基于人群大隊列探索心腦血管疾病相關血漿代謝組學特征

張夢吉，黃 琳，李 崢，馬卓然，魏 霖，袁安彩，胡劉華，張 薇，錢 昆，2，3，卜 軍

1.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院心內科，上海 200127；2.上海交通大學生物醫學工程學院，上海 200030；3.上海交通大學醫療機器人研究院，上海 200240；4.上海市胸科醫院/上海交通大學醫學院附屬胸科醫院檢驗科，上海 200030

據國家心血管病中心［1］估計，心腦血管疾病占我國居民總死亡原因的首位。目前我國心血管疾病患者約3.3 億，且由于飲食不健康、運動不足、飲酒、吸煙等危險因素呈現普遍化態勢，我國患有心血管疾病的人數仍在持續升高。因此，研究心腦血管疾病發病的分子機制對降低心腦血管疾病相關死亡率具有重要意義。分子組學為心腦血管疾病發病機制研究提供了新的契機，有助于闡明機制并尋找新的藥物作用靶點；其中代謝組研究可以通過對代謝物及其差異調控代謝通路展開分析，探尋心腦血管疾病及其危險因素相關的代謝生物標志物（以下簡稱為標志物）。從代謝角度闡釋心腦血管疾病發病造成的代謝途徑改變有助于實現疾病管理，從而降低心腦血管疾病風險，減輕心腦血管疾病負擔。

心腦血管疾病涉及多因素參與的復雜病理過程，基于單一代謝標志物難以實現疾病分子圖景的精準描述，通過代謝指紋相關作用關系有助于疾病整體分析。本研究依托于科技部重大慢性非傳染性疾病防控專項“心腦血管疾病協防共管創新管理模式的開發和應用”，基于課題組建立的上海市浦東新區自然人群隊列（臨床試驗號NCT04517513），用于建立基于大數據平臺的心腦血管疾病風險預測新模型。本研究重點關注心腦血管疾病相關的高危人群。研究通過納米材料增強激光解吸電離質譜技術（nano-enhanced laser desorption ionization-mass spectrometry，NELDⅠ-MS）提取約14 000 例血漿代謝指紋圖譜（plasma metabolic fingerprints，PMFs），并利用統計分析方法確定了與對照組相比，冠心病（coronary heart disease，CHD）單患組、腦卒中單患組、心腦血管疾病共患組（冠心病+腦卒中）中具有顯著差異性調控的6 個代謝標志物，有望對心腦血管疾病發病機制提供代謝層面線索。

1 對象與方法

1.1 對列人群與樣本收集

本研究隊列人群納入標準：①年齡≥35 歲。②上海戶籍居民或在上海居住5年以上并參加上海市社會保障的人群。③無嚴重肢體殘疾、可以正常溝通的人群。排除標準：①臨時居民和流動人口。②不愿接受項目后續檢查的人群。③病史采集不全、血樣不合格的人群。2019 年2—8 月期間，共納入14 419 例隊列成員，根據以下標準分為4 組：對照組為自述無冠心病、無腦卒中病史的，共12 205例；腦卒中單患組為自述無冠心病、有腦卒中病史的患者，共461 例；冠心病組為自述有冠心病、無腦卒中病史的患者，共1 608 例；心腦血管疾病共患組為自述同時有冠心病、腦卒中病史的患者，共145 例。收集隊列成員的體檢資料作為基線資料，包括性別、年齡、身高、體質量、體脂率，是否有高血壓、糖尿病、高脂血癥。研究嚴格遵循《赫爾辛基宣言》，并獲得了上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院和上海交通大學生物醫學工程學院倫理委員會的批準（KY2019-101）。所有對象均簽署了知情同意書。

血漿采集按照標準流程，使用5 mL 的EDTA 抗凝分離管采集隊列成員的空腹血4～5 mL。所有血樣都通過靜脈穿刺抽取獲得，并在室溫下靜置40 min至血液凝固。在5 100×g轉速下離心10 min 獲得血漿樣品。離心后棄去沉淀，將血漿樣本立即保存在-80°C的環境中。

1.2 試劑與儀器

葡萄糖（99.5%）、絲氨酸（99%）、組氨酸（99%）、氯化鈉（99.5%）和牛血清白蛋白（98%）購自美國密蘇里州圣路易斯的Sigma-Aldrich 公司。上述試劑將被用于質譜譜峰校準。氯化鉀（99.5%）購自國藥化學試劑北京有限公司。實驗中使用的所有水溶液均由去離子水配制而成，純水儀購自法國莫爾塞姆的Millipore 公司。AutoFlex TOF/TOF 質譜儀購自德國的布魯克公司，其內置配有激發波長在355 nm的Nd：YAG激光器。

1.3 NELDI-MS實驗

1.3.1 樣品制備 取10 μL血漿樣品加入適量有機溶劑以進行蛋白沉淀，后點樣于微陣列靶板。待干燥后，將1 μL的鐵納米顆粒分散液（1 mg/mL）覆蓋在干燥后的斑點上，以作為后續質譜檢測的增強基質。此方法系根據前期研究報道［2-4］而展開。標準品混合液由前述試劑組成，其濃度均設置為1 mg/mL。

1.3.2 質譜數據采集 將干燥后的血漿-基質共結晶樣品送至AutoFlex TOF/TOF 質譜儀內，以標準品混合液進行質譜校準，同時在反射模式下進行PMFs 采集和分析。檢測質荷比（mass-to-charge ratio，m/z）范圍100～1 000。采集時設置儀器參數分別為離子源加速電壓20 kV，激光發射次數2 000 次，脈沖頻率1 000 Hz，延遲時間優化為200 ns。所有質譜譜圖均在正離子模式下采集。

1.4 質譜數據處理

對原始質譜數據的預處理采用Python 3.7 軟件，主要包括譜峰平滑、譜峰重采樣、基線校正和峰提取4 個步驟。譜峰平滑：采用高斯濾波對原始質譜譜圖進行平滑，以去除背景噪聲。譜峰重采樣：采用數據分箱，降低原始質譜譜圖的復雜度。基線校正：采用數學形態學方法去除背景基線。峰提取：采用檢測譜圖的局部極大值，提取信號峰。

1.5 統計學方法

采用Python 3.7 對數據進行統計學分析。定量資料采用單因素方差分析進行多組組間差異檢驗；采用Shapiro-Wilk test 進行正態性檢驗，若數據符合正態分布，則用±s表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗；若不符合正態分布，則用M（最小值～最大值）表示，2 組間比較采用Wilcoxon rank-sum 檢驗。定性資料用n（%）表示，采用χ2檢驗進行分析。檢驗水平均為α=0.05。質譜數據分析過程包含代謝峰顯著性篩選（依據P≤0.05 準則）以及質譜信號強度篩選，其中顯著性篩選依據上述統計檢驗完成，質譜信號強度篩選設置納入閾值為質譜譜峰相對強度＞1‰。協變量分析基于Logistic 回歸計算加入協變量前后自變量的比值比（odds ratio，OR）變化。其中，OR定義為Logistic回歸式中自變量系數的自然指數。

1.6 代謝通路分析

根據模型篩選特征m/z值，通過精準分子量比對、 數據庫檢索（human metabolome database，https：//hmdb.ca）鑒定相關代謝標志物。進一步通過MetaboAnalyst （http：//www.metaboanalyst.ca/） 中的通路拓撲分析研究潛在改變的代謝途徑。

2 結果

2.1 隊列人群的基線特征

隊列人群的基線特征如表1 所示，各組在性別、年齡、身高、體脂率及是否存在高血壓、糖尿病、高脂血癥疾病上的差異，具有統計學意義（均P＜0.05）；在體質量上的差異，不具有統計學意義（P=0.206）。

2.2 PMFs分析

圖1 為經NELDⅠ-MS 提取的隊列人群血漿原始代謝質譜譜圖（m/z為100～500），不同人群的典型質譜圖顯示了一定差異，特別是m/z為100～300。經數據預處理后，共提取到345 個代謝信號峰，并將此峰作為PMFs用于后續數據分析。

圖1 心腦血管疾病的血漿質譜圖Fig 1 Typical mass spectra of cardiovascular and cerebrovascular diseases

2.3 心腦血管疾病相關特征代謝標志物篩選

首先利用方差分析進行多組間差異檢驗分析，依據P≤0.05 準則，在345 個代謝峰中篩選得到85 個在多組間具有顯著性差異的代謝峰。其次再依據相對質譜信號強度大于1‰、兩兩比較t檢驗顯著性P≤0.05的準則，篩選出6 個m/z變量作為差異代謝標志物。通過Human Metabolome Database 數據庫搜索及精確一級分子質量比對，對篩選得到的特征m/z變量進行了初步的物質指認。最終確定的差異調控代謝物分別為氨基磺酸（m/z：119.95［M+Na］+）、乙酰乙酸（m/z：124.95［M+Na］+）、甲基丙二酸（m/z：140.95［M+Na］+）、葡萄糖（m/z：202.95［M+Na］+）、半乳糖醛酸（m/z：217.05［M+Na］+）、α-亞麻酸（m/z：301.25［M+Na］+）。另外，由于在本研究隊列中，年齡、體脂率、身高等基線指標在多組統計分析中具有顯著性差異（表1），且本研究隊列人群年齡集中分布［95%置信區間（confidence interval，CI）］在59～81歲，臨床上該年齡段人群常伴有血糖、血脂代謝異常等其他相關代謝疾病。為進一步研究臨床基線和其他代謝疾病對篩選得到的心腦血管標志物的影響，我們將年齡、身高、體脂率這3種臨床基線指標和高血壓、糖尿病、高脂血癥這3種疾病作為協變量納入回歸分析。由表2可見，代謝標志物的OR在加入各協變量前后幾乎無變化，證明上述臨床基線指標和代謝疾病與本研究篩選出的6個代謝標志物關聯較小。

表1 隊列人群的基線特征Tab 1 Baseline characteristics of the study cohort

表2 臨床基線指標和代謝疾病對標志物影響的評估Tab 2 Assessment of clinical baseline indicators and comorbidity metabolic diseases impact on selected biomarkers

上述代謝物在隊列人群中顯示出2 種不同的集群趨勢（圖2A），證明了經篩選得到的差異代謝物可能作為提示心腦血管疾病發生發展相關的潛在代謝標志物。進一步地，6 個差異代謝物可以歸為“酮體代謝因子”“脂肪酸代謝因子”2 大集群。“酮體代謝因子”集群中，冠心病單患組血漿中氨基磺酸、乙酰乙酸、甲基丙二酸的強度顯著增加，而在腦卒中單患組、心腦血管共患組中三者顯著下降（圖2B）；其中，冠心病單患組、心腦血管共患組的氨基磺酸變化差異最大（下調10.36%）。“脂肪酸代謝因子”集群中，冠心病單患組、心腦血管共患組中葡萄糖、半乳糖醛酸、α-亞麻酸的強度顯著降低，而在腦卒中單患組中三者顯著增加（圖2C）。

圖2 篩選出的代謝標志物Fig 2 Screened metabolic biomarkers

2.4 差異代謝通路分析

依據以上鑒定出的代謝標志物，按照P＜0.05 篩選出相關的代謝通路。對心腦血管共患組、腦卒中單患組、對照組、冠心病單患組中呈遞增趨勢的氨基磺酸、乙酰乙酸、甲基丙二酸，鑒定出3 種相關代謝通路（圖3A），分別為：①代謝分解始于肌肉細胞，同ATP 合成密切相關的纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸的降解通路（P=0.000）。②同心臟和大腦供能密切相關的酮體合成與降解通路（P=0.006）。③同酮體合成、短鏈脂質合成、檸檬酸循環、糖酵解、谷氨酸合成密切相關的丁酸甲酯代謝通路（P=0.019）。對心腦血管共患組、冠心病單患組、對照組、腦卒中單患組中呈遞增趨勢的葡萄糖、半乳糖醛酸、α-亞麻酸，鑒定出2 種相關代謝通路（圖3B），分別為：①同不飽和脂肪酸合成密切相關的亞麻酸代謝通路（P=0.024）。②同葡萄糖分解、ATP 合成密切相關的糖酵解通路/非碳水化合物碳底物合成葡萄糖密切相關的糖異生通路（P=0.049）。

圖3 代謝通路分析Fig 3 Metabolic pathway analysis

3 討論

本研究探討了新型NELDⅠ-MS快速提取心腦血管疾病大隊列人群PMFs 的可能性。代謝分析的研究工具主要為核磁共振技術和質譜技術。受制于只能鑒定原子種類，核磁共振在臨床生物樣本代謝分析的物質鑒定受到掣肘［5］。而現行主流液相/氣相質譜技術中嚴格的樣本預處理步驟，如色譜的樣本衍生化和純化［6-7］，導致其分析速度慢（0.25～1.5 h/樣本）、樣本消耗量大（20～400 μL/樣本）、通量低（≈100 個樣本/d），不利于大隊列代謝分析。基于無機納米材料的尺寸選擇效應及表面化學選擇性，我們課題組前期開發了NELDⅠ-MS，采集了如血清、尿液、血漿等生物體液樣本的PMFs［3-4，8-10］。通過該技術，實現了快速（1 min內完成檢測）、高通量（日均檢測約1 500個樣本）、低消耗（僅需1 μL 血漿樣本）的代謝指紋采集。相關代謝指紋具有高維度的數據空間特點（單樣本可提取345 個代謝信號峰），基于NELDⅠ-MS 有望實現大隊列代謝分析，可用于后續挖掘PMFs 與心腦血管疾病間的內在聯系，為臨床決策支持提供精準、個性化的指導意見。

分子組學為心腦血管疾病發病機制研究提供了新的契機，有助于闡明機制并尋找新的藥物作用靶點，其中主要包括基因組學、蛋白組學以及代謝組學等。在基因層面，鑒于大多數心血管疾病已被證實與遺傳高度相關，相關研究主要集中在遺傳相關基因以及特定DNA 序列變異［11-12］。如LACAZE 等［13］對25 個遺傳性心血管疾病的基因進行靶向測序，發現變異KCNQ1和SCN5A同心臟驟停相關。在蛋白層面，以定義新潛在標志物為目標的蛋白質組學已取得顯著進展，研究［14］發現了同心腦血管疾病相關的蛋白標志物在炎癥、傷口愈合、蛋白水解、胞外基質組織中起重要作用。在代謝層面，代謝組研究通過對代謝物及其差異調控代謝通路展開分析，確定同心腦血管疾病或危險因素相關的代謝標志物。代謝組測量生物通路中的下游產物，發現其作為基因調控和蛋白表達的結果與疾病表型關系密切。如KHAN 等［15］在400 例隊列人群的血清樣本中發現，同健康對照組相比，腦卒中組血清中L-色氨酸、3-甲氧基酪胺、甲硫氨酸、同型半胱氨酸、異亮氨酸、肉堿、精氨酸、亞油酸和鞘氨醇特異性升高；任繁棟等［16］在88例隊列人群的血漿樣本中發現，氨基酸代謝在冠心病組的生理代謝過程中發揮重要作用。

本研究篩選確認了2 大心腦血管疾病相關的代謝風險集群，其在不同組別人群中有完全不同的代謝差異。相關代謝物主要涉及2 條代謝通路的改變：酮體代謝異常及脂肪酸代謝異常。在長時間禁食，嚴格限制碳水化合物期間或非常劇烈的運動等極端條件下，脂肪酸轉化為酮體為身體供能［17-19］。成人健康心臟中，心臟的首選底物是乙酰輔酶A（脂肪酸的主要代謝物），其供能比例達40%～60%。在結構性心臟病早期，脂肪酸氧化減少，引起心臟適應性代謝過程重新編程，增加對酮體供能的依賴。總體而言，本研究發現葡萄糖、乙酰乙酸等心臟關鍵供能物質在腦卒中單患組、冠心病單患組、心腦血管共患組和對照組中的強度分布差異，能為葡萄糖和乙酰乙酸作為心臟細胞中競爭性供能物質提供一定參考線索［20-21］。因此，研究證實酮體、脂肪酸、糖酵解/糖原異生等相關代謝通路對心腦血管發生、進展高度相關，疾病進展過程中或伴隨著相關代謝通路的差異調控［22-23］。

已開發的心腦血管疾病標志物包括上游的核酸/蛋白標志物和下游的代謝標志物。核酸等遺傳標志物為主的遺傳信號有助于探索底層生物學機制，蛋白等標志物有助于在功能執行層面進行深入探究。下游的代謝相關標志物則可以通過建立分子組與表型間聯系，在分子結果層面實現對患者疾病狀態和治療進展的實時監測，因此有助于疾病的治療干預。另外，作為一項大隊列代謝分析的工作，我們的研究存在以下局限：未考慮藥物服用對血漿代謝組學研究的影響；未將PMFs 和臨床生化實驗室指標共同結合做整合，分析心腦血管疾病發生機制。

綜上所述，本研究利用新型質譜技術，提取了14 419 例隊列人群的PMFs，并聯合代謝調控差異、代謝調控表達篩選出酮體代謝異常、脂肪酸代謝異常等2 組在心腦血管疾病中表達趨勢不同的代謝標志物，有望為心腦血管疾病發病機制提供一定的代謝解釋。更重要的是，本研究所提出的實驗設計思路也將為其他疾病的大隊列代謝分析提供一定參考。