再進一步明確 hM3Dq 在神經元上的表達。實驗結果顯示，人工激活基底前腦—海馬膽堿能神經環路后小鼠體現出了學習記憶行為得到恢復，且基底前腦內的膽堿（Cho）和海馬內 N- 乙酰天門冬氨酸（NAA）的含量出現上升，同時也證實了神經元膜上存在人工受體蛋白 hM3Dq。總之，該研究通過化學遺傳學技術成功揭示了調控基底前腦—海馬膽堿能神經環路能夠提升基底前腦中 Cho 和海馬中NAA 的含量，進而改善阿爾茲海默癥模型小鼠的認知學習能力[15]。

7?????? 總結

光遺傳學和化學遺傳學為神經科學和生理心理學等研究提供了更多可能，這兩項技術實現了神經元激活與抑制的人為控制，為探究腦區功能奠定了有力的基礎。對于光遺傳學來說，該技術操作相對簡單易行也頗具靈活性，除了前述神經科學和生理心理學研究之外，它還能夠應用于疾病的病理分析和治療。一方 面，對于化學遺傳學來說，它的應用范圍非常廣泛。不僅僅局限于神經科學或 生理心理學的研究，還可以參與到酶活性研究、細胞信號轉導分析、基因轉錄、疾病研究乃至藥物設計學等多個領域。另一方面，光遺傳學技術雖然潛力可觀， 但是它仍存在一定的局限性。其一是持續激光刺激的時間不宜過長，由于光的 產熱效應會對實驗產生干擾，所以最多不可超過十分鐘;其二是可應用光遺傳 學的行為實驗有限，由于光纖的存在，只有如礦場等無障礙地行為實驗才可使用， 相反，如穿梭箱一類存在障礙物的則無法開展。

技術的局限性并不能抹殺它們可觀的潛力，我們仍期待著未來光遺傳學和 化學遺傳學在行為神經科學研究和神經及精神領域疾病的治療中貢獻更多力量。

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Technical Basis of Optogenetics and Chemical Genetics， and the Application of Transgenic Mice

Xu Jingyang

Southwest university， Chong Qing

Abstract： Both photogenetics and chemical genetics are the techniques for

artificially regulating the activity of neurons. They emerged at the beginning of this century and the 1990s respectively. The main routes of the two technologies are similar. It is through genetic that lead neurons in the target brain region express photosensitive ion channel proteins or artificial receptor proteins. Then the activity of recombinant channel protein was affected by external stimulation. So as to change the generation and inhibition of neuronal action potential. Finally， the changes of animal behavior were observed， and the relationship between the changes of animal behavior and the activity of neurons in the brain was discussed. In other words， the purpose of technology is to analyze the brain mechanism of psychology or behavior. The use of this kind of technology often depends on other biological tools， such as the recombinant adeno-associated virus needed to make brain neurons express exogenous photosensitive ion channel protein or artificial receptor protein， and the transgenic technology related to Cre mice. In addition， photogenetics and chemical genetics are very popular in behavioral neuroscience， but their applications are not limited to this. They can also be used in many fields such as intracellular signal transduction， disease research or drug design. Although there are still some shortcomings in this technology， there are also advantages cannot be covered up. It has considerable potential in the research of behavioral neuroscience and the treatment of neurological and mental diseases in the future.

Key words： Photogenetics; Chemical genetics; Recombinant adeno-associated virus; Transgenic mice; Basic principle; Technical route