利用體外替代模型評價梔子黃色素的發育毒性

康陳萍 肖倩倩 劉青云 郝衛東

梔子黃(gardenia yellow)，主要成分為藏花素和藏花酸，是以梔子果實為原料經乙醇浸提法提取、純化而成的天然色素[1]。梔子黃色素易溶于水、乙醇等極性溶劑，對金屬離子、酸、堿和熱等穩定，呈鮮艷的黃色，具有較好的著色性能[2-3]。梔子黃色素在中國和日本等亞洲國家已作為食品添加劑廣泛使用。中國《食品安全國家標準——食品添加劑使用標準》(GB 2760-2014)規定梔子黃可用于果汁(味)型飲料、配制酒、糕點上彩妝、冰棍、雪糕、膨化食品、果凍、面餅、糖果和栗子罐頭等[4]。

梔子黃色素作為天然食用色素在中國廣泛使用，但其安全性問題尚存在爭議。研究表明，含較高濃度藏花素的梔子黃色素(含量92%)對大鼠的急性經口LD50為3.16～4.64 g/kg[5]；含較低濃度藏花素的梔子黃色素(含量44.82%)對大鼠的急性經口LD50>15 g/kg[6]。90天亞慢性毒性實驗表明，3 000 ppm的梔子黃色素粉劑使大鼠肝細胞內出現脂滴增大增多的趨勢[5]；可引起腎小管上皮色素沉著，主要作用靶器官為肝臟和腎臟，其NOAEL為0.5 g/kg[7-8]；1.5 g/kg及以上劑量染毒動物出現體重減輕、胃腸道功能障礙、肝腎毒性等炎癥反應和局部損傷[6]。

有關梔子黃色素的發育毒性的研究尚未見報道。本研究參考歐洲替代方法驗證中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM)的胚胎干細胞試驗(DB-ALM Protocol n°113)、大鼠植入后全胚胎培養試驗(DB-ALM Protocol n°123)和微團培養試驗(DB-ALM Protocol n°122)三種發育毒性的體外替代模型[9]，評價食用色素梔子黃潛在的體外胚胎發育毒性，以補充梔子黃色素的毒理學資料。

材料與方法

一、受試物

受試物梔子黃E500，藏花素含量46.11%。購自河南中大恒源生物科技股份有限公司。

二、實驗動物與細胞株

SPF級SD大鼠(雄性280～300 g，雌性220～240 g)，購自北京市維通利華實驗動物技術有限公司。動物飼養于屏障環境，室溫20～25℃，濕度50%～60%，12 h明暗周期，自由飲水和攝食。適應性飼養5 d后將雌、雄SD大鼠于18:00按2:1比例合籠，次日7:00進行陰道涂片檢查，鏡下可見精子視為受孕，并記為受孕0 d。取受孕9.5 d的胚胎進行全胚胎培養，取受孕13 d的胚胎進行微團培養。實驗方案由北京大學生物醫學倫理委員會實驗動物福利倫理分會審查批準。

小鼠胚胎干細胞系ES-D3[D3](ATCC?CRL-11632TM)、小鼠胚胎成纖維細胞BALB/3T3克隆A31細胞系(ATCC?CCL-163TM)及小鼠胚胎成纖維細胞系STO(ATCC?CRL-1503TM)均購自美國模式培養物集存庫(ATCC)。

三、胚胎干細胞試驗模型

1.細胞培養：STO細胞及BALB/3T3細胞在高糖DMEM完全培養基中傳代培養。ES-D3細胞日常培養于Knockout DMEM完全培養基，需以STO細胞為飼養層進行培養，以獲取其維持未分化狀態所需的細胞因子。以上細胞均培養于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養箱。

2. ES-D3及BALB/3T3細胞毒性測試：取與STO飼養層分離后的ES-D3細胞懸液或BALB/3T3細胞懸液，以每孔500個細胞的密度接種于96孔細胞培養板，染毒7 d后以MTT法進行細胞毒性測試。梔子黃終濃度為0、7.8、15.6、31.3、62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0 μg/mL。每個濃度設置6個復孔，試驗平行重復3次。

3. ES-D3細胞分化測試：取與STO飼養層分離后的ES-D3細胞懸液，以每滴500個細胞、30 μl/滴的量點種于100 mm直徑培養皿蓋中，每蓋接種50-60滴，將皿蓋輕輕翻轉倒扣于培養皿上進行懸滴培養。3 d后用染毒液將皿蓋上的擬胚體(embryoid bodies, EBs)轉移至60 mm直徑細菌培養皿中進行懸浮培養。2 d后將染毒液以1 ml/孔的量加入24孔細胞培養板中，將EBs轉移至孔板中央進行貼壁培養。5 d后于相差顯微鏡下觀察，有心肌搏動者可認為胚胎干細胞分化為心肌細胞。對照組心肌搏動率記為100%(對照組初始心肌搏動率須大于87.5%)。

參照ECVAM關于胚胎干細胞培養模型的指南，以陽性物5-FU建立胚胎干細胞培養模型。依據細胞毒性測試的結果將梔子黃終濃度設定為0、15.6、31.3、62.5、125.0、250.0 μg/mL。

4.發育毒性預測：根據560nm處吸光度值計算梔子黃抑制50%的ES-D3及BALB/3T3細胞增殖時的濃度IC50-D3及IC50-3T3。根據各組心肌搏動率計算梔子黃抑制50%的ES-D3細胞分化的濃度ID50。胚胎干細胞試驗模型的發育毒性預測模型包括三個判別方程(表1)。若方程I的值高于方程II和方程III，化學物判定為無發育毒性化學物；若方程II的值高于方程I和方程III，化學物判定為弱發育毒性化學物；若方程III的值高于方程I和方程II，化學物判定為強發育毒性化學物。

表1 胚胎干細胞試驗模型的發育毒性預測模型Table 1 Prediction model of developmental toxicity in embryonic stem cell test

四、全胚胎培養試驗

受孕9.5 d SD大鼠，乙醚麻醉后處死，無菌環境中于體視顯微鏡下分離胚胎。挑選含3～5個初始體節、外形飽滿的健康胚胎，隨機分組，每組至少7只，于37℃預溫、含相應濃度受試物的即刻離心血清(100%大鼠血清、56℃滅活30 min、0.22 μm過濾、-20℃保存)中進行旋轉培養。48 h后根據Brown′s評分法(表2)對胚胎進行功能及形態學評分。

表2 Brown′s全胚胎培養形態學評分標準Table 2 Brown′s morphological scoring criteria in whole embryo culture test

根據ECVAM全胚胎培養模型的建議，若1 000 μg/mL受試物無明顯致畸效應，全胚胎培養模型可認定其為無發育毒性物質。本研究中梔子黃色素濃度為0和1 000 μg/mL。

五、微團培養模型

1.微團培養：受孕13 d SD大鼠，乙醚麻醉后處死，取出子宮將胚胎從蛻膜團中分離，挑選含40～45個體節的健康胚胎，取其肢芽制成單細胞懸液，調整細胞濃度為2×107個/mL，于96孔細胞培養板每孔正中央點種5 μL，待細胞貼壁后每孔補足200 μL含相應濃度受試物的Ham′s F-12培養液，于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中連續培養5 d。

參照ECVAM關于微團培養模型的指南，以陽性物5-FU建立微團培養模型；梔子黃的終濃度為0.0、3.1、6.3、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0、1000.0 μg/mL。每個濃度設置6個復孔，試驗平行重復3次。

2. 微團細胞增殖及分化檢測：經中性紅染色后，活細胞將主動攝取中性紅染料，并在酸性條件下呈粉色，其顯色程度與活細胞數呈正比。染毒結束后，以0.005%中性紅染色3 h后固定細胞30 min，以酸性乙醇提取60 min后于540 nm測定吸光度值以檢測其細胞增殖能力。經阿利新藍染色后，軟骨細胞內的酸性蛋白多糖將呈現藍色，其顯色程度與軟骨細胞數目呈正比。以 1%阿利新藍室溫染色過夜，6 mol/L鹽酸胍提取2 h后于620 nm測定吸光度值以檢測其細胞分化能力。

3. 發育毒性預測：根據中性紅染色測定的吸光度值，計算50%細胞增殖活性被抑制時的濃度(IC50)；根據阿利新藍染色的吸光度值計算50%細胞分化及集落形成受抑制的濃度(ID50)。微團培養模型的發育毒性預測模型包括三個判別方程(表3)。若方程I的值高于方程II和方程III，化學物判定為無發育毒性化學物；若方程II的值高于方程I和方程III，化學物判定為弱發育毒性化學物；若方程III的值高于方程I和方程II，化學物判定為強發育毒性化學物。

表3 微團培養模型的發育毒性預測模型Table 3 Prediction model of developmental toxicity in micromass test

六、統計學分析

采用SPSS 26.0數據統計處理分析軟件對數據進行分析。當數據滿足正態分布和方差齊性時，采用單因素方差分析(one way ANOVA)并進行Dunnett-t法兩兩比較。當不滿足正態分布或方差不齊時，采用Mann-Whitney U檢驗。采用Linear-by-Linear Association法進行劑量相關趨勢性檢驗。設定統計學檢驗水準α=0.05，P<0.05時差異有統計學意義。各培養模型中的IC50及ID50使用GraphPad Prism 7 對數模型進行擬合計算。

結 果

一、胚胎干細胞試驗評價梔子黃色素的體外發育毒性

1.胚胎干細胞試驗模型驗證：將5-FU對ES-D3及BALB/3T3細胞毒性、對ES-D3細胞分化的結果，經GraphPad Prism 7軟件擬合計算，其IC50-3T3為122.7 ng/mL，IC50-D3為84.3 ng/mL，ID50為26.6 ng/mL。代入胚胎干細胞試驗模型的發育毒性預測判別公式得出：Function Ⅰ=-28.56，Function Ⅱ=-14.33，Function Ⅲ= 0.67，Function Ⅲ的值>Function Ⅰ和Function Ⅱ，評價5-FU為強發育毒性物質，符合該預測模型的建立標準，證明該模型建立成功。

2.胚胎干細胞試驗模型評價梔子黃色素的發育毒性：如圖1D和1E所示，250 μg/mL以上濃度梔子黃可對BALB/3T3細胞增殖產生明顯影響，其IC50-3T3為236.57 μg/mL；62.5 μg/mL以上濃度的梔子黃可抑制ES-D3細胞的增殖，其IC50-D3為231.87 μg/mL。

如圖1F所示，62.5 μg/mL的梔子黃可明顯抑制ES-D3細胞向心肌細胞分化，經GraphPad Prism 7軟件進行對數曲線擬合，計算出梔子黃對ES-D3細胞分化的ID50為94.84 μg/mL，將擬合所得IC50-3T3、IC50-D3及ID50代入胚胎干細胞試驗預測模型的發育毒性預測判別公式得出：Function Ⅰ=3.87，Function Ⅱ=6.26，Function Ⅲ=-6.60，Function Ⅱ的值大于Function Ⅰ和Function Ⅲ，評價梔子黃為弱發育毒性物質。

圖1 5-FU和梔子黃色素對BALB/3T3和ES-D3細胞的影響Figure 1 Effects of 5-FU and gardenia yellow pigment on BALB/3T3 and ES-D3(A)、(B)和(C)：5-FU對BALB/3T3和ES-D3細胞增殖的影響以及對ES-D3細胞分化的影響；(D)、(E)和(F)：梔子黃色素對BALB/3T3和ES-D3細胞增殖的影響以及對ES-D3細胞分化的影響。*P<0.05，**P<0.01。(A), (B) and (C):Effects of 5-FU on cell proliferation of BALB/3T3 and ES-D3 and cell differentiation of ES-D3, respectively; (D), (E) and (F):Effects ofgardenia yellow pigment on cell proliferation of BALB/3T3 and ES-D3 and cell differentiation of ES-D3, respectively. *P<0.05, **P<0.01。

二、全胚胎培養試驗評價梔子黃色素的發育毒性

根據ECVAM的建議，在全胚胎培養試驗中若1000 μg/mL受試物無明顯致畸效應，全胚胎培養模型可認定其為無發育毒性物質。本研究中此劑量下梔子黃對胚胎卵黃囊直徑、頂臀長、頭長、體節數及形態學評分均無明顯影響，故可認為梔子黃為無發育毒性物質。

表4 梔子黃對胚胎各系統發育的影響Table 4 Effect of gardenia yellow pigment on

三、微團培養試驗評價梔子黃色素的發育毒性

1.大鼠微團培養模型的建立與驗證：將5-FU對微團細胞增殖及分化影響的結果，經GraphPad Prism 7軟件進行對數曲線擬合計算，其IC50為109.10 ng/mL，ID50為90.85 ng/mL，代入微團培養模型的發育毒性預測判別公式得出：Function Ⅰ=-16.01，Function Ⅱ=-14.33，Function Ⅲ=-0.14，Function Ⅲ的值大于Function Ⅰ和Function Ⅱ，評價5-FU為強發育毒性物質，符合該預測模型的建立標準，證明該模型建立成功。

2.微團培養模型評價梔子黃色素的發育毒性：如圖2B所示，100 μg/mL及以上濃度的梔子黃可顯著降低大鼠肢芽細胞增殖能力及分化為軟骨細胞的能力，其IC50為175 μg/mL。隨梔子黃濃度升高，微團形成數目逐漸減少，軟骨細胞阿利新藍著色程度逐漸降低，單個微團體積逐漸減小，細胞遷移距離逐漸縮短，至400 ng/mL組已無微團形成(圖3)。

圖2 5-FU和梔子黃色素對肢芽細胞增殖活性和分化的影響Figure 2 Effects of 5-FU and gardenia yellow pigment oncell proliferation and differentiation of limb bud cells**：P<0.01；#：P<0.05，##：P<0.01。**:P<0.01; #:P<0.05, ##:P<0.01.

圖3 梔子黃對肢芽微團形成的影響Figure 3 Effect of gardenia yellow pigment on limb bud micromass formation

經GraphPad Prism 7軟件進行對數曲線擬合計算，其ID50為152 μg/mL，代入微團培養模型的發育毒性預測判別公式得出：Function Ⅰ= 5.02，Function Ⅱ=5.15，Function Ⅲ=-4.28，Function Ⅱ的值大于Function Ⅰ和Function Ⅲ，評價梔子黃為弱發育毒性物質。

討 論

梔子黃色素具有較好的著色性能，且研究表明具有抗疲勞、抗氧化、抗炎及降血糖作用等[10-13]。在我國和日本等周邊國家，梔子黃色素已作為食品添加劑廣泛使用。但梔子黃色素的食用安全性問題尚存在爭議。缺乏對其發育毒性的研究。本研究旨在通過體外發育毒性預測模型評價梔子黃色素的胚胎發育毒性，補充其毒理學資料，為確定梔子黃接觸的健康指導值、開展風險評估奠定基礎。

全胚胎培養、微團培養和胚胎干細胞試驗模型為ECVAM驗證的發育毒性體外替代方法，具有耗時短、花費少，靈敏度高等特點，更符合動物實驗的福利倫理及“3R”原則，即減少(Reduction)、優化(Refinement)、替代(Replacement)，可用于潛在胚胎發育毒性的篩選試驗。胚胎干細胞試驗依據受試物對干細胞分化過程的影響判斷受試物在胚胎植入前階段的潛在發育毒性；全胚胎培養可以完整的模擬生物體植入后胚胎器官形成早期(孕9.5至11.5 d)對受試物的暴露過程；微團培養從肢芽細胞向軟骨細胞分化能力的角度，判斷受試物是否具有中晚期(孕13天至18 d)發育毒性[14]。根據胚胎干細胞預測模型判斷梔子黃為弱發育毒性物質。但ECVAM的指南中提示，若IC50和ID50的比值大于2，說明該物質具有特異的潛在致畸性；若比值小于2，說明該物質的發育毒性可能是由于細胞毒性引起的。在胚胎干細胞試驗模型中，梔子黃對ES-D3細胞的IC50為231.87 μg/mL，遠高于ID50(94.84 μg/mL)，提示梔子黃色素可能具有潛在的特異性胚胎發育毒性，且梔子黃對植入前胚胎干細胞的毒性效應更值得關注。

本研究發現，1 000 μg/mL梔子黃色素對大鼠植入后胚胎生長和發育無明顯影響，依據ECVAM指南建議，可判定其在胚胎器官形成期無發育毒性。

梔子黃色素可抑制肢芽細胞增殖活性，降低其分化為軟骨細胞的能力，對肢芽細胞的生長、遷移及再聚合具有一定影響。本研究發現，100 μg/mL梔子黃色素即可降低肢芽細胞的增殖能力及分化能力，對微團形成數目及形態產生影響，依據ECVAM微團培養預測模型判定其為弱發育毒性物質。但其IC50和ID50值極為接近，表明梔子黃色素在大鼠胚胎發育中晚期的肢芽細胞分化阻滯效應可能是由細胞毒性引起的。

梔子黃色素的主要活性成分為藏花素及藏花酸，但同時也含有綠原酸、多酚類物質黃酮及環烯醚萜苷類物質梔子苷等成分，此為導致梔子黃色素發生綠變的主要原因[15-16]。本研究中所用梔子黃色素為混合物，含藏花素46.11%、梔子苷0.03%。因此，梔子黃色素引起胚胎發育毒性的具體原因尚需進一步實驗確定。

綜上，可初步認為梔子黃屬弱發育毒性物質。但由于本研究采取的三種替代方法均為體外試驗，不能分析母體代謝、母體-胎兒間相互作用等影響，且ECVAM對發育毒性體外替代方法的驗證也認為替代方法在強發育毒性化學物的判斷上準確性較好，但不能準確判別弱發育毒性化學物和無發育毒性化學物。因此，梔子黃色素的發育毒性還需要更多的實驗進一步確認。