基于網(wǎng)絡藥理學方法探討玉屏風散治療慢性阻塞性肺疾病的分子機制研究

陳明輝，王瓊萍，蔣慧，馬少欣

中國科學院大學深圳醫(yī)院(光明)呼吸與危重癥醫(yī)學科，廣東深圳 518106

慢性阻塞性肺疾病（COPD）的生理病理特征之一為出現(xiàn)分泌過量的氣道黏液，可引發(fā)細菌定植、氣體交換下降、通風灌注錯配、氣流受限、氣道阻塞，進而出現(xiàn)肺功能進展性下降[1]。分泌過高的氣道黏液與黏液蛋白/水鹽比例紊亂密切相關，其中水通道蛋白5（AQP5）負責轉運肺泡內(nèi)水及調(diào)節(jié)黏蛋白/水鹽比例，而黏蛋白5（MUC5AC）決定了黏液的黏度。 研究發(fā)現(xiàn)，慢性阻塞性肺疾病的AQP5 表達明顯下降，而MUC5AC 的表達則增高顯著[2]。 現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，玉屏風散中藥有效成分可促進氣管液體分泌量增高，促進排出痰液。該研究通過觀察基于網(wǎng)絡藥理學方法分析慢性阻塞性肺疾病予以玉屏風散治療的分子機制研究，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

廣州中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供70 只SD健康大鼠 （生產(chǎn)許可號：SCXK （粵）2013-0034），12周鼠齡，體質(zhì)量（200±20）g，無特定病原體級實驗動物， 實驗前予以7 d 適應性喂養(yǎng)， 保持實驗濕度為60%，實驗溫度為20°C；實驗動物分組：分為7 組、玉屏風中藥低、中、高劑量組、潑尼松組、模型組、正常對照組，低劑量為臨床等效劑量，根據(jù)動物體表等效劑量換算法，計算小鼠給藥劑量及總的用藥量，高、中、低劑量給藥量分別約為：0.65 g/mL、0.325 g/mL、0.162 5 g/mL，2 mL/d。 潑尼松聯(lián)合玉屏風散中藥中劑量組，每組10 只，雌雄各半。

1.2 主要藥品與試劑

①美國Sigma 公司提供的脂多糖， 與生理鹽水配制濃度為1 mg/mL。 ②玉屏風散水煎劑:玉屏風散藥材由中國科學院大學深圳醫(yī)院（光明） 中藥房提供，為《中國藥典》所載合格品種。稱取防風、炒白術均為60 g，180 g 黃芪，碾碎防風，白術、黃芪和防風藥渣均加入8 倍量水，予以30 min 浸泡，兩次煎煮；第1 次煎煮時間為1.5 h，第2 次為1 h，藥液混合，過濾；藥渣加入70%乙醇形成沉淀，上清液采集，乙醇減壓回收，攪拌加水，靜置；濾過上清液，水浴70～80°C，防風揮發(fā)油加入，混勻，4°C 置存。 實驗時稀釋成生藥濃度0.65 g/mL、0.325 g/mL、0.162 5 g/mL。 ③潑尼松片。④自制密閉造模箱：大小50 cm×50 cm×50 cm，木質(zhì)箱體。

1.3 方法

篩選有效成分：①利用網(wǎng)絡藥理學數(shù)據(jù)庫，收集玉屏風散的全部化學成分。 ②利用網(wǎng)絡-藥物-靶點分析， 尋找玉屏風散的化學成分和水通道蛋白的靶基因的調(diào)節(jié)通道。 ③利用UniPOT 和CTD 等數(shù)據(jù)庫尋找基因-疾病的對應關系，通過系統(tǒng)篩選出與本項目研究的相關靶基因與靶蛋白及相關炎癥介質(zhì)。 ④通過計算機SYBYL 軟件，進一步優(yōu)化、過濾、構象玉屏風散的全部分子，并計算出靶點蛋白的配體，利用藥物-蛋白配體分析出全部分子與靶點蛋白的關系，計算出相關通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)關系， 篩選出最有可能具有藥理活性的有效成分。

COPD 動物模型建立。 ①造模方法：COPD 肺虛型模型建立方法為脂多糖氣管內(nèi)滴注， 同時予以香煙吸熏法。 ②給藥： 大鼠從造模當天起每天灌胃給藥。 正常對照組及模型組2 mL/d 生理鹽水灌胃，玉屏風組:玉屏風組高、中、低劑量組分別給予每天予2 mL生藥濃度0.65 g/mL、0.325 g/mL、0.162 5 g/mL 的玉屏風湯劑灌胃，潑尼松組：灌胃2 mL 生理鹽水，3.15 mg/kg 潑尼松片； 與玉屏風散中藥劑量組聯(lián)用：潑尼松（3.15 mg/kg）溶于2 mL 中劑量組玉屏風散湯劑灌胃；用藥時間共3 個月。

樣本采集及指標觀察：①大鼠的動態(tài)觀測：實驗期間，認真觀察各組大鼠的呼吸（有無咳嗽、氣急、喘鳴等）。動態(tài)觀察各組大鼠的體質(zhì)量變化。②HE 肺組織檢測玉屏風散中藥的有效成分對COPD 肺組織結構的影響。③Western Blot 檢測玉屏風散中藥的有效成分對COPD 體內(nèi)中AQP5-MUC5AC 蛋白表達的影響。Western blot 方法監(jiān)測：剪碎組織100 mg，核裂解緩沖液A400 mL 內(nèi)，研磨，15 000 g，4°C，0°C 渦旋10 min， 胞漿蛋白為上清液；50 μl 冷的核裂解緩沖液B 中，0℃渦旋30 min，4℃，15 000 g 離心10 min，上清液采集，-80°C 置存。 ④RT-PCR 檢測玉屏風散中藥的有效成分對COPD 體內(nèi)中AQP5-MUC5AC mRNA 表達的影響：采用Trizol 提取肺組織總RNA，測定A260 和A280 處的OD 值， 判斷RNA 的純度和定量。 將RNA 逆轉錄為cDNA：RNA 樣品冰上解凍；DEPC 水18 μl 稀釋RNA 樣品2 μl；檢測前重新上機定量RNA 濃度；PCR 擴增反應。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)。 計量資料符合正態(tài)分布，以（±s）表示，組間差異比較以t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Western Blot 檢 測 肺 組 織 中AQP5、MUC5AC蛋白的表達

除正常對照組外， 潑尼松聯(lián)合玉屏風中劑量組的AQP5 蛋白指標明顯高于其他各組， 差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）； 玉屏風散組隨著劑量的增加，AQP5 蛋白含量逐漸增高， 差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）；除正常對照組外，潑尼松聯(lián)合玉屏風中劑量組的MUC5AC 蛋白指標明顯低于其他各組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；玉屏風散組隨著劑量的增加，MUC5AC 蛋白含量逐漸減低， 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 Western Blot 檢測肺組織中AQP5、MUC5AC 蛋白的表達（±s）

表1 Western Blot 檢測肺組織中AQP5、MUC5AC 蛋白的表達（±s）

注：a 為與潑尼松聯(lián)合玉屏風中劑量組相比，b 為與玉屏風高劑量組相比，P<0.05

組別AQP5 蛋白 MUC5AC 蛋白玉屏風高劑量組（n=10）玉屏風中劑量組（n=10）玉屏風低劑量組（n=10）模型組（n=10）正常對照組（n=10）潑尼松組（n=10）潑尼松聯(lián)合玉屏風中劑量組（n=10）（0.42±0.10）a（0.31±0.08）ab（0.28±0.06）ab（0.17±0.01）a 0.63±0.18（0.25±0.02）a 0.59±0.16（0.31±0.07）a（0.43±0.08）ab（0.52±0.11）ab（0.63±0.16）a 0.25±0.04（0.60±0.13）a（0.27±0.05）a

2.2 RT-PCR 法檢測肺組織中AQP5、MUC5AC mRNA 的表達

除正常對照組外， 潑尼松聯(lián)合玉屏風中劑量組的AQP5 mRNA 指標明顯高于其他各組， 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）； 玉屏風散組隨著劑量的增加，AQP5 mRNA 逐漸增高， 差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）；除正常對照組外，潑尼松聯(lián)合玉屏風中劑量組的MUC5ACmRNA 指標明顯低于其他各組， 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；玉屏風散組隨著劑量的增加，MUC5ACmRNA 逐漸減低， 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 RT-PCR 法檢測肺組織中AQP5、MUC5AC mRNA 的表達（±s）

表2 RT-PCR 法檢測肺組織中AQP5、MUC5AC mRNA 的表達（±s）

注：a 為與潑尼松聯(lián)合玉屏風中劑量組相比，b 為與玉屏風高劑量組相比，P＜0.05

組別AQP5 mRNA MUC5AC mRNA玉屏風高劑量組（n=10）玉屏風中劑量組（n=10）玉屏風低劑量組（n=10）模型組（n=10）正常對照組（n=10）潑尼松組（n=10）潑尼松聯(lián)合玉屏風中劑量組（n=10）（2.42±0.11）a（2.33±0.07）ab（2.26±0.05）ab（1.23±0.01）a 2.53±0.21（1.25±0.02）a 2.48±0.19（1.32±0.07）a（1.45±0.09）ab（1.52±0.12）ab（2.72±0.19）a 1.23±0.02（1.63±0.14）a（1.25±0.03）a

3 討論

該研究觀察基于網(wǎng)絡藥理學方法分析慢性阻塞性肺疾病予以玉屏風散治療的分子機制研究， 結果顯示：除正常對照組外，潑尼松聯(lián)合玉屏風中劑量組的AQP5 蛋白、mRNA 明顯高于其他各組（P＜0.05）；玉屏風散組隨著劑量的增加，AQP5 蛋白、mRNA 逐漸增高（P＜0.05）；除正常對照組外，潑尼松聯(lián)合玉屏風中劑量組的MUC5AC 蛋白 （0.27±0.05）、mRNA（1.25±0.03）指標明顯低于其他各組（P＜0.05）；玉屏風散組隨著劑量的增加，MUC5AC 蛋白、mRNA 含量逐漸減低（P＜0.05），與鄧秀娟等[3]的研究結果大體一致， 在其研究中， 聯(lián)合組MUC5AC 蛋白為 （0.22±0.04） 低于其他各組。 該研究基于網(wǎng)絡藥理學數(shù)據(jù)庫、 基于利用網(wǎng)絡-藥物-靶點分析、 通過計算機SYBYL 軟件，進一步優(yōu)化、過濾、構象玉屏風散的全部分子，并計算出靶點蛋白的配體，利用藥物-蛋白配體分析出全部分子與靶點蛋白的關系， 計算出相關通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)關系， 篩選出最有可能具有藥理活性的有效成分[4-6]。 玉屏風散主要治療風邪襲表，衛(wèi)外不固，其中白術益氣健脾，佐以防風散風邪，黃芪則止汗固表， 補脾肺之氣；AQP5 具有傳代、培養(yǎng)速度快、高穩(wěn)定性，可分泌合成黏液等特征，廣泛應用于氣道高分泌黏液體外研究中[7-9]。 研究發(fā)現(xiàn)，COPD 中的AQP5 蛋白指標明顯下降， 而MUC5AC蛋白指標異常增殖， 經(jīng)玉屏風散干預治療后，AQP5蛋白顯著增高，而MUC5AC 蛋白則明顯增高，說明COPD 經(jīng)玉屏風散干預治療后可對MUC5AC 的表達進行抑制，同時促進大鼠肺組織AQP5 的表達[10-15]。

綜上所述， 慢性阻塞性肺疾病進行玉屏風散治療，可促使肺組織中的AQP5 蛋白增高，而MUC5AC蛋白水平下降，糾正黏蛋白/水鹽比例紊亂是其治療COPD 的分子機制。