犬細小病毒CPV-JZ2021株的分離鑒定及遺傳進化分析

摘要：為研究犬細小病毒的生物學特性和遺傳進化情況，從湖北馨愛寵物醫院有限公司收集疑似病犬的糞便，無菌處理病料后接種貓腎細胞（CRFK）進行病毒的培養，至出現明顯的細胞病變。通過PCR擴增、電鏡形態學觀察、間接免疫熒光檢測、血凝試驗等進行病毒鑒定，結果表明，成功分離出一株犬細小病毒，并命名為CPV-JZ2021。該病毒的血凝效價為29，TCID50為103.4/0.1 mL。全基因組測序結果表明，該病毒全基因組序列長4 567 bp。構建的系統發育樹表明，該病毒與四川、河南、廣東和北京等地毒株親緣關系較近，處于同一進化分支。其中與河南株CPV-HN1587的同源性達99.2%。通過對VP2基因推斷的氨基酸序列進行分析，確定該犬細小病毒屬于New CPV-2a型。相比較國外已經報道的New CPV-2a型毒株，CPV-JZ2021存在多個關鍵氨基酸變異。該研究為犬細小病毒的流行情況及新疫苗的開發提供了參考依據。

關鍵詞：犬細小病毒;分離鑒定;遺傳進化

中圖分類號：S855.3 " " " " 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2022）03-0121-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2022.03.025 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Isolation and identification of canine parvovirus CPV-JZ2021 strain and it’s analysis of

genetic evolution

LI Jian1， WU Chu-jun2， YE Shi-yi1， CHEN Long-da3， XIONG Tao1

（1.College of Life Science， Yangtze University， Jingzhou "434000， Hubei， China;2.Hubei Xin-ai Pet Hospital Co. Ltd.， Jingzhou "434000，Hubei， China; 3.China Animal Health Supervision Office of Fengshun County， Guangdong Province， Meizhou "514300， Guangdong， China）

Abstract： In order to study the biological characteristics， and genetic evolution of canine parvovirus， the feces of suspected dogs were collected from Hubei Xin-ai Pet Hospital Co. Ltd.. After sterility treatment， CRFK cells were inoculated with virus culture until obvious cytopathic changes appeared. The virus was verified by PCR， electron microscopy morphological observation， indirect immunofluorescence test and hemagglutination test. The results showed that a canine parvovirus was successfully isolated and named CPV-JZ2021. The hemagglutination titer of the virus is 29， and the TCID50 is 103.4/0.1 mL. Whole-genome sequencing showed that the length of the whole-genome sequence was 4 567 bp. The phylogenetic tree showed that the isolated strain was closely related to strains from Sichuan， Henan， Guangdong and Beijing， and belonged to the same evolutionary branch. The homology with CPV-HN1587 is 99.2%. The canine parvovirus belongs to the New CPV-2a type according to amino acid sequence of the VP2 gene. Compared with the New CPV-2a strains that have been reported abroad， CPV-JZ2021 has many key amino acid variations. This study provides a reference for the prevalence of canine parvovirus and the development of new vaccines.

Key words： canine parvovirus; isolation and identification; genetic evolution

犬細小病毒（canine parvovirus，CPV）屬于細小病毒科細小病毒屬，是犬類疾病的重要病原之一[1]。犬細小病毒傳染性強，犬感染后發病率為100%，成年犬發病后病死率為10%，幼年犬則高達91%，感染犬通常表現為嚴重的急性腸胃炎，并伴有食欲下降、嘔吐、發燒和白細胞減少等臨床癥狀[2，3]。犬細小病毒全基因組通常包含2個開放閱讀框（ORF）以及一些較小的重疊基因，其中5′端ORF編碼非結構蛋白NS1和NS2，3′端ORF編碼結構蛋白VP1和VP2[4]。非結構蛋白NS1和NS2具有調控CPV基因表達的作用[5]。VP2蛋白是病毒主要的結構蛋白，具有抗原性和血凝活性，在誘導機體產生特異性抗體和決定病毒的宿主范圍方面起著重要作用[6，7]。1981年之后，犬細小病毒的VP2基因發生了抗原變異，CPV- 2a完全取代了于1978年首次發現的CPV-2[8]。同時由于犬細小病毒易于持續變異，在20世紀末，CPV-2b、New CPV-2a、New CPV-2b等變異體相繼在全世界被發現[9]。在2000年，新的變異株CPV-2c首次發現于意大利[10]。由于CPV抗原型多且變異速度快，現有的CPV疫苗不能對犬只提供完全的免疫保護。因此，進一步探究當前分離鑒定的CPV流行株的遺傳變異特性，以期為制備有效的CPV疫苗提供理論依據。

本研究從湖北馨愛寵物醫院有限公司提供的疑似病犬的糞便中分離到1株疑似犬細小病毒，對該毒株進行分離鑒定，命名為CPV-JZ2021株，并對該病毒的全基因序列進行測定，解析其遺傳、變異、進化規律及流行特征，可為該地區犬細小病毒的預防、治療及疫苗研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞及病料

細胞：CRFK細胞，由長江大學生物醫藥研究所提供。

病料：湖北馨愛寵物醫院有限公司提供的疑似病犬的糞便。

1.2 主要試劑

胎牛血清，DMEM培養基和胰酶均購自Gibco公司，0.01 mol/L pH 7.4 PBST 購自HyClone公司，Taq PCR StarMix和DNA Marker購自GenStar公司，M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix購自北京聚合美生物科技有限公司，DNA提取試劑盒購自Solarbio公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 病料處理

加入PBS溶液浸泡病料樣品并研磨，反復凍融3次。6 000 r/min離心20 min，收集上清液。用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，按1∶1 000的比例加入青霉素-鏈霉素雙抗溶液，-20 ℃保存備用。

1.4 病毒分離

采用同步接毒法，在CRFK細胞消化傳代后，按培養液量的1/10接入處理過的病料樣品，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養，同時設正常細胞對照。第2天換上細胞維持液，連續培養3～5 d，觀察細胞病變，待細胞病變達到80%以上時，反復凍融3次后收集病毒上清液，-20 ℃保存備用。收集的病毒懸液按上述方法連續傳代。

1.5 PCR鑒定

取500 μL病毒液作為樣品，使用病毒DNA提取試劑盒提取病毒組DNA。參考GenBank上已登錄的犬細小病毒（登錄號為：JQ268284.1）基因組保守區，應用Primer Premier 5.0設計1對鑒定引物，上游5′-ACCGTTACTGACATTCGC-3′，下游5′-ACAAC CAACATTACCCAC-3′。理論擴增片段長度為 " " " "1 327 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴增體系10 μL：模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，qPCR Mix 5 μL，ddH2O 3 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30個循環;72 ℃終延伸8 min。反應結束后進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 形態學鑒定

收集第6代病毒懸液，12 000 r/min離心10 min，取上清用 2%磷鎢酸負染，在透射電子顯微鏡下觀察病毒形態。

1.7 病毒含量測定

CRFK細胞長滿單層后，用0.25%胰蛋白酶溶液消化，以50%的細胞密度鋪96孔細胞培養板，將第6代病毒液在無血清DMEM中10倍倍比稀釋第11個稀釋度，并設置CRFK細胞空白對照。按每個稀釋度每孔100 μL的量同步接入96孔板中，每個稀釋度做8個重復，于37 ℃ 5% CO2培養箱中培養3～5 d，記錄細胞狀態及病變情況，并按照Reed Muench法計算病毒含量。

1.8 血凝試驗

準備1個96孔微量血凝板、1%新配制的豬紅細胞懸液、PBS（pH 7.2）和待檢病毒液。每孔加入50 μL PBS，然后第1孔加入50 μL病毒懸液，依次倍比稀釋至11孔，最后每孔加入50 μL 1%豬紅細胞懸液，試驗組和對照組各做2組重復，4 ℃靜置1 h后，觀察凝集情況并記錄。

1.9 間接免疫熒光試驗

在12孔細胞培養板上接種 CRFK細胞，同步接種一定量第6代病毒懸液，同時設未接種病毒的正常CRFK細胞作為陰性對照。48 h后細胞出現CPE，棄去培養液，用0.01 mol/L pH 7.4 PBST洗滌3次，每次5 min，用4%多聚甲醛固定液37 ℃固定20 min;PBST洗滌，加入PBST稀釋至一定濃度的CPV單抗，37 ℃孵育45 min;PBST洗滌，加入PBST稀釋至適當濃度的FITC標記山羊抗小鼠，37 ℃孵育45 min;PBST洗滌，清洗后上熒光顯微鏡觀察。

1.10 全基因組測序

參考GenBank上已登錄的犬細小病毒（登錄號為：JQ268284.1）全基因組序列，應用Primer Premier 5.0設計全基因組擴增引物（表1）。PCR擴增體系20 μL：模板2 μL，上、下游引物各1 μL，高保真Taq酶Mix 10 μL，ddH2O 6 μL。PCR擴增程序同上。膠回收PCR產物，將膠回收的產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.11 病毒基因組的遺傳進化分析

將測序的結果利用DNAStar 7.1.0軟件包中的Editseq和SeqMan程序進行校正和拼接，得到的全基因組序列與GenBank數據庫中的CPV參考毒株進行比對，并使用MAGEX構建系統發育樹，使用DNAStar 7.1.0軟件包中的MegAlign程序進行同源性分析。

1.12 VP2基因的氨基酸序列的比對

截取全基因序列中的VP2基因序列，使用DNAStar 7.1.0軟件包中的MegAlign程序對CPV-JZ2021的VP2基因與參考毒株的VP2基因進行氨基酸序列比對，分析關鍵氨基酸位點的變異情況，以確立新發現病毒株的分型。

2 結果與分析

2.1 病毒分離

將處理后的病毒懸液無菌接種到CRFK細胞后，采用同步接毒的方法接種到CRFK盲傳至第三代96 h后出現明顯的細胞病變，表現為細胞間隙變大，形態呈拉絲狀，而對照組細胞生長良好，形態正常，未出現細胞病變（圖1）。

2.2 PCR鑒定

對鑒定引物擴增的DNA片段進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示與目的片段長度一致，為 1 327 bp（圖2）。

2.3 電鏡形態學鑒定

將第6代細胞培養物濃縮，經磷鎢酸負染后，在生物透射電子顯微鏡下觀察，病毒粒子呈六邊形，無囊膜，直徑為20 nm左右（圖3）。

2.4 病毒含量測定

以第5天的觀察結果為標準，按照Reed-Muench法計算，得出第6代病毒的TCID50為103.4/0.1 mL。

2.5 血凝試驗

將96孔血凝板4 ℃靜置1 h后觀察結果，測得第6代病毒液的血凝效價為 1∶29（圖 4）。

2.6 間接免疫熒光試驗

接毒48 h，CRFK細胞在熒光顯微鏡下呈現明顯的綠色熒光，而正常細胞在熒光顯微鏡下未出現明顯的綠色熒光（圖5）。

2.7 病毒全基因序列的測定

采用5對引物對提取的病毒DNA進行擴增，得到片段長度分別為991、702、1 387、1 634、1 055 bp的目的基因，與預期片段大小相符（圖6），經過克隆測序后，利用DNAStar對測序正確的結果進行拼接，得到長度為4 567 bp的全基因組序列。

2.8 病毒基因組的遺傳進化分析

將全基因組與數據庫中的28個CPV參考毒株的全基因組利用Neighbor- Joining法序列比對后構建系統發育樹，發現CPV-JZ2021的全基因組與CPV-HN1587（MF467233.1）New cpv-2b Henan株、Canine/China/21/2017（MH476590.1）New cpv-2a Sichuan株親緣較近，處于同一進化分支（圖7），基因序列的同源性分別為99.2%、98.3%（圖8）。

2.9 VP2基因氨基酸序列的比較

對分離株的VP2氨基酸序列進行分析，確定CPV-JZ2021為New CPV-2a型。將VP2的氨基酸序列與其他23個CPV 參考株的VP2氨基酸序列進行比對，結果（表2）顯示，與意大利（CPV_IZSSI_29451_09）和韓國（Pome）同型參考毒株相比，CPV-JZ2021發生了 267（Phe→Tyr）、324（Tyr→Ile）變異;與其他同型參考株相比，關鍵氨基酸位點均無變化;與美國（CPV-15）cpv-2a型參考毒株相比，發生了267（Phe→Tyr）、297（Ser→Ala）、324（Tyr→Ile）、440（Thr→Ala）、555（Ile→Val）變異。

3 小結與討論

本研究從湖北馨愛寵物醫院有限公司疑似病犬的糞便中分離到1株病毒，通過CRFK細胞的培養、電鏡形態學觀察、PCR鑒定、血凝試驗等方法分離的毒株為犬細小病毒，并命名為CPV-JZ2021，該病毒基因組全長4 567 bp。遺傳進化樹顯示，CPV-JZ2021與國外的毒株親緣性關系較遠，與國內的四川、河南、廣東、北京毒株親緣較近，處于同一進化分支上。其中，與河南株、四川株的同源性分別高達99.2%、98.3%。同時，CPV-JZ2021沒有與湖北毒株（HB2017）處在同一個進化分支，說明湖北省沒有固定和獨立的CPV分支，這與湖北省處于中國地理的中部，交通四通八達有關。有報道指出犬細小病毒雖是DNA病毒，其基因進化速率和RNA病毒卻很相似[11]。自1978年犬細小病毒首次被分離以來，犬細小病毒在世界廣泛傳播并發生了多次基因變異，產生了3種主要的抗原變異型CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c，其中CPV-2a和CPV-2b主要在一些亞洲國家流行，CPV-2c主要分布于歐美[12]。近年來研究發現，新的變異型New CPV-2a和New CPV-2b在世界各地開始出現[13]。

根據VP2基因氨基酸序列分析表明，CV-JZ2021的分型為New CPV-2a。同時CPV-JZ2021株、北京株、廣東株、吉林株、四川株等毒株基因型表明，新型變異型New CPV-2a和New CPV-2b已廣泛于中國各地傳播，并有成為主要毒株類型的趨勢。而新型變異株和原有變異株主要差異就在于VP2的297位氨基酸（Ser297Ala）發生了改變[14]。通過VP2氨基酸序列對比，CPV-JZ2021與同為New CPV-2a型的意大利和韓國株比較，267位氨基酸和324位氨基酸處發生了變化，分別為Tyr→Phe和Ile→Tyr;而與同為New CPV-2a型國內的北京、廣東、廣西、上海、四川毒株比較，氨基酸序列沒有變化。說明New CPV-2a型國內外還是具有一定差異性的，這可能和犬細小病毒遺傳進化和致病性有關。有研究表明第324位點在衣殼蛋白GH環上，該環上的氨基酸大部分出現在病毒粒子的外表面，所以該位點的替換可能不會影響病毒的抗原性，而在傳播和感染發揮重要作用，從而影響宿主的范圍[15]。由于犬細小病毒變異速度快，宿主范圍不斷擴大[16]，且以寵物行業為首的養犬行業高速發展，疫苗保護作用下降，發病率升高，從而導致中國養犬業的發展受到制約[17]。因此，對犬細小病毒遺傳進化的研究對犬細小病毒防控和新疫苗的研發具有重要意義。

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