FRA-2 mRNA 表達及DNA 甲基化水平與代謝綜合征的相關性研究

杜晴晴，侯澤鑫，李 軍，胡 穎，曹國磊，李思源

1.石河子大學醫學院，石河子 832002；2.石河子大學醫學院第一附屬醫院內分泌代謝科，石河子 832002；3.新疆醫科大學第四附屬醫院神志科，烏魯木齊 830099；4.新疆醫科大學附屬腫瘤醫院呼吸神經內科，烏魯木齊 830011

近年來，西方生活方式在全球范圍內日益流行，代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）的患病率也隨之上升，其在一些發展中國家城市人口中的患病率往往高于發達國家，已成為一個全球性的威脅健康的重要問題。MS 是肥胖或超重、高血糖、胰島素抵抗等多種代謝異常構成的復雜的代謝異常癥候群。MS促進冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、卒中及惡性腫瘤等疾病的發生，這些疾病造成的醫療保健成本和潛在的經濟活動損失成本，數以萬億計［1-2］。

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式。有研究［3］發現，DNA 甲基化可能通過在啟動子區域的CpG 序列添加甲基來發揮作用，參與哺乳動物發育、代謝、穩態調節及肥胖和多種疾病的發生。DNA甲基化也可能與MS的發生有關［4］。Fos相關抗原-2（Fosrelated antigen-2，FRA-2）屬于轉錄因子激活蛋白1（activator protein-1，AP-1）家族，存在于動物的多種組織和細胞，參與細胞增殖、分化等過程；FRA-2的異常表達可導致疾病的發生和發展［5］。FRA-2參與哺乳動物能量平衡、糖脂代謝及胰島素抵抗的調節，與MS、糖尿病、動脈粥樣硬化等的發生有關［6-9］。到目前為止，FRA-2mRNA及DNA甲基化水平與MS的相關關系尚不清楚。本研究擬探討FRA-2mRNA及DNA甲基化水平與MS的關系，探究MS發生的分子機制以尋找MS防治的潛在靶點。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選取2020年6月—2021年6月石河子大學醫學院第一附屬醫院內分泌代謝科就診的患者，根據《中國2 型糖尿病防治指南（2020 年版）》［10］對MS 的定義，將有MS 危險因素（高血糖、高血脂、高血壓、肥胖）≥3 項的患者納入MS 組（n=80），有MS 危險因素1～2 項的患者納入非MS 組（n=80）。MS 的診斷標準滿足以下≥3 項：①腰圍（waist circumference，WC）女性≥85 cm，男性≥90 cm。②確診高血壓，或收縮壓（systolic blood pressure，SBP） ≥130 mmHg或舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）≥85 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。③高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）＜1.04 mmol/L。④三酰甘油（triacylglycerol，TAG） ≥1.7 mmol/L。⑤確診2 型糖尿病或空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）≥6.1 mmol/L。另外選取同期的健康體檢者納入對照組（無MS 危險因素，n=80）。各組排除具有以下情況人群：①各種嚴重肝、腎、心血管疾病者。②長期服用激素、免疫抑制劑者。③近期有外傷或手術者。④妊娠及哺乳期者。收集患者年齡、性別、體質量指數（body mass index，BMⅠ）等資料。本研究經石河子大學醫學院第一附屬醫院醫學倫理委員會批準（倫理審查號：KJ2020-142-01），所有參與的患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集及生化檢測 所有研究對象均禁食12～14 h，晨起空腹抽取靜脈血2 管，每管約2 mL。一管為EDTA 抗凝管，備以后續DNA 及RNA 提取；另一管為真空采血管，經過混勻后9 000×g離心10 min，離心管收集上清液備用，然后均置于-80 ℃冰箱中凍存。使用全自動生化分析儀（AU5800，美國貝克曼公司）測定FPG、TAG、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol， LDL-C）、HDL-C，使用全自動電化學發光免疫分析儀（COBAS e 601，德國羅氏） 測定空腹胰島素（fasting serum insulin，FⅠNS）。使用穩態模型評估法來計算胰島素抵抗指數（homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-ⅠR），公式為HOMA-ⅠR=FⅠNS×FPG/22.5。

1.2.2 RT-PCR 方法檢測FRA-2mRNA 表達 TRⅠzol法提取RNA，后按照cDNA 第一鏈合成試劑盒（美國APExBⅠO 公司） 說明書合成cDNA 模板，進行PCR 擴增。反應條件為：94 ℃4 min，72 ℃2 min，然后94℃20 s、56 ℃30 s、72 ℃60 s，進行35 個循環。加入1 對內參（β-actin）的特異性引物，同時擴增內參DNA（引物序列見表1）。使用GelDoc EZ 全自動凝膠成像分析系統（美國UVB公司）和2-ΔΔCT法分析FRA-2mRNA相對表達水平。

1.2.3 MALDⅠ-TOF-MS法檢測FRA-2DNA 甲基化水平 取200 μL血液樣本，提取DNA，使用NanoDrop分光光度儀定量檢測基因組DNA 的濃度及純度，以保證其DNA 濃度＞50 ng/μL，純度［D（260 nm）/D（280 nm）］位于1.7～2.0 之間。依據EZ DNA 甲基化修飾處理試劑盒（D5001，美國Sequenom 公司）以及美國Sequenom 公司推薦的方式對基因組DNA 進行亞硫酸氫鹽修飾，反應條件為：95 ℃30 s，50 ℃15 min，進行20 個循環。PCR 擴增DNA，反應條件如下：94 ℃預熱4 min，72 ℃退火3 min，接下來45個循環（94 ℃20 s，56 ℃30 s，72 ℃1 min）。PCR產物在384-pad光譜芯片（美國Sequenom公司）上測定。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Tab 1 Primer sequences for PCR

使用MassARRAY 質譜儀（美國SEQUENOM公司）收集質譜圖，使用EpiTYPER v1.0.5 軟件生成各CpG 單元的甲基化數據。經由對比甲基化峰與非甲基化峰的強度來計算所檢測基因各CpG 單元相對的甲基化率。共檢測了10 個CpG 單元，分別為CpG 1、CpG 3、CpG 4.5、CpG 6.7、CpG 8、CpG 9.10、CpG 11、CpG 12.13.14、CpG 15.16.17、CpG 19。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0 軟件進行數據分析。符合正態分布的定量資料以±s表示，方差分析示3 組間年齡差異有統計學意義，余資料采用協方差分析以校正年齡對組間臨床指標的影響；非正態分布定量資料以M（Q1，Q3）表示，采用Kruskal-WallisH檢驗；每增加1個危險因素，FRA-2DNA甲基化水平變化量采用線性回歸分析；指標間相關關系采用Spearman 相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組間一般資料比較

Kruskal-WallisH檢驗顯示，MS 組年齡高于對照組及非MS 組（P＜0.05）。使用協方差分析校正年齡對組間臨床指標的影響后，發現MS 組BMⅠ、WC、DBP、SBP、FPG、TAG、TC、LDL-C、HOMA-ⅠR均高于對照組及非MS 組（P＜0.05），HDL-C 低于對照組及非MS組（P＜0.05）。結果見表2。

表2 3組間一般及臨床資料比較Tab 2 Comparison of general and clinical data among the three groups

2.2 組間FRA-2 mRNA表達水平比較

與對照組及非MS 組相比，MS 組FRA-2mRNA表達水平降低（均P=0.000）（圖1）。

圖1 3組間FRA-2 mRNA相對表達水平比較Fig 1 Comparison of relative expression levels of FRA-2 mRNA among the three groups

2.3 組間FRA-2 DNA甲基化水平比較

協方差分析結果（表3、圖2）顯示：與對照組相比，非MS 組及MS 組CpG 1（P=0.014，P=0.016）、CpG 3 （P=0.006，P=0.000）、CpG 12.13.14 （均P=0.000）、CpG 19（均P=0.000）甲基化水平上升；與非MS 組相比，MS 組CpG 4.5、CpG 6.7、CpG 8、CpG 9.10、CpG 15.16.17甲基化水平上升（均P=0.000）。

圖2 FRA-2 DNA甲基化水平聚類分層Fig 2 FRA-2 DNA methylation level clustering stratification

表3 各CpG單元DNA甲基化水平比較Tab 3 Comparison of DNA methylation levels in each CpG unit

2.4 FRA-2 DNA 甲基化水平與MS 危險因素個數的關系

以FRA-2DNA 甲基化水平（10 個CpG 單元的平均甲基化率）為因變量，以MS 的危險因素個數為自變量進行線性回歸分析。結果（圖3）顯示，MS 危險因素個數與FRA-2DNA 甲基化水平呈正相關（β=0.012，P=0.000），即危險因素每增加1 個，FRA-2DNA甲基化水平上升0.012%。

圖3 FRA-2 DNA甲基化水平與MS危險因素個數的關系Fig 3 Relationship between FRA-2 DNA methylation level and the number of MS risk factors

2.5 FRA-2 DNA 甲基化水平與MS 危險因素的相關性分析

Spearman 相關分析結果（表4）顯示，CpG 3、CpG 4.5、 CpG 6.7、 CpG 8、 CpG 9.10、 CpG 12.13.14、CpG 19 甲基化水平均與WC、SBP、DBP、FPG、TAG 呈正相關；CpG 1 和CpG 15.16.17 甲基化水平與WC、DBP、TAG 呈正相關；CpG 1、CpG 3、CpG 4.5、CpG 8、CpG 9.10、CpG 12.13.14、CpG 19甲基化水平與HDL-C呈負相關（均P＜0.05）。

表4 FRA-2 DNA甲基化水平與MS危險因素的相關性分析Tab 4 Correlation analysis between FRA-2 DNA methylation level and MS risk factors

2.6 FRA-2 DNA甲基化水平與mRNA表達的相關性分析

Spearman相關分析的結果（圖4）所示，FRA-2DNA甲基化水平（10個CpG單元的平均甲基化率）與FRA-2mRNA表達水平呈負相關（r=-0.607，P=0.000）。

圖4 FRA-2 DNA甲基化水平與mRNA表達水平的相關性Fig 4 Correlation between FRA-2 DNA methylation level and mRNA expression level

3 討論

DNA 甲基化是一種重要的修飾方式，可以調控基因表達，在不改變分子一級結構的前提下發揮重要的生物學作用，其與高血糖、高血壓等心血管疾病的危險因素增多有關［11］。既往研究［12］發現，FRA-2蛋白參與了糖脂代謝紊亂及MS 的發生。目前關于FRA-2mRNA及DNA甲基化表達水平與MS相關性的報道較少。

趙天明等［13］通過流行病學分析發現，隨年齡的增加MS 的患病率上升。本研究結果顯示，與對照組及非MS 組相比，MS 組年齡更高；可能是由于隨著年齡增加，機體器官功能有所減退，MS 危險因素的成分增加，患病概率增大。CHⅠURAZZⅠ等［14］研究顯示，MS 人群表現為中心性肥胖、高血壓、高血糖、高血脂及胰島素抵抗的特征，與對照組及非MS組比較，MS 組WC、DBP、SBP、FPG、TAG、TC、LDL-C、HOMA-ⅠR 上升，HDL-C 降低；我們的研究數據與該研究相似。

通過RT-PCR 對研究對象FRA-2mRNA 進行檢測發現，MS 組FRA-2mRNA 表達水平顯著低于對照組及非MS 組，提示MS 的發生發展可能與FRA-2mRNA 表達下調有關。SAMBLAS 等［4］的研究發現，甲基化參與肥胖人群代謝及循環紊亂，缺氧誘導因子3A（hypoxia inducible factor 3A，HIF3A）、胰島素樣生長因子結合蛋白3 （insulin-like growth factor binding protein-3，IGFBP-3）、固醇調節元件結合轉錄因子1 （sterol regulatory element binding factor 1，SREBF1）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、 晝夜節律鐘（clock circadian regulator，CLOCK）等基因的甲基化水平可作為預測和評估MS的重要標志。我們進一步用MALDⅠ-TOF-MS 對外周血中FRA-2DNA甲基化水平進行檢測。結果表明，與對照組相比，MS 組多個CpG 單元甲基化水平上升，可以推測在MS發生中，FRA-2DNA 高甲基化可能起到重要作用。相關分析結果顯示，FRA-2基因9 個CpG 單元甲基化水平與WC、DBP、TAG 呈正相關，7 個CpG 單元甲基化水平與SBP 及FPG 呈正相關，7 個CpG 單元甲基化水平與HDL-C 呈負相關；推測FRA-2可能通過DNA 高甲基化的形式參與血糖、血脂、血壓等的調節，進而參與MS 發生發展的過程。既往研究［15］發現，FRA-2與糖尿病患者的FPG、TG的調節有關；本研究結果與之相似。

此外，本研究還發現，FRA-2DNA高甲基水平與MS 人群SBP 及DBP 升高之間存在相關性；該結果與以往研究［12］不同，可能與納入研究對象危險因素個數的差異性或不同的遺傳背景有關。近年來，有研究［16-17］報道，DNA甲基化可通過影響腎素-血管緊張素-醛固酮系統（renin-angiotensin-aldosteronesystem，RAAS）參與高血壓的發生，但FRA-2是否經該通路發揮作用有待進一步研究。全貞玉等［18］認為，MS的發生及嚴重程度與危險因素個數有關。本研究通過線性分析發現，危險因素每增加1個，FRA-2DNA甲基化水平上升0.012%，提示MS 患者FRA-2基因甲基化程度可能受危險因素個數的影響。XⅠE 等［19］研究發現，外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中，DNA 甲基化水平對mRNA 表達有調節作用，DNA可通過高甲基化的方式下調mRNA的表達，從而參與疾病的發生。本研究發現FRA-2DNA甲基化水平與mRNA表達呈負相關，提示FRA-2基因在MS 中可能具有相似的致病機制，但其具體的分子機制及信號通路，還需要進一步探索。

綜上所述，本研究發現FRA-2基因甲基化水平與MS發生具有一定的相關性，DNA 甲基化水平增高從而下調mRNA 表達可能在MS 發生中發揮作用。未來需要設計更大樣本量的多中心研究及前瞻性研究，以明確FRA-2與MS 發生的因果關系及FRA-2參與MS發生的機制。