MMP14 在胰腺癌中的表達及其與腫瘤免疫微環境特征的相關性研究

許靜軒，杜少倩，曹 源，王紅霞，黃偉翼

上海交通大學醫學院附屬第一人民醫院腫瘤中心，上海 201600

胰腺癌是消化道常見惡性腫瘤之一。由于早期診斷困難，手術、放射治療（放療）及化學治療（化療）等方式的治療效果有限，胰腺癌患者預后差，死亡率高［1］。據預測，到2030 年胰腺癌將成為世界死亡率第二的癌癥［2］。研究［3］表明，胰腺癌的惡性進展、治療抵抗和不良預后與胰腺癌腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）的免疫抑制性密切相關。雖然免疫治療在乳腺癌、肺癌、卵巢癌等腫瘤中取得明顯的效果，但由于胰腺癌腫瘤免疫微環境（tumor immune microenvironment，TⅠME）的高度抑制性，免疫治療對胰腺癌的效果并不顯著［4］。其中，T 細胞［5］、巨噬細胞（macrophage）［6］、骨髓來源的抑制性細胞 （myeloid-derived suppressor cell，MDSC）［7］、自然殺傷細胞（natural killer cell，NK cell，NK 細胞）［8］、樹突狀細胞（dendritic cell，DC）［9］等免疫細胞亞群通過其自身功能或抑制性分子的表達與分泌，與腫瘤細胞之間相互作用，維持腫瘤免疫微環境抑制性，進而對腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移產生影響［10］。因此，針對胰腺癌腫瘤免疫微環境的研究意義重大，通過聚焦其組成成分以及抑制性特點，有望為胰腺癌的免疫治療提供新的思路與方向。

基質金屬蛋白酶14（matrix metalloproteinase 14，MMP14）是MMP家族的成員之一，是其家族中首個被發現的跨膜蛋白。研究表明，MMP14 在肝癌［11］、乳腺癌［12］、結直腸癌［13］等多種腫瘤組織中高表達，且對腫瘤的發展、侵襲和轉移具有重要作用。在乳腺癌中，缺氧條件下MMP14 可增強起始細胞的功能，促進腫瘤發生以及腫瘤細胞生長［14］；在膠質母細胞瘤中，MMP14 通過釋放Notch3 信號通路Delta 樣配體4（delta-like ligand 4，DLL4）分子增強腫瘤細胞干性，引起替莫唑胺耐藥現象［15］；在胰腺癌中，MMP14 通過重塑細胞外基質（extracellular matrix，ECM）促進腫瘤的侵襲和轉移［16］。然而，MMP14作為促進腫瘤進展與侵襲轉移的重要分子，其對胰腺癌腫瘤免疫微環境的影響還鮮有報道。

本研究以生物信息學數據庫分析為基礎，結合胰腺癌標本免疫微環境流式細胞分析和多色熒光免疫組織化學（免疫組化）法，探究MMP14 在胰腺癌中的表達及其臨床相關性，聚焦MMP14 對抑制性免疫微環境以及各類免疫細胞亞群的影響，旨在為研究MMP14促進腫瘤進展的機制以及MMP14作為胰腺癌免疫治療靶點提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 公共數據來源

從TCGA （The Cancer Genome Atlas） 數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）中下載178 例患者的胰腺癌組織和4 例配對癌旁組織的轉錄組數據以及相關臨床信息。從GTEx（Genotype-Tissue Expression）數據庫（https：//gtexportal.org/home/）中下載167 例正常胰腺組織的轉錄組數據。

1.2 生物信息學數據庫的數據處理及統計學分析

1.2.1 基因表達差異分析 使用GEPⅠA （Gene Expression Profiling Ⅰnteractive Analysis） 數據平臺（http：//gepia.cancer-pku.cn/）分析MMP 家族成員在30 種常見腫瘤組織中的表達情況。使用R 語言將TCGA 數據庫和GTEx 數據庫的數據進行合并，分析MMP14 在胰腺癌組織中與在胰腺正常組織和癌旁組織中的表達差異。采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

1.2.2 臨床相關性分析 使用Perl 軟件進行TCGA數據庫原始轉錄組數據的處理與轉化，將其整理為行名是基因名稱，列名是樣品名稱的基因矩陣。使用Perl 軟件進行TCGA 數據庫胰腺癌患者臨床信息的整理，包括患者的總生存時間、生存狀態、腫瘤TNM分期以及病理組織學分級。采用K-S 檢驗分析MMP14基因表達水平與腫瘤TNM 分期、病理組織學分級的關系，R語言barplot包繪制條形圖，P＜0.05為差異具有統計學意義。運用GEPⅠA 數據平臺進行生存分析，采用Kaplan-Meier 法和Log-rank 檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

1.2.3 信號通路和功能富集分析 運用R 語言和GSEA v3.0 軟件對胰腺癌中MMP14及其相關基因進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析和基因本體論（Gene Ontology，GO）功能富集分析。功能富集分析包括3 個方面：分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）。認為名義P值（NOMPvalue）＜0.05 且錯誤發現率（false discovery rate，FDR）＜0.05的富集結果有統計學意義。

1.2.4 腫瘤免疫微環境分析 將TCGA 數據庫中178例胰腺癌患者根據MMP14表達量的中位數分為高表達組和低表達組2組。在R語言中采用CⅠBERSORT反卷積算法計算胰腺癌腫瘤微環境中各類免疫細胞比例。運用Wilcoxon 秩和檢驗分析MMP14 高、低表達組免疫細胞的比例差異，R語言barplot包繪制條形圖，P＜0.05為差異具有統計學意義。運用Spearman相關性檢驗分析MMP14 的表達與各類免疫細胞亞群比例的相關性，計算相關系數R與P值，R語言ggplot包繪制散點圖，P＜0.05為具有統計學意義。

1.3 實驗組織標本、主要試劑及儀器

1.3.1 組織標本 6例胰腺癌組織及其配對癌旁組織的新鮮標本，以及40 例胰腺癌組織和32 例配對癌旁組織的組織芯片均來自上海交通大學醫學院附屬第一人民醫院。所有樣本均經患者知情同意并按照上海交通大學醫學院附屬第一人民醫院倫理委員會批準的研究方案獲得（#2017KY053）。

1.3.2 主要試劑 Ⅳ型膠原酶和DNA酶Ⅰ（DNase Ⅰ）購自美國Sigma公司，DMEM培養基、青霉素/鏈霉素雙抗溶液、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）購自美國Gibco公司，組織保存液購自德國Miltenyi公司，紅細胞裂解液購自中國翌圣生物科技有限公司，細胞凍存液購自中國雅酶生物科技有限公司，補償微球、DAPⅠ染液購自美國BD Biosciences公司，二甲苯和乙醇購自中國國藥集團化學試劑有限公司，通用型強力抗原修復液和抗熒光淬滅封片劑購自中國碧云天生物技術有限公司，多色熒光免疫組化試劑盒（Opal Polaris 7 Color ⅠHC Detection Kits）購自美國Akoya Biosciences公司。抗體來源及相關信息見表1。

表1 抗體信息Tab 1 Ⅰnformation of antibodies

1.3.3 主要儀器 超凈工作臺（Thermo Fisher Scientific，美國），恒溫振蕩搖床（天翎，中國），光學顯微鏡（Nikon，日本），高速離心機（Eppendorf，德國）， FACSymphonyTMA3 流式分析儀（BD Biosciences，美國），恒溫烘箱（誠衛，中國），恒溫水浴鍋（歐萊博，中國），Vectra PolarisTM3.0 成像系統（PerkinElmer，美國）。

1.4 實驗方法

1.4.1 組織標本處理、流式細胞法及數據分析 將手術切除的新鮮胰腺癌組織和癌旁組織立即放入組織保存液并于4 ℃保存，48 h 內進行處理。在超凈工作臺中將組織剪碎至肉糜狀后分別移入15 mL 離心管，加入適量消化液（DMEM 培養基+2 mg/mL Ⅳ型膠原蛋白酶+300 μg/mL DNase Ⅰ），置于37 ℃恒溫振蕩搖床，轉速100 r/min，消化40 min 至無明顯塊狀組織。采用70μm 孔徑濾網過濾消化后的組織懸液，將懸液于4 ℃、300×g離心5 min，棄上清液。用紅細胞裂解液重懸離心后的細胞沉淀，于冰上裂解10 min 后，4 ℃、300×g離心5 min，棄上清液。加入預冷的PBS溶液重懸細胞沉淀，取少量細胞懸液進行臺盼藍染色和細胞計數。每個標本留取106個細胞，其余細胞300×g離心5 min 后采用細胞凍存液重懸，凍存于-80 ℃冰箱。將每個標本留取的細胞轉移至離心管中，300×g離心5 min 后用流式細胞染色緩沖液（PBS+1% FBS）重懸至100 μL。將上述流式細胞染色的抗體分別加入細胞懸液至最佳染色濃度并用移液槍輕柔地吹打混勻，4 ℃避光孵育40 min。加入緩沖

液洗滌細胞，300×g離心5 min，重復2次。將細胞沉淀重懸于200 μL 緩沖液中待檢測。利用補償微球在流式細胞儀上調整流式染色方案中各通道之間的補償值至最佳后，將細胞懸液經70μm 孔徑濾網過濾并進行上機檢測，導出FCS文件。流式細胞實驗數據分析軟件采用FlowJo Version 10.5.3。利用downsample 和t-SNE插件進行數據處理和降維分析。

1.4.2 多色熒光免疫組化實驗 將石蠟切片放入65 ℃烘箱中干燥1 h后，立即放入二甲苯中進行脫蠟，共2次，每次10 min。然后將切片依次在100%、95%、75%、50%乙醇中進行水化。在100 ℃恒溫水浴鍋中采用通用型強力抗原修復液進行抗原修復20 min，自然冷卻至室溫。將切片進行封閉后，采用多色熒光免疫組化試劑盒中的一抗稀釋液將一抗稀釋至合適濃度，室溫孵育1 h，在TBST中洗滌3次，每次3 min。在室溫用二抗孵育切片10 min 后，TBST 洗滌3 次，每次3 min。采用試劑盒中的稀釋液稀釋熒光染料，室溫孵育切片10 min，在TBST 中洗滌3 次，每次3 min。為了檢測其他靶點，重復上述的抗原修復、封閉、一抗孵育、二抗孵育和熒光染料孵育的步驟。該試劑盒中有7 種不同類型的熒光燃料：480、520、570、620、690、780和DAPⅠ。所有靶點標記完畢后，使用DAPⅠ工作溶液室溫孵育切片5 min，用抗熒光淬滅封片劑封片。多色熒光免疫組化切片采用PerkinElmer Vectra PolarisTM3.0 成像系統進行掃描，使用PerkinElmerⅠnFormTM圖像分析軟件進行分析。

1.5 統計學方法

運用SPSS 26.0 軟件進行統計學分析，2 組間差異比較采用t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。采用GraphPad Prism 8.0 軟件作圖。

2 結果

2.1 生物信息學數據庫中MMP14在胰腺癌組織的表達情況及其與患者臨床特征的相關性

運用GEPⅠA 數據平臺，通過比較MMP 家族成員在30 種常見腫瘤組織中的表達情況發現，與同家族的其他成員相比，MMP14在多種腫瘤中普遍高表達。MMP14在胰腺癌中的表達高于其他絕大多數腫瘤（圖1A）。利用GEPⅠA 數據平臺整合TCGA 數據庫與GTEx 數據庫，將178 例胰腺癌組織與167 例胰腺正常組織和4 例癌旁組織共171 例組織進行對比，MMP14在胰腺癌中顯著高表達（P=0.000，圖1B）。MMP14表達與胰腺癌TNM 分期相關，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期腫瘤MMP14表達水平均高于Ⅰ期，其中Ⅱ期與Ⅰ期間差異有統計學意義（P=0.012，圖1C）。MMP14與胰腺癌病理組織學分級相關，G2、G3 期腫瘤MMP14的表達顯著高于G1 期（均P=0.000，圖1D）。根據MMP14的中位表達水平將胰腺癌患者分為高表達組和低表達組進行生存分析，結果顯示，胰腺癌中MMP14高表達組的患者預后較差（P=0.033，圖1E）。

圖1 生物信息學數據庫中MMP14在胰腺癌組織中的表達情況及其與患者臨床特征的相關性分析Fig 1 Bioinformatics analysis of MMP14 expression in the pancreatic cancer tissues and its correlation with the patients’clinical characteristics

2.2 TCGA 數據庫中MMP14 相關信號通路和功能富集分析

通過KEGG 分析預測MMP14 相關信號通路，結果顯示，其主要富集在ECM 受體信號通路、局灶性黏附信號通路、胰腺癌相關信號通路、白細胞跨內皮遷移信號通路、Notch 信號通路、P53 信號通路、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路和Hedgehog 信號通路（圖2A）。GO 分析顯示，MMP14 在細胞外基質、細胞基質黏附、白細胞遷移、髓系細胞分化、T 細胞激活、巨噬細胞釋放細胞因子以及TGF-β 信號通路等生物學過程中起作用（圖2B）。綜上提示MMP14與免疫相關通路和生物學功能存在相關性，MMP14 可能對胰腺癌腫瘤免疫微環境產生影響。

2.3 TCGA 數據庫中MMP14 與胰腺癌免疫微環境的相關性分析

為進一步探究MMP14對胰腺癌腫瘤免疫微環境的影響，將TCGA 數據庫中178 例胰腺癌組織的免疫微環境數據進行整理與轉化，采用CⅠBERSORT 反卷積算法計算各類免疫細胞的占比，保留經驗證后數據準確（P＜0.05）的134 例胰腺癌組織樣品，發現其腫瘤免疫微環境主要由以下幾類細胞構成：B細胞、CD8+T細胞（CD8+T cell）、CD4+T細胞（CD4+T cell）、調節T細胞（Treg）、γδ 細胞（gamma-delta T cell）、NK細胞、 單核細胞 （monocyte）、 巨噬細胞（macrophage）、DC、肥大細胞（mast cell）、嗜酸性粒細胞（eosinophil）、中性粒細胞（neutrophil）。

在MMP14高表達的胰腺癌中，CD8+T 細胞（P=0.009）和單核細胞（P=0.000）的比例低于MMP14低表達組，巨噬細胞（P=0.000）的比例高于MMP14低表達組（圖3A）。進一步將MMP14的表達和各類免疫細胞的占比進行相關性檢驗，同樣發現這3 類免疫細胞亞群與MMP14的表達顯著相關。其中，CD8+T 細胞（R=-0.32，P=0.000）和單核細胞（R=-0.18，P=0.035） 與MMP14的表達呈負相關，巨噬細胞（R=0.39，P=0.000）與MMP14的表達呈正相關（圖3B）。綜合2 次分析結果，確認在TCGA 數據庫中MMP14的表達與CD8+T 細胞、單核細胞和巨噬細胞的比例存在相關性。

圖3 TCGA數據庫中胰腺癌MMP14不同表達水平組腫瘤浸潤免疫細胞比例差異及其與MMP14表達的相關性Fig 3 Distribution differences of tumor-infiltrating immune cells in the pancreatic cancer with different MMP14 expression levels and the correlation between the percentage of immune cell subsets and MMP14 expression in TCGA database

2.4 胰腺癌和癌旁組織的免疫微環境流式細胞分析

在TCGA數據庫分析的基礎上，為更準確地描述胰腺癌的腫瘤免疫微環境特征，取6 例胰腺癌患者的新鮮腫瘤組織和癌旁組織標本制備成單細胞懸液，通過1個16色流式染色方案檢測腫瘤免疫微環境中各類免疫細胞亞群的表達。 利用FlowJo 軟件的downsample 插件在配對的胰腺癌和癌旁組織數據中各提取12 000 個免疫細胞（CD45+）進行t-SNE 降維分析，根據流式抗體標記的組合表達將其分為各類免疫細胞亞群（圖4A、4B）：總T 細胞（CD3+）、CD4+T 細胞（CD3+CD4+）、CD8+T 細胞（CD3+CD8+）、γδ T 細胞（CD3+TCRγδ+）、B 細胞（CD19+）、單核細胞（CD14+）、M2 型巨噬細胞（CD206+）、自然殺傷細胞（CD56+）、樹突狀細胞（HLA-DR+）、中性粒細胞（CD11b+CD66b+）。對比各免疫細胞亞群在腫瘤組織和癌旁組織中的比例，結果顯示，CD8+T 細胞（P=0.025）在胰腺癌中的比例明顯低于癌旁組織；γδ T 細胞（P=0.021）和中性粒細胞（P=0.037）在胰腺癌中的比例明顯高于癌旁組織（圖4C）。綜上結果，胰腺癌腫瘤微環境呈現免疫抑制的特征。

圖4 胰腺癌和配對癌旁組織的免疫微環境流式細胞分析Fig 4 Flow cytometry analysis of immune microenvironment in pancreatic cancer and paired para-tumor tissues

2.5 MMP14在胰腺癌中的表達及其與免疫微環境相關性

為驗證生物信息學分析結果，采用包含40 例胰腺癌組織和32 例配對癌旁組織的組織芯片進行多色熒光免疫組化實驗，檢測MMP14、CD45（免疫細胞）、CD8（CD8+T 細胞）、CD68（巨噬細胞）和CD14（單核細胞）的表達。結果顯示，MMP14在腫瘤組織中的表達顯著高于癌旁組織（P=0.000，圖5A、5B）。MMP14的表達與TNM 分期相關，ⅠB期和ⅠⅠA 期的腫瘤MMP14 表達水平顯著高于ⅠA 期（P=0.017，P=0.006），T2期腫瘤的MMP14表達水平顯著高于T1期（P=0.022，圖5C）。MMP14與腫瘤病理組織學分級相關，G2、G3 期腫瘤MMP14 的表達水平顯著高于G1 期（P=0.030，P=0.018，圖5D）。根據MMP14 的中位表達水平將腫瘤組織分為高表達組和低表達組，并對3 類腫瘤浸潤性免疫細胞進行組間分析（圖5E、5F）。結果顯示，與MMP14 低表達組相比，高表達組腫瘤組織中CD8+T 細胞比例明顯降低（P=0.001），巨噬細胞比例明顯升高（P=0.000），與TCGA 數據庫分析結果一致，而單核細胞比例在2 組間差異無統計學意義。

圖5 MMP14在胰腺癌組織中的表達及其與免疫微環境相關性的分析Fig 5 Analysis of MMP14 expression in the pancreatic cancer tissues and its correlation with immune microenvironment

3 討論

胰腺癌是一類惡性程度高的消化系統腫瘤，在其腫瘤微環境中，各類免疫成分之間相互作用，對胰腺癌的發生、發展、侵襲和轉移產生影響［17］。近年來研究證明，CD4+T 細胞［18］和細胞毒性CD8+T 細胞［19］協同作用，激活抗腫瘤免疫應答；γδ T 細胞通過阻止效應T 細胞進入腫瘤組織導致免疫逃逸［20］；中性粒細胞通過釋放的DNA 激活胰腺星狀細胞，促進胰腺癌的發展［21］。由此提示，探究胰腺癌腫瘤免疫微環境的特點，對全面了解胰腺癌的惡性進展機制有重要作用。我們通過獲取胰腺癌患者新鮮標本，采用多色流式細胞術，對比腫瘤和癌旁組織微環境中免疫細胞構成特點發現，腫瘤組織中CD8+T 細胞比例降低，γδ T細胞和中性粒細胞比例升高，胰腺癌腫瘤微環境呈現免疫抑制性的特點；該發現有助于進一步研究免疫微環境對胰腺癌惡性進展的影響。

MMP 家族屬于蛋白水解酶類，其與血管生成和腫瘤進展密切相關。我們通過分析30種腫瘤的轉錄組數據，發現與其他MMP家族成員相比，MMP14在多種腫瘤中普遍表達，且在胰腺癌中高表達。以往的研究表明，MMP14 通過直接降解ECM 或間接激活MMP2的方式，促進多種腫瘤的侵襲和轉移［22］。運用TCGA 和GTEx 生物信息學數據庫分析以及免疫組化實驗驗證，我們發現MMP14在胰腺癌中高表達，且與患者TNM 分期和病理組織學分級以及患者預后相關，提示MMP14可作為胰腺癌的一個特征性靶點。

通過KEGG 和GO 分析，我們發現MMP14及其相關基因在免疫相關通路富集，提示MMP14可能與胰腺癌的抑制性免疫微環境相關，可能參與腫瘤惡性進展。曾有研究報道，MMP14 可調節單核細胞的遷移，驅動炎癥細胞遷移至感染病灶［23］。在轉移性乳腺癌中，應用MMP14 抗體可以破除腫瘤微環境的免疫抑制性［24］。在膠質母細胞瘤中，MMP14在髓系祖細胞上高表達，并對腫瘤腦轉移產生影響［25］。由此，我們通過TCGA 數據庫分析和多色熒光免疫組化實驗，探究胰腺癌腫瘤微環境中MMP14 的表達和腫瘤浸潤性免疫細胞的相關性。結果顯示，在MMP14 高表達的腫瘤組織中，CD8+T 細胞比例降低，而巨噬細胞比例升高。過去的研究已證實，CD8+T 細胞和巨噬細胞的生物學功能均對腫瘤免疫微環境產生重要影響。其中，CD8+T 細胞作為抗腫瘤作用的主要效應細胞，通過與腫瘤細胞結合后分泌穿孔素和顆粒酶B 發揮細胞毒殺傷作用［26］。巨噬細胞通過多種途徑促進腫瘤細胞的生長和轉移［27］；在胰腺癌中，巨噬細胞可促使腫瘤細胞對一線化療藥物吉西他濱耐藥［28］。綜上，MMP14高表達的胰腺癌腫瘤微環境呈現高度免疫抑制性的特征，為MMP14 促進腫瘤的發展、侵襲和轉移的作用提供了微環境條件，兩者相互作用，共同維持胰腺癌的惡性進展。

由于胰腺癌腫瘤微環境的免疫抑制性特點，近年來針對胰腺癌的免疫治療和靶向治療引起了廣泛的關注［29］。本研究通過生物信息學數據庫分析與實驗驗證，描述了胰腺癌腫瘤免疫微環境特征，發現了MMP14 在胰腺癌中的表達與胰腺癌浸潤性免疫細胞的相關性，為MMP14 促進胰腺癌進展的機制研究提供了新的方向，為其作為胰腺癌的預后標志物和治療靶點提供了新的證據。