海岸水虱消化道的凝結芽孢桿菌分離鑒定及其產酶能力研究

摘要：采用傳統的微生物富集、分離純化方法，對海岸水虱（Ligia exotica）消化道微生物進行分離鑒定，得到1株產酶能力較強的菌株，命名為HZL-3。利用分子生物學方法，初步確定其為凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）。采用ELISA法檢測HZL-3產蛋白酶、淀粉酶含量，并研究溫度、pH、培養時間、接種量等因素對其產酶量的影響。結果表明，HZL-3能夠產生蛋白酶和淀粉酶;溫度36 ℃，pH為7.5，培養16 h，接種量為6%，蛋白酶活性最高;溫度36 ℃，pH為6.0，培養10 h，接種量為4%，淀粉酶活性最高，研究旨在揭示海岸水虱消化道微生物作為水產養殖益生菌的潛在應用。

關鍵詞：海岸水虱（Ligia exotica）;凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）;分離鑒定;蛋白酶;淀粉酶

中圖分類號：Q939.9 " " " " 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2022）03-0078-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2022.03.015 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Isolation and identification of Bacillus coagulans from the digestive tract of Ligia exotica and investigation of its enzyme production

ZHU Xin-ying1，SU Hong2，WANG Wei-bing3， XU Yong-zhong3， WANG Hong-bin1

（1. College of Marine Life and Fisheries Sciences， Jiangsu Ocean University， Lianyungang "222005， Jiangsu，China;

2. Xuzhou Aquarium，Xuzhou "222005，Jiangsu，China; 3. Suqian Dajiang Feed Co.，Ltd.， Suqian "223900， Jiangsu， China）

Abstract： In the experiment， a traditional method to enrich， separate and purify microorganisms was used in the digestive tract of Ligia exotica， and a strain with strong enzyme production ability was obtained and was named HZL-3 which was preliminarily determined as Bacillus coagulans by using molecular biological method. Contents of protease and amylase produced by HZL-3 was measured by ELISA and the effects of temperature， pH， culture time， inoculation amount and other factors on the amount of enzyme production were studied. The results showed that HZL-3 was able to produce protease and amylase; "when cultured for 16 h at 36 ℃， pH 7.5， and 6% inoculation amount， "protease activity was maximal; and amylase activity was the highest at 36 ℃， pH 6.0， when inoculation amount was 4%， and cultured for 10 h. This study aims to reveal the potential applications of microorganisms in the digestive tract of Ligia exotica as probiotics in aquaculture.

Key words： Ligia exotica; Bacillus coagulans; isolation and identification; protease; amylase

近年來，水產動物高密度養殖已成為現代養殖的主流模式，但也因此造成水產動物疾病的大量發生，人類活動的干預及抗生素的不當使用使得水產動物體內殘留大量藥物，通過食物鏈進入人體，嚴重影響了人類身體健康[1-3]。由于抗生素的使用帶來了各種不良后果使其在水產品養殖與生產中逐漸被禁止使用，這就需要研發新的無毒副作用的替代品[3]。益生菌是最近發現并研究的熱點之一，益生菌制劑已經被大量應用到水產養殖業中，給這一行業帶來了巨大的經濟效益[4]。益生菌不僅在水產養殖技術中被廣泛應用，在其他方面也很重要，如生物防治、臨床醫學以及飼料添加等[4]。

海岸水虱（Ligia exotica）又名海蟑螂，俗稱海蛆，是一種廣泛分布的世界性物種，該種類群是等足目潮蟲亞目中個體最大、最原始的類群，生活于沿海潮間帶高潮淺巖石間或海灘邊的建筑物基部的縫隙中，有時也在中潮帶作急速的覓食活動，常藏于船艙內，隨船漂游，身體水分流失的速度很快所以該種只能生活在海邊與湖邊這種高濕度的環境，食性為雜食性，喜歡藻類植物及海濱殘存的有機物碎屑，常作為海濱污染的指示生物，海岸水虱體內具有抗腫瘤成分，具有高效無毒的特點，有開發的潛力[5-8]。本試驗對海岸水虱體內消化道微生物進行富集、分離鑒定，旨在揭示其作為水產養殖益生菌的潛在應用。

本試驗材料采自連云港高公島灘涂的海岸，從海岸水虱的消化道內分離出1株產酶活性較高菌株，經16S rRNA序列比對分子生物學鑒定，確定為凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans），并對其產蛋白酶、淀粉酶能力及影響因素進行初期探索，旨在揭示其作為水產養殖業的潛在應用，可以為益生菌的研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 海岸水虱 海岸水虱采自連云港高公島潮間帶。

1.1.2 培養基 牛肉膏蛋白胨液體培養基：牛肉膏1.5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉2.5 g，水500 mL，pH 7.2，121 ℃高壓滅菌20 min;牛奶平板：在牛肉膏蛋白胨固體培養基中添加終質量為1.5%的脫脂奶粉。淀粉液體培養基：牛肉膏5 g，蛋白胨2.5 g，氯化鈉2.5 g，可溶性淀粉1 g，500 mL無菌水，pH 7.5左右，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.1.3 試劑 DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒、PCR擴增及其他分子生物學試劑購自TAKARA公司;PCR引物合成由TAKARA公司完成;16S rRNA由上海派森諾公司完成測序;蛋白酶及淀粉酶酶聯免疫分析試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 將采集的海岸水虱先用70%乙醇沖洗軀體表面2次，再無菌水沖洗5～6次，最后1次的洗滌液作為對照接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基中進行無菌測試;無菌條件下，用無菌剪刀剪開海岸水虱軀體，切開消化道，取其內容物接種至牛肉膏蛋白胨液體培養基擴增培養，后對培養物進行平板分離純化，挑取1株優勢菌，命名HZL-3，4 ℃保存備用。

1.2.2 菌株鑒定 應用DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒抽提HZL-3的基因組DNA，以其為模板，用27F和1492R引物對其16S rRNA進行PCR擴增（PCR反應條件為預變性 95 ℃ 5 min;變性 94 ℃ 30 s;退火 51 ℃ 40 s;延伸 72 ℃ 90 s;終止延伸 72 ℃ 10 min;30個循環），結果經瓊脂糖凝膠電泳確認。PCR擴增產物送上海派森諾公司完成測序，測序結果提交到NCBI，進行序列比對分析及同源性比較，用MEGA5.0軟件鄰接法構建系統進化樹。

引物序列：27F-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;1492R-GGTTACCTTGTTACGACTT。

1.2.3 產酶特性研究 制備牛奶平板，將菌液稀釋，取10-4、10-5 2個稀釋度進行平板涂布，培養24 h觀察，確定是否產蛋白酶。制備淀粉固體培養基，將菌液稀釋，取10-4、10-5 2個稀釋度進行平板涂布，培養24 h后，盧戈氏碘液鑒定是否產生水解圈，確定淀粉酶的產生。

1.2.4 產酶影響因素研究

1）培養溫度對HZL-3菌株產酶的影響。試驗分別設置25、28、32、36、40 ℃不同的培養溫度，其他條件固定為pH為7，轉速140 r/min，接種量4%，培養24 h通過酶聯免疫分析（雙抗體夾心法）測定酶濃度來研究培養溫度對HZL-3菌株產酶的影響。蛋白酶及淀粉酶酶聯免疫分析試劑盒使用根據說明書。

2）培養基pH對HZL-3菌株產酶的影響。調節培養基pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。其他條件為溫度37 ℃，轉速140 r/min，接種量 4%，培養24 h后測酶濃度，測定方法同上。

3）培養時間對HZL-3菌株產酶的影響。將HZL-3菌分別培養8、10、16、24、36 h后測其酶濃度，其他條件為溫度37 ℃，pH 7，轉速140 r/min，接種量4%。測定方法同上。

4）接種量對HZL-3菌株產酶的影響。分別設置接種量比例為2%、4%、6%、8%、10%。其他條件固定為溫度37 ℃，轉速140 r/min，pH 7，培養24 h。測定方法同上。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

PCR產物送上海派森諾生物科技公司測序，得1 041 bp序列。將該序列于NCBI網站上進行Blast序列比對并用鄰接法構建進化樹，初步確定HZL-3菌株為凝結芽孢桿菌（圖1）。HZL-3菌株菌落較大，邊緣光滑，呈乳白色，為革蘭陽性菌。顯微鏡下菌體呈桿狀，具芽孢。HZL-3 菌株在28～40 ℃生長較好，對溫度具有較強的適應性，適宜pH 7.5。吲哚反應、接觸酶試驗、明膠液化試驗、MR試驗、檸檬酸鹽試驗均為陽性，VP試驗為陰性。

2.2 HZL-3菌株產酶試驗

用牛奶固體培養基和淀粉固體培養基經24 h培養后可見牛奶平板上出現明顯的透明圈，淀粉平板盧戈氏碘液覆蓋處出現明顯的水解圈，說明該菌能夠分泌產生蛋白酶和淀粉酶，屬于胞外酶。牛奶平板和淀粉平板的透明圈直徑分別為（2.9±0.2） mm和（5.8±0.3） mm。

2.3 HZL-3菌株產酶影響因素研究

2.3.1 標準曲線 根據上述方法，分別制作蛋白酶與淀粉酶的標準曲線，結果見圖2。

2.3.2 培養溫度對HZL-3菌株產酶的影響 影響微生物產酶能力，溫度是關鍵因素，培養24 h后測其蛋白酶與淀粉酶含量，結果如圖3所示，蛋白酶與淀粉酶的含量均自25 ℃開始呈持續上升趨勢，直至36 ℃時達最高，36～40 ℃呈下降趨勢，40 ℃時，酶含量最低，淀粉酶和蛋白酶36 ℃最高值分別高于40 ℃時的43%、32%，經t檢驗分析，均呈極顯著差異（Plt;0.01），其他溫度條件差異不大。

2.3.3 培養基pH對HZL-3菌株產酶的影響 不同微生物的生長繁殖及代謝物積累對pH的要求不同，本試驗24 h后測得酶濃度結果見圖4。由圖4可知，淀粉酶在pH 6.0時酶含量最高，偏酸性酶，后開始下降，pH 7.5時最低，只有最高值的28.7%，差異極顯著（Plt;0.01）;蛋白酶含量自pH 6.0時開始呈持續上升趨勢，pH 7.5時達最高值，后開始下降，偏弱堿性酶。在設計的pH范圍內，pH 6.0時蛋白酶含量最低，只有最高值的48.7%，差異極顯著（Plt;0.01）。

2.3.4 培養時間對HZL-3菌株產酶的影響 如圖5所示，淀粉酶自8 h培養至10 h，酶含量大幅度升高，10 h達到最高值，后開始持續下降，且下降幅度較大，36 h最低，只有最高值的17.5%，差異極顯著（P lt;0.01）;而蛋白酶含量自8 h開始呈持續上升趨勢，上升幅度較淀粉酶小，至16 h達最高值，后開始下降，36 h最低，只有最高值的35.8%，二者相比差異顯著（P lt;0.05）。

2.3.5 接種量對HZL-3菌株產酶的影響 接種量是指移入種子液的體積和接種后培養液體積的比例。接種量不同會影響微生物生長及代謝產物的積累，也可能對微生物產酶能力有所影響，如圖6所示，在接種量為4%時，淀粉酶含量最高，隨接種量逐步提高，產酶能力逐漸下降;而蛋白酶含量在6%時最高。后隨接種量逐步提高，產酶能力同樣逐漸下降。

3 討論

益生菌在水產養殖中能夠凈化水質、預防疾病、促進生長且安全、環保、無抗性，是抗生素的理想替代品，具有重要的研究價值和廣闊的應用前景。目前研究者認為芽孢桿菌是一種發展潛力很大的優良益生菌之一[9]。芽孢桿菌具有許多優點，具有芽孢，即它的休眠狀態，當其環境條件滿足不了它的生長要求時，會形成芽孢以度過不良環境，環境適宜時又可萌發成新的菌體;另外，芽孢桿菌的產酶活性強，有利于作用物的消化代謝[9]。凝結芽孢桿菌為芽孢桿菌屬，是最具潛力的益生菌之一，能產生多種酶類，還具有抗菌抑菌活性，不僅可以用于醫學、生產等領域，而且已經滲入到人類生活的各個方面。近年來越來越受到國內外學者廣泛的關注與研究[10-15]。以海洋生物酶為核心內容的生物技術在支持社會進步與經濟發展中的地位已被多個國家提到空前的戰略高度，成為開發新型酶的新源地[16]。海岸水虱生活環境及生活習性獨特，而關于海岸水虱消化道分離凝結芽孢桿菌的試驗未見報道。

試驗針對海岸水虱消化道微生物，采用傳統的微生物富集、分離純化方法，對海岸水虱消化道微生物進行分離鑒定，得到1株產酶能力較強的菌株，命名為HZL-3，利用分子生物學方法，初步確定為凝結芽孢桿菌，并研究該菌株產酶能力影響因素，采用ELISA法檢測HZL-3產蛋白酶、淀粉酶含量，并研究溫度、pH、培養時間、接種量等因素對產酶量的影響。結果顯示，HZL-3能夠產生蛋白酶和淀粉酶;溫度36 ℃，pH為7.5，培養16 h，接種量為6%，蛋白酶活性最高;溫度36 ℃，pH為6.0，培養10 h，接種量為4%，淀粉酶活性最高。HZL-3菌株在40 ℃時產酶能力明顯下降，菌體生長活力及生長速率下降嚴重，與李楊霞等[17]報道的嗜熱凝結芽孢桿菌最適生長溫度有很大差別，筆者認為存在種屬差異性。芽孢桿菌是益生菌的一種，與其他益生菌相比，芽孢桿菌具有其獨特的優勢，形成的內生孢子能耐受自然界及加工過程中的高溫、干燥和紫外線等不利因素，是益生菌菌種開發的重要來源。對于HZL-3菌株作為益生菌的耐酸、耐鹽及對飼料酶系的利用能力等特性有待進一步研究。

海岸水虱屬于雜食性動物，主要喜食海藻，偶爾攝食一些動物殘肢，清除海岸帶大型藻類碎屑和動物殘體，是潮間帶重要的生態系成員之一，常作為海濱污染指示生物[18]，由于獨特的生活環境及生活習性，其消化道共生微生物必然有其特殊性，本試驗結果旨在揭示海岸水虱消化道微生物一些特性，為開發其在水生動物健康養殖方面的潛在應用奠定基礎。

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