鐵死亡對肌肉損傷后再生能力的影響

杜玉婷，張 婧，黃 鶯，張 晶

上海交通大學基礎醫學院病理生理學系，細胞分化與凋亡教育部重點實驗室，上海 200025

骨骼肌是人體第二大可塑性組織，僅次于神經組織［1］，對呼吸、代謝、運動、體溫保持等基本生命活動具有重要的調控作用。運動、疾病、創傷等會導致骨骼肌不同程度的損傷［2］。骨骼肌再生是骨骼肌對損傷或肌病做出反應并進行修復的生理過程［3］。肌肉急性損傷誘導骨骼肌再生的模型應用廣泛、功能強大，其病理生理過程涉及多種細胞的協同作用，受到復雜、精細的調控，以保證再生過程的有序進行［4］。心臟毒素（cardiotoxin，CTX）可通過肌肉注射導致肌肉損傷，常被用于肌肉損傷模型的構建［5］。CTX 注射后的第3日中性粒細胞開始積聚，而巨噬細胞在3 d后開始積聚［6］。

骨骼肌在損傷后具有顯著的再生能力，肌肉再生是一個高度協調的過程。研究表明，肌肉修復通常從肌纖維變性開始，形態學上類似于壞死。在病理情況下，過度的壞死性凋亡（necroptosis），由于其促炎反應，通常會給機體帶來危害。最近，有研究［7］表明壞死性凋亡能夠通過促進固生蛋白（tenascin-c，TNC）的釋放進而促進肌肉再生。然而到目前為止，肌纖維其他的壞死方式對肌肉損傷修復的影響并不清楚。

鐵死亡（ferroptosis）是近年來報道的一種新型的細胞死亡方式［8］，其具體機制是由于鐵過載而導致脂質過氧化（lipid peroxidation）從而引起細胞死亡［9］。鐵死亡誘導劑可以誘導細胞脂質過氧化或死亡，其中，酰基輔酶A 合成酶長鏈家族成員4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）在游離脂肪酸結合到磷脂過程中發揮關鍵作用［10-11］。研究［12-14］表明，鐵死亡與多種細胞過程有關，如鐵穩態、氧化還原穩態和脂質代謝；另一方面，谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase 4，GPX4）是哺乳動物細胞中一種專門消除脂質活性氧（reactive oxygen species，ROS）的酶，可防止鐵死亡的發生。作為小分子的ferrostatin-1 （Fer-1） 具有中和脂質ROS 的能力，去鐵胺（deferoxamine，DFO）具有螯合鐵離子的能力，因此它們被認為是鐵死亡的有效抑制劑［8，12］。從Fer-1衍生的新型抑制劑UAMC-3203具有更好的溶解性，抑制鐵死亡的能力與DFO 比較表現出更強的效果，在小鼠體內顯示對多種器官的損傷具有良好的保護作用［15］。在過去的幾年中，越來越多的證據［12，16-17］表明，鐵死亡與多種病理學改變有關，如組織缺血再灌注損傷、神經退行性變、腦卒中和癌癥。因此，了解鐵死亡是否與其他形式的細胞死亡一樣，參與其他生理和病理過程是很重要的。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8 周齡SPF 級的C57BL/6J 雄性小鼠60 只（靈暢生物提供），體質量20～25 g。實驗小鼠飼養于上海交通大學醫學院動物科學部，12 h明暗交替，動物房溫度18～26 ℃，相對濕度40%～60%。動物使用許可證號SYXK （滬） 2018-0002，生產許可證號SCXK（滬）2018-0007。實驗符合上海交通大學醫學院動物實驗倫理標準。

1.2 主要試劑與儀器

TRⅠzol（Thermo Fisher，美國），反轉錄試劑盒（諾唯贊，中國），Genious 2×SYBR Green Fast實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）Mix（ABclonal，中國武漢），DFO（Sigma，美國），CTX（Merck，美國），UAMC-3203（Selleck，美國），生理鹽水（Servicebio，中國武漢），異氟烷（瑞沃德生命科技有限公司），脫脂牛奶（雅酶生物醫藥，中國上海），ACSL4 抗體（Santa Cruz，美國），血紅素加氧 酶 1 （heme oxygenase-1， HMOX-1） 抗 體（Proteintech，美國），成肌分化抗原（myogenic differentiation antigen，MYOD） 抗體（ABclonal），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH） 抗體（Proteintech， 美國），鼠熒光二抗（1∶15 000，LⅠ-COR），兔熒光二抗（1∶20 000，LⅠ-COR），cocktail（APE×BⅠO），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（Thermo Fisher，美國）。

組織研磨儀（上海凈信），研磨珠（Servicebio，中國武漢），脫水機（Diapath，Donatello），包埋機（武漢俊杰電子有限公司，JB-P5），病理切片機（上海萊卡儀器有限公司，RM2016），冷凍臺（武漢俊杰電子有限公司，JB-L5），組織切片機（浙江金華科迪儀器設備有限公司），染色機（Diapath），烤箱（天津市萊博瑞儀器設備有限公司），載玻片（Servicebio），正置光學顯微鏡（日本尼康），1 mL注射器（康德萊），倒置顯微成像系統（Olympus）。

1.3 研究方法

1.3.1 肌肉損傷再生模型構建 CTX 誘導的急性肌肉損傷模型能夠維持基底膜和微血管的基本結構，有充足的血液供應，通常用于研究肌肉損傷再生。將CTX 溶于生理鹽水配置成濃度為10 μmol/L 的母液。取15 只C57BL/6J 小鼠，刮去腿毛。使用麻醉機用異氟烷對小鼠進行麻醉，分別在脛骨前肌（tibialis anterior，TA）上、中、下選取3 個點注射CTX，每個點注射30 μL。CTX 注射后，分別在第0、3、7 日取5 只小鼠的TA 組織，3 個時間點分別代表肌肉損傷、再生和修復的不同階段。本研究通過檢測這3 個關鍵節點的肌肉組織形態學變化及相關分子通路，探究再生過程中生理病理機制。

1.3.2 分組及預處理 將45只8周齡的C57BL/6J雄性小鼠隨機分為生理鹽水組、鐵離子螯合劑DFO組、鐵死亡抑制劑UAMC-3203 組，每組15 只。生理鹽水組和DFO組連續7 d分別腹腔注射生理鹽水和DFO，注射劑量為100 mg/kg。UAMC-3203組在注射CTX前1 d腹腔注射，劑量為10 mg/kg。

1.3.3 小鼠TA 肌肉取樣及病理學觀察 分別在注射CTX后第0、3、7日取樣。取TA組織放入4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）固定液中固定，再將組織塊包埋于石蠟后做蘇木精-伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，H-E染色），在顯微鏡下觀察拍片。

1.3.4 RNA 抽提、反轉錄及qPCR 肌肉組織用TRⅠzol 進行裂解，實驗前盡量確保樣品處于無RNA酶污染的環境，定量后去除基因組DNA 后反轉錄成cDNA 用于后續qPCR。 采用Genious 2×SYBER Green Fast qPCR Mix熒光定量試劑盒，設計特異熒光定量引物（primer bank），引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列見表1。每個待測樣品設置3個復孔，內參使用小鼠Gapdh。

表1 qPCR引物序列（5′→3′）Tab 1 Primer sequences for qPCR（5′→3′）

1.3.5 蛋白質印跡法 根據TA 組織質量加入RⅠPA裂解液裂解，同時加入蛋白酶抑制劑cocktail。預冷組織研磨儀至4 ℃后向樣品中加入研磨珠對組織進行研磨，頻率為70 Hz，30 s/次，共3 次。12 000×g離心取上清液，BCA 蛋白定量后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），用5%的脫脂牛奶封閉0.5 h 后用HMOX-1 抗體（1∶3 000），ACSL4 抗體（1∶300），MYOD 抗體（1∶2 000），GAPDH 抗體（1∶8 000），4 ℃過夜孵育。回收一抗后洗膜孵育二抗，室溫1 h，洗膜顯影。

1.3.6 肌肉組織RNA 測序 分別從生理鹽水組和UAMC-3203組隨機選取3只小鼠的TA組織進行RNA測序（RNA sequencing，RNA-Seq），測序實驗由諾禾公司完成。對cDNA 進行文庫的構建和質檢后使用Qubit2.0 Fluorometer 進行初步定量，符合預期后上機測序。

1.4 統計學方法及差異表達分析

1.4.1 統計學方法 采用Microsoft Excel 和Graphpad Prism 8 進行數據處理和統計學分析。2 組比較采用Student'st檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

1.4.2 差異表達分析 使用DESeq 2 軟件（1.16.1）分別對第0 日及第3 日生理鹽水組和UAMC-3203 組進行差異表達分析（每個組2 個生物學重復）。DESeq 2 提供了統計程序，用于使用基于負二項式分布的模型來確定數字基因表達數據中的差異表達。使用Benjamini 和Hochberg 的方法來調整所得P值以控制錯誤發現率。通過DESeq 2 發現調整的P＜0.05 的基因被分配為差異表達基因（對于沒有生物學重復的采用edgeR）。在進行差異基因表達分析之前，對于每個測序文庫，通過一個比例歸一化因子使用edgeR 程序包調整讀取計數。2 個條件的差異表達分析使用edgeR 軟件包（3.18.1）進行。使用Benjamini 和Hochberg 的方法調整P值。校正后的P值以及|log2foldchange|作為顯著差異表達的閾值。

1.4.3 差異基因富集分析 通過clusterProfiler（3.4.4）軟件實現差異表達基因的基因本體數據庫（Gene Ontology，GO）富集分析，其中修正了基因長度偏差。考慮具有小于0.05 的校正P值的GO term通過差異表達基因富集。京都基因與基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）是一個數據庫資源，用于從分子水平的信息，特別是基因組測序產生的大規模分子數據集和其他高通量數據庫中了解生物系統的高級功能和效用，如細胞、生物體和生態系統等。我們使用clusterProfiler（3.4.4）軟件分析KEGG 通路中差異表達基因的富集統計。

2 結果

2.1 CTX注射后肌肉損傷再生相關指標的檢測

TA 組織注射CTX 后，為了驗證CTX 注射誘導的肌肉損傷模型是否構建成功，本研究通過對肌肉組織進行H-E 染色來觀察肌肉損傷再生情況。H-E 染色如圖1A 所示：CTX 注射后第3 日損傷較為嚴重，出現單核細胞的浸潤，中性粒細胞的大量積聚；第7 日肌肉組織形態基本恢復。為檢測此過程是否有肌肉再生，本研究分別檢測肌肉再生關鍵基因Myod、肌細胞生成素（myogenin，Myog）和Tnc。Myod表達于肌肉細胞及其前體細胞中，促進成肌細胞向肌肉細胞分化［18］。Myog基因是生肌調節因子Myod家族中的一員，該基因在肌肉的生長發育、肌肉萎縮以及肌肉再生中具有重要作用［19］。Tnc能促進成肌細胞的增殖［20］，這個過程由損傷肌肉組織中壞死性凋亡來調控［7］。如圖1B所示，肌肉再生相關標志基因RNA水平的表達在第3 日明顯升高（均P＜0.05）。同時，我們也從蛋白水平檢測MYOD的表達，發現同樣在第3日升高（圖1C），此趨勢與RNA 結果一致，說明肌肉損傷再生模型構建成功。

圖1 CTX注射誘導肌肉組織損傷后再生Fig 1 Muscle injury and regeneration induced by CTX

2.2 CTX注射后鐵死亡相關指標的檢測

在15 只C57BL/6J 小鼠的TA 注射CTX 后，分別于第0、3、7 日取TA 組織，從RNA 和蛋白水平檢測鐵死亡相關指標。由圖2 可知，注射CTX 后第3 日鐵死亡相關指標Acsl4、Hmox-1在RNA 和蛋白水平上有明顯升高趨勢，第7 日有所恢復（均P＜0.05）。結果表明，CTX 引起的肌肉損傷過程中有鐵死亡的發生。

圖2 CTX注射后鐵死亡相關指標RNA和蛋白的表達Fig 2 RNA and protein expression of ferroptosis-related indicators after CTX injection

2.3 鐵死亡抑制劑對肌肉損傷再生的轉錄組調控

為了探究鐵死亡對小鼠肌肉損傷再生過程中轉錄組表達水平的影響，我們隨機從生理鹽水組和UAMC-3203 組中選取3 只小鼠的TA 組織進行RNAseq。 以log2（CTX+ 生理鹽水）/（CTX+UAMC-3203）或者log2（CTX+UAMC-3203）/（CTX+生理鹽水）≥1.5，以及t檢驗P＜0.05 為條件，共篩選出顯著差異表達基因531 個，其中UAMC-3203 組顯著升高的基因有489 個（圖3A 的紅色部分），顯著降低的基因42 個（圖3A 的綠色部分）。通過對RNA-seq 差異基因的GO 分子功能通路分析發現，UAMC-3203組中性粒細胞的脫顆粒化，ROS 的生成，以及吞噬作用中的磷脂等信號通路發生了明顯的改變（圖3B）。在RNA-seq 顯著變化的基因中，我們注意到組織蛋白酶S（cathepsin S，Ctss）基因表達的顯著升高。如圖3C 所示，CTX 注射后第3 日，與生理鹽水組比較，UAMC-3203 組和DFO 組Ctss基因的表達都顯著增強（均P＜0.05）。

圖3 鐵死亡抑制劑UAMC-3203預處理之后的轉錄組分析Fig 3 Effect of ferroptosis inhibitors UAMC-3203 on CTX-induced skeletal muscle regeneration at transcriptome level

2.4 鐵死亡抑制劑預處理后對肌肉再生的影響

H-E 染色由圖4A 所示，注射CTX 后第3 日肌肉損傷較為嚴重，出現單核細胞的浸潤，第7 日肌肉組織形態基本恢復。DFO 組和UAMC-3203 組損傷程度較生理鹽水組更為嚴重。我們檢測了CTX 注射后不同組別MYOD 的表達水平，結果如圖4B 所示，CTX 注射3 d 后，MYOD 蛋白的表達顯著升高，而DFO 組和UAMC-3203 組中MYOD 蛋白的升高被明顯抑制。同時，如圖4C 所示，CTX 注射后第3 日，肌肉再生標志基因Myod、Tnc和Myog的RNA 表達在生理鹽水組也顯著升高，而鐵死亡抑制劑組肌肉再生相關基因的表達明顯低于生理鹽水組（均P＜0.05）。第7 日肌肉再生標志基因Myod、Tnc和Myog的RNA 表達水平均較第3 日呈現下降趨勢（均P＜0.05）。這些結果提示鐵死亡至少部分參與了肌肉再生。

圖4 鐵死亡抑制劑預處理后對肌肉再生能力的抑制作用Fig 4 Ⅰnhibitory effect of ferroptosis inhibitor on the regeneration ability of skeletal muscle

3 討論

骨骼肌的生長和再生依賴于從中胚層發育而來的成人干細胞亞型，即衛星細胞（satellite cells）。衛星細胞可以在外部刺激和肌肉損傷的情況下重新進入細胞周期，在MYOD 和MYOG 等因子的調節下產生成肌細胞，參與肌纖維的重建或修復。肌肉損傷再生模型常用于分析肌肉再生過程中相關分子所起的作用。鐵死亡作為一種新型的細胞死亡方式，是否影響肌肉損傷后再生仍是未知。作為一種病理性的細胞死亡，鐵死亡已被證實與多種組織損傷和疾病相關，包括缺血再灌注損傷和神經退行性疾病等。本研究旨在探究鐵死亡對肌肉再生的影響。我們首先構建了CTX 肌肉損傷再生模型，通過H-E染色發現有炎癥細胞的浸潤，并在RNA 及蛋白水平上發現Myod等指標在第3日水平升高，驗證了肌肉損傷再生模型構建成功。接下來，我們檢測在肌肉損傷修復過程中是否有鐵死亡的發生，發現在CTX 注射后第3 日鐵死亡相關指標Acsl4和Hmox-1在RNA 和蛋白水平上有明顯上升趨勢，提示在CTX 誘導的肌肉損傷模型中有鐵死亡的發生。

接下來我們通過RNA-seq實驗探究鐵死亡在損傷過程中發揮怎樣的作用。實驗結果顯示中性粒細胞的脫顆粒化，以及吞噬作用中的磷脂等信號通路發生了明顯的改變。有意思的是，我們發現在顯著變化的基因中Ctss的表達有明顯升高趨勢。CTSS 屬于溶酶體半胱氨酸蛋白酶家族，在巨噬細胞和樹突狀細胞中被鑒定為一種主要的內蛋白酶；在小鼠中，Ctss基因的缺失并不影響其生存能力。在組織損傷和炎癥中分泌的CTSS，參與細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的重塑和組織愈合［21］。除了在抗原加工中的作用，CTSS還參與組織重構過程中ECM 的構建。之前已有文獻［22］報道急性肌肉損傷及mdx 小鼠［進行性假肥大性肌營養不良（Duchenne's muscular dystrophy，DMD）模型］的肌肉中，CTSS 蛋白表達水平和蛋白水解活性顯著提高。Ctss基因的缺失會增加肌纖維肌膜的穩定性、 提高整合素和β-dystroglycan 的表達以及膜定位的準確性，從而維持骨骼肌結構的穩定性［21，23］。我們推測，抑制鐵死亡后Ctss基因的表達升高導致肌纖維壞死增加，從而表現出肌肉組織病理學功能缺陷，以及肌肉損傷后再生過程的延緩。但CTSS 具體參與鐵死亡哪一條通路仍是未知，還需進一步探究。

接下來我們想知道鐵死亡在肌肉再生的過程中是否起主要作用，于是通過用鐵死亡抑制劑DFO 和UAMC-3203腹腔注射預處理后建立肌肉損傷模型，從RNA和蛋白水平檢測肌肉再生相關標志物的表達。結果顯示注射鐵死亡抑制劑組相較于生理鹽水組肌肉生長因子的表達水平明顯下降。到第7 日無論是生理鹽水組還是鐵死亡抑制劑組肌肉壞死水平都有所恢復，但鐵死亡抑制劑組較生理鹽水組相比恢復得較慢，仍能看到部分損傷。本研究取樣截止時間點選在第7日，肌肉損傷后再生完全恢復時間還有待于進一步探究和摸索。最近，有學者［7］證明，細胞壞死性凋亡能通過促進TNC的釋放促進肌肉再生，其意義在于探究細胞壞死在生理過程中發揮積極的作用。另一方面，在慢性肌肉疾病（如DMD）中，肌纖維是否發生壞死仍有爭議［22-23］。此外，有研究［23］觀察到CTX急性損傷再生模型中，野生型小鼠的肌肉干細胞并未發生壞死，而在mdx小鼠中有一群非競爭的肌肉干細胞有壞死的癥狀。這些結果表明，鐵死亡可能參與急性和慢性肌肉再生，但扮演著不同的角色。

綜上所述，本研究顯示了經DFO 和UAMC-3203處理后肌肉再生能力有所下降，提示鐵死亡的發生可能幫助了肌肉的再生，這將為我們拓展對鐵死亡的病理功能的認識提供新思路。