Rhopaladins類似物對宮頸癌Hela細胞增殖、凋亡的影響及其機制

王彥嬌，曾小華，柯麗娜，朱秀蓮，陳琴華，李斌

1 錦州醫科大學國藥東風總醫院研究生培養基地，湖北十堰442008；2 湖北醫藥學院附屬國藥東風總醫院婦產科；3 湖北醫藥學院藥學院武當特色中藥研究湖北省重點實驗室

宮頸癌是女性生殖系統惡性腫瘤，好發于子宮頸外口柱狀上皮與鱗狀上皮交接處，全球每年宮頸癌新發病例接近53萬例，每年宮頸癌的死亡人數超過25 萬，而且年輕女性患者所占比例越來越多，嚴重影響女性的心理健康和生活狀況［1］。宮頸癌常用的治療方法包括手術、放療和化療等，雖取得一定的治療效果，但對于晚期或復發宮頸癌治療效果欠佳，研發新的宮頸癌藥物是目前急需解決的問題。近年來，臨床醫師常采用海洋藥物來控制宮頸癌，是研究和治療此病的新思路［2］。Rhopaladins A～D 是從沖繩海洋被膜植物Rhopalaea sp 中分離出的新的雙吲哚生物堿，對與宮頸癌預后相關的癌基因CerbB-2有顯著的抑制作用［3-6］。本課題組前期化學合成的Rhopaladins 類似物（簡稱RPDPB），分子結構與Rhopaladins 類似，體外實驗證實RPDPB 具有抑制宮頸癌Caski 細胞增殖并促進其凋亡的作用［7-8］。但前期實驗關于RPDPB 對宮頸癌Hela 細胞的作用及可能的作用機制少有探討。2020 年8 月—2021 年4 月，我們觀察了RPDPB對宮頸Hela細胞增殖、凋亡的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株、RPDPB 及主要試劑 Hela 細胞（宮頸癌細胞，貨號CL-0101），購自中國典型培養物保藏中心。RPDPB 由武當特色中藥研究湖北省重點實驗室提供。MEM 培養基（Procell），FBS（CellMax 賽澳美），二甲基亞砜（Mpbio 公司），0.1%胰酶（Sigma公司），細胞計數試劑盒-8（CCK-8），細胞凋亡試劑盒（rh Annexin V/FITC Kit，MultiSciences 公司），TRIzol試劑（Invitrogen 公司），PCR 引物（上海生工生物有限公司合成），mRNA 逆轉錄試劑盒（Fermentas公司），SYBR Green Realtime PCR Master Mix（Toyobo公司），miScript SYBR Green PCR Kit、miScript ⅡRT Kit（Qiagen 公 司），Wnt1、Wnt2b、beta Catenin 抗 體（Abcam公司），GAPDH抗體和HRP標記的山羊抗兔二抗（Antgene公司）。

1.2 Hela 細胞培養 Hela 細胞培養于10%FBS 和1%青霉素—鏈霉素的MEM 培養基中，置于37 ℃、含5%CO2及飽和濕度細胞培養箱中，每周換液2～3次。

1.3 Hela 細胞分組、RPDPB 的給予方法及細胞增殖抑制率測算 采用CCK-8 法。取對數生長期HeLa 細胞，按1.5×104個細胞/孔，接種于96 孔板，置于37 ℃、含5%CO2培養箱中過夜。將細胞分為實驗組、對照組、空白組，實驗組又分為不同劑量組，不同 劑 量 組 分 別 以3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L RPDPB 干預，對照組只加DMSO 培養液，空白組加入不含細胞的MEM 培養液，每組均設6 個復孔。分別于24、48、72 h 后終止培養，各孔均加入110 μL 的CCK-8 試劑混合液，混勻，繼續培養1 h，酶標儀檢測450 nm 處的吸光度（OD）值。計算細胞增殖抑制率，細胞活力（%）=（實驗組OD值－空白組OD 值）/（對照組OD 值－空白組OD 值）×100%，細胞增殖抑制率（%）=1－細胞活力（%）。48 h IC50值為17.63 μmol/L，相同方法檢測RPDPB對肝細胞（LO2）的毒性，48 hIC50為95.20 μmol/L，故選取后續實驗藥物濃度為12.5、50、100 μmol/L，藥物作用時間為48 h。

1.4 Hela 細胞分組、RPDPB 的給予方法及細胞凋亡率測算 采用AnnexinV-FITC/PI 雙染法。取對數生長期細胞，按1.0×106個細胞/mL，接種于6 孔板，置于培養箱中過夜，待細胞貼壁后，將細胞分為實驗組和對照組，實驗組又分為不同劑量組，不同劑量組分別以12.5、25、50 μmol/L RPDPB 混合液刺激，對照組不予處理，均設3 個復孔。培養48 h 后，收集上清和細胞，PBS洗2次，棄上清，Binding Buffer液重懸細胞，Annexin V-FITC和PI液染色，室溫避光反應5 min，1 h 內流式細胞儀檢測細胞凋亡。流式細胞技術檢測早期凋亡細胞群：Annexin-V（+），PI（-）；晚期凋亡細胞群或壞死細胞群：Annexin-V（+），PI（+）；機械損傷細胞群：Annexin-V（-），PI（+）；正常細胞群：Annexin-V（-），PI（-）。計算細胞凋亡率，早期凋亡率（%）=早期凋亡細胞數/總細胞數×100%，晚期細胞凋亡率（%）=晚期凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.5 Hela 細胞分組、RPDPB 的給予方法及人乳頭瘤病毒18 E6（HPV18 E6）、人乳頭瘤病毒18 E7（HPV18 E）7、WNT2B、β-catenin mRNA 和miR-145 RNA 檢測 采用實時定量PCR 法。實驗分組及各組干預方法與“1.4”相同。TRIzol法提取總RNA，逆轉錄后再PCR 擴增。依據說明書操作，GAPDH mRNA、WNT2B mRNA、β-catenin mRNA 反應條件為95 ℃預變性60 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，40 個循環。 E6、E7 mRNA 反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，40 個循環。U6 和miR-145 RNA 反應條件：95 ℃預變性15 m，94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，40 個循環。數據分析采用2-ΔΔCt法，實驗重復3次，每次設置3個復孔。GAPDH 引物序 列：F-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA，R-GCGCCCAATACGACCAAATC；HPV18 E6 引物序列：FCTGCAATGTTTCAGGACCCA，R-TCATGTATAGTTGTTTGCAGCTCTGT；HPV 18 E7 引物序列：F-GAGGAGGAGGATGAAATAGATGGT，R-CACTTGCAACAAAACGTTACAATATTG；wnt2b 引 物 序 列：FAAACCCTGAAGAGCCCAAGCAATG，R-AGAAAGAGTGAAAGGAGACAGCAGTG；β-catenin引物序列：F-TCTGAGGACAAGCCACAAGATTACAAG，R-TCAGCAGTCTCATTCCAAGCCATTG；U6 引物序列：FGTGCTCGCTTCGGCAGCACATAT；miR-145-5p 引物序列：F-GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT。

1.6 Hela 細胞分組、RPDPB 的給予方法及WNT2B、β-catenin 蛋白檢測 采用Western blot 法。實驗分組及各組干預方法與“1.4”相同。加入裂解液、蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑裂解細胞，抽提蛋白，BCA 法定量，上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳結束將蛋白濕轉至0.45 μm 的PVDF 膜上，結束后用5%的脫脂牛奶封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3 次，加入二抗室孵育2 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min，ECL 法曝光顯色。用Image Pro Plus6.0軟件進行灰度值分析。

1.7 統計學方法 采用SPSS23.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以-x±s表示，比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組不同時點細胞增殖抑制率 細胞增殖抑制率見表1。由表1可知，與對照組比較，實驗組增殖抑制率增加，且呈時間和劑量依賴性（P均＜0.05）。

表1 兩組不同時點OD值和細胞增殖抑制率（%）

2.2 各組早期細胞凋亡率、晚期細胞凋亡率 早期細胞凋亡率、晚期細胞凋亡率見表2。由表2 可知，與對照組比較，實驗組早期細胞凋亡率和晚期細胞凋亡率增加，且呈劑量依賴性（P均＜0.05）。

表2 兩組早期細胞凋亡率、晚期細胞凋亡率（%，±s）

表2 兩組早期細胞凋亡率、晚期細胞凋亡率（%，±s）

組別實驗組12.5 μmol/L 25 μmol/L 50 μmol/L對照組早期細胞凋亡率9.05±0.24 18.7±0.46 24.2±0.40 4.90±0.18晚期細胞凋亡率10.90±0.35 20.73±0.31 30.2±0.61 6.76±0.17

2.3 兩 組 細 胞HPV18 E6 mRNA 、HPV18 E7 mRNA、miR-145 RNA、WNT2B mRNA、β-catenin mRNA 相對表達量比較 細胞HPV18 E6 mRNA、HPV18 E7 mRNA、miR-145 RNA、WNT2B mRNA、β-catenin mRNA 相對表達量見表3。由表3 可知，與對照組比較，實驗組HPV18 E6 mRNA、HPV18 E7 mRNA 、WNT2B mRNA 、β -catenin mRNA 相對表達量降低，miR-145 RNA 相對表達量升高，且呈劑量依賴性（P均＜0.05）。

表3 兩組細胞HPV18 E6 mRNA、HPV18 E7 mRNA、miR-145 RNA、WNT2B mRNA、β-catenin mRNA相對表達量（±s）

表3 兩組細胞HPV18 E6 mRNA、HPV18 E7 mRNA、miR-145 RNA、WNT2B mRNA、β-catenin mRNA相對表達量（±s）

組別實驗組12.5 μmol/L 25 μmol/L 50 μmol/L對照組HPV18 E6 mRNA 0.79±0.10 0.52±0.04 0.26±0.15 1.04±0.03 HPV18 E7 mRNA 0.78±0.04 0.54±0.10 0.30±0.06 1.23±0.22 miR-145 RNA 1.37±0.08 1.99±0.17 2.73±0.33 1.00±0.09 WNT2B mRNA 0.72±0.08 0.45±0.10 0.24±0.05 1.01±0.16 β-catenin mRNA 0.86±0.05 0.52±0.10 0.31±0.02 1.00±0.01

2.4 兩組細胞WNT2B、β-catenin 蛋白相對表達量比較 細胞WNT2B、β-catenin 蛋白相對表達量見表4。由表4 可知，與對照組比較，實驗組WNT2B、β-catenin 蛋白相對表達量降低，且呈劑量依賴性（P均＜0.05）。

表4 兩組細胞WNT2B、β-catenin蛋白相對表達量（±s）

表4 兩組細胞WNT2B、β-catenin蛋白相對表達量（±s）

組別實驗組12.5 μmol/L 25 μmol/L 50 μmol/L對照組WNT2B蛋白0.42±0.01 0.38±0.01 0.29±0.01 0.53±0.02 β-catenin蛋白0.33±0.03 0.20±0.03 0.03±0.01 0.72±0.03

3 討論

宮頸癌是好發于子宮頸外口柱狀上皮與鱗狀上皮交接處的女性生殖系統惡性腫瘤，主要以宮頸接觸性出血陽性或不規則陰道流血陽性、陰道排液為主，不同年齡段患者陰道流血表現略有差異，早期患者往往無自覺癥狀，多在體檢時發現。宮頸癌是全世界威脅女性健康最常見的惡性腫瘤，疾病進展是制約其療效、影響預后的重要因素之一。宮頸癌臨床上主要以手術治療和放療為主，化療為輔。對于晚期患者和復發轉移的患者來說，主要以全身化療為主，但因為多種因素影響，目前臨床上患者的化療不太理想。

近年來，海洋生物堿治療宮頸癌的研究逐漸成為熱點，海洋生物堿具有抗病毒、抗炎及抗腫瘤等作用［9］，其中RPDPB 是通過化學合成的海洋生物堿吡咯烷酮類衍生物，同樣具有抗腫瘤作用。前期實驗發現，RPDPB 中部分化合物顯著抑制宮頸癌和肝癌細胞增殖［10］。體外研究證實，RPDPB 具有抑制宮頸癌Caski 細胞增殖并促進其凋亡的作用。本研究發現，與對照組比較，實驗組宮頸癌Hela 細胞增殖率增加，呈時間及劑量依懶性，細胞凋亡率上升，呈劑量依懶性，提示RPDPB可以抑制宮頸癌Hela細胞增殖，并促進其凋亡的作用。

持續性高危型HPV 感染是導致宮頸癌的必然原因，其中HPV16、18 導致了超過75%的子宮頸癌病例［11］。MALLA 等［12］和PAL 等［13］發現，E6 和E7 癌蛋白是驅動宮頸癌進展的生物標志物，其分別通過干擾p53 和pRb 來影響致病進程（癌細胞增殖、細胞凋亡、轉移和耐藥性，早期癌基因介導的信號通路）。最新研究［12］發現，針對E6 和E7 的靶向治療已被證明在集中去除異常繁殖的惡性細胞方面非常有效。宮頸癌的靶向治療藥物的研究成為治療宮頸癌的重點。前期實驗發現，RPDPB 可抑制宮頸癌Caski 細胞增殖，并促進細胞凋亡，機制可能與E6/E7 的表達下降有關［8-9］。本研究顯示，與對照組比較，實驗組E6/E7 mRNA相對表達量下降，且呈劑量依賴性，這提示RPDPB 可能通過抑制E6/E7 表達，進而抑制宮頸癌HeLa細胞增殖，促進細胞凋亡。MICHAEL 等［14］首次發現，miR-145 在結直腸腫瘤中表達上調。miR-145 是一種腫瘤抑制因子，可以抑制各種癌癥，如前列腺癌、胃癌、子宮內膜癌和膀胱癌［15-18］。研究［19］表明，宮頸癌細胞中miR-145 與E6/E7 表達呈負相關，HPV E6/E7 低表達時miR-145 高表達，宮頸癌細胞的生長與進展明顯受抑［20］。過表達的miR-145 可抑制宮頸癌細胞的活力、遷移和侵襲［21］。而且miR-145 高表達時，宮頸癌患者的生存時間越長和預后情況越好［22］。本研究發現，實驗組miR-145 RNA 相對表達量升高，且呈劑量依賴性。此與LU 等［19］和SHI 等［20］研究結果一致，提示RPDPB 可能通過抑制E6、E7 mRNA 表達，進而上調miR-145 RNA 表達，達到調控Hela 細胞生長的目的。另有研究［18，23-24］發現，miR-145-Wnt/β-catenin 信號通路在膀胱癌、大腸癌及乳腺癌的進展中均發揮了重要作用。研究證實，Wnt2b 是miR-145 的靶基因。在宮頸癌中，當miR-145 相對高表達時，導致其下游靶向基因Wnt2b 表達下降，同時遏制β-catenin表達，最終使Wnt/β-catenin 通路失活，抑制宮頸癌細胞增殖、促進凋亡、抑制遷移和侵襲［25］。WANG等［26］發現，E6/E7 癌蛋白直接或間接與β-catenin 相互作用，激活Wnt/β-catenin 信號通路，最終促進宮頸癌發生。而且β-catenin 表達量越高，腫瘤的惡性程度越高，遷移和侵襲能力越強，患者預后越差［27］。本研究發現，與對照組比較，實驗組WNT2B、β-catenin 蛋白相對表達量降低，且呈劑量依賴性。此結果與Li等［25］研究結果相同。

總之，RPDPB可抑制宮頸癌Hela細胞增殖，并誘導細胞凋亡，呈時間和劑量依懶性，最佳抑制時間為48 h，最佳抑制濃度為17.63 μmol/L，作用機制可能是其通過下調HPVE6/E7 mRNA表達，導致miR-145 RNA 表達上調，進而抑制下游WNT2B/β-catenin 通路中WNT2B、β-catenin mRNA和蛋白表達。