轉運基因對大腸桿菌利用木糖產L-乳酸的影響

劉汝婷， 劉 棗， 王金華， 高 娃

(1 湖北工業大學生物工程與食品學院， 湖北 武漢 430068；2 發酵工程教育部重點試驗室，湖北 武漢 430068; 3 工業發酵湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430068)

乳酸中L-乳酸是廣泛存在和使用的物質，大多運用于食品、化妝品、制藥、紡織和化學領域[1-2]。目前，L-乳酸的應用已經擴展到可降解塑料工業。其中的聚乳酸(PLA)可作為生物降解和生物相容的高分子材料[3-4]。近年，人們環保意識不斷提高，對綠色包裝產品的需求量增大，驅動了聚乳酸(PLA)的大量生產[3]。木質纖維素在自然界廣泛存在，其水解液含有大量五碳糖和六碳糖，主要有葡萄糖和木糖[5-7]。纖維素生物質是目前最豐富的非食物資源，是L-乳酸發酵的潛在底物原料，既可避免與民爭糧的局面[8-9]，還可解除發酵過程中葡萄糖對其他碳源利用抑制問題[10]。為進一步削弱葡萄糖效應對五碳糖的阻遏，通過基因工程技術對大腸桿菌進行遺傳改造。除了與磷酸烯醇式丙酮酸-糖類磷酸轉移酶系統(PTS)[11]密切相關，葡萄糖效應還與甲基半乳糖苷轉運系統mglB、半乳糖轉運系統galP等非PTS系統相關。江吉雄等[12]通過敲除mglB和galP基因，降低了混合糖發酵D-乳酸中的葡萄糖效應，使發酵周期縮短了約40%左右，轉化率提高了2.30%；許瓊丹等[13]通過敲除ptsG和mglB基因，也降低了混合糖發酵乙醇中的葡萄糖效應，使發酵周期縮短了約36%左右，轉化率提高了5.80%。

基于此，本研究以WL210為出發菌株。該菌株可高效利用葡萄糖產L-乳酸，通過RED同源重組技術構建mglB基因缺陷菌株WL220，mglB/galP雙基因缺陷菌株WL230，以減弱葡萄糖阻遏效應，提高混合糖中木糖的利用率，為采用基于木質纖維素等可再生原料高效生產L-乳酸提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株與質粒本文所用的菌株和質粒見表1。

表1 本研究所用的菌株和質粒

1.1.2化學試劑與儀器CaCl2·2H2O、L-阿拉伯糖，國藥集團化學試劑有限公司；DL5000DNAMarker,PCRMasterMix，美國Fermentas公司；10×TE溶液、氨芐青霉素、卡那霉素，浙江Mersco公司；PCR引物合成，上海生工生物工程技術服務有限公司。

MicroPluser電轉儀(美國Bio-Red公司)，MycyclerPCR儀(美國GC公司)，Waterse2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)，SartoriusBB-8846880發酵罐(德國SartoriusStedimBiotech公司)。

1.1.3培養基LB液體培養基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，0.5%NaCl。LB固體培養基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，0.5%NaCl，2%瓊脂粉。選擇培養基：LB固體培養基加抗生素(50μg/mL氨芐青霉素或卡那霉素)。種子培養基：LB液體培養基中加20g/L葡萄糖。

1.2 方法

1.2.1 mglB和galP基因的敲除PCR引物設計mglB和galP基因的敲除PCR引物設計如表2所示。

表2 敲除基因的引物與驗證引物

根據mglB和galP序列設計敲除引物分別為ΔmglB-P1、ΔmglB-P2、ΔgalP -P1、ΔgalP -P2，如表2所示，該對引物5′端45bp片段與mglB和galP序列同源，以18-20bp(表2中下劃線序列)與質粒pKD4上FRT-kan-FRT閱讀框序列同源，以pKD4質粒為模板，用擴增引物ΔmglB-P1、ΔmglB-P2、ΔgalP -P1、ΔgalP -P2進行PCR擴增，獲得帶有kan抗性基因的敲除片段，經乙醇沉淀過夜后，切膠回收。使用CaCl2法[14]將pKD46轉化至WL210的細胞中，通過氨芐平板篩選得到陽性菌落WL210/pKD46。挑選WL210/pKD46單菌落細胞接種于LB液體培養基中，30℃條件下培養至OD600為0.4～0.7；冰水浴35min后，用去離子水洗滌5次以上，棄去上清，得到感受態細胞WL210/pKD46懸浮液；取90μL的菌液和9μL打靶片段混勻后進行電轉。將電擊后的菌液轉移到預熱37℃LB液體培養基中，150r/min條件下復蘇2h，涂布于選擇性培養基，37℃過夜培養。挑取單菌落為模板，采用鑒定引物ΔmglB-P1、ΔmglB-P2進行PCR驗證。將成功敲除mglB基因的WL210菌株命名為WL220。

敲除galP基因方法與敲除mglB基因方法相同。將成功敲除galP基因的WL220菌株命名為WL230。

1.2.3發酵實驗挑選單菌落WL210、WL220、WL230接種于含有50mLLB液體培養基的錐形瓶中，150r/min，37℃過夜培養12h至OD為1.20左右。以10%的接種量接種至含有4L無菌培養基中，其碳源分別為6%葡萄糖、6%木糖、6%混合糖(3%葡萄糖和 3%木糖)，發酵條件為37℃、200r/min，發酵時采用3mol·L-1的氫氧化鈣作為中和劑，控制發酵液pH為6.80。定時定點取樣，測定菌體濃度OD600，糖濃度及L-乳酸濃度。每次發酵實驗進行3次平行實驗。

1.2.4發酵產物檢測分析菌體濃度測定采用可見光分光光度計測定波長600nm下OD600值。L-乳酸采用生物傳感儀檢測法[15]；葡萄糖、木糖檢測采用高效液相色譜分析，色譜柱為Bio-RadHPX87H，流動相為4mmol·L-1H2SO4，流速0.5mL/min，柱溫40℃， 檢測器為PDA、ELS檢測器[16]。

2 結果與分析

2.1 重組菌E.coli WL230的構建

以出發菌WL210為對照，基因內部驗證引物對菌株WL230進行PCR驗證，其結果如圖1所示。

1-E.coli WL210ΔmglB菌落PCR結果；2-E.coli WL210ΔgalP菌落PCR結果；3、4-菌株E.coli WL230菌落PCR結果圖 1 E.coli WL210菌株敲除mglB 和galP基因的電泳圖

WL210可擴增出半乳糖轉運系統基因galP和甲基半乳糖苷轉運系統基因mglB片段。基因片段長度分別為910bp和1475bp。圖1中結果符合預期，表明重組菌E.coliWL230的mglB、galP片段敲除成功。

2.2 三菌株利用葡萄糖能力對比

為了探究三菌株利用單糖葡萄糖的能力，以6%葡萄糖為碳源，對比WL210，WL220(WL210ΔmglB)、WL230(WL210ΔmglBΔgalP)的菌體生長情況，結果如圖2所示。菌株WL210、菌株WL220菌株WL230最大OD600分別為8.13、7.26、6.80。說明敲除基因后的菌株葡萄糖的消耗速率降低，菌體生長速率變慢。

圖 2 三菌株單糖發酵(6%葡萄糖)的菌體生長情況

由圖3可知，在利用葡萄糖方面，菌株WL210、菌株WL220、菌株WL230發酵結束時間分別為21h、24h、30h，平均耗糖速率分別為2.86g/(L·h)、2.50g/(L·h)、2.42g/(L·h)。

三菌株后期耗糖速率都變慢。與出發菌WL210相比，菌株WL220和菌株WL230利用葡萄糖的平均速率分別降低了12.50%、15.42%，發酵周期分別延長了14.28%、42.86%。在生產乳酸方面，菌株WL210、菌株WL220、菌株WL230最終乳酸產量分別為48.90g/L、47.10g/L、46.40g/L，生產強度分別為1.63g/(L·h)、1.57g/(L·h)、1.55g/(L·h)。對比出發菌WL210，菌株WL220、菌株WL230的生產強度分別降低了3.68%、5.11%。表明敲除ΔmglB、ΔgalP基因后，葡萄糖的消耗速率降低。

圖 3 三菌株利用6%葡萄糖發酵產L-乳酸能力比較

結果表明，mglB、galP兩個基因可以明顯降低大腸桿菌利用葡萄糖的能力，并且三菌株中mglB/galP雙基因缺陷菌株WL230生物量最大。

2.3 三菌株利用木糖能力對比

為了探究三菌株利用單糖木糖的能力，以6%木糖為碳源，對比WL210，WL220、WL230的菌體生長情況，結果如圖4所示。菌株WL210發酵30h時，OD達到最大5.82后進入穩定期；WL220在42h時OD值達到最大6.01，WL230在48h時OD值達到最大6.59。雖然WL210最先進入穩定期，但其最大OD值是三菌株中最小，而WL220和WL230的最大OD值分別為WL210最大OD值的1.03倍、1.13倍。在30h之前，菌株WL210的生物量高于菌株WL220和菌株WL230；30h之后，菌株WL230的生物量都高于菌株WL210和菌株WL220。表明敲除基因后的菌株木糖消耗速率加快，菌體生長速率變快。

圖 4 三菌株單糖發酵(6%木糖)的菌體生長情況

由圖5可知，在利用木糖方面，菌株WL210、菌株WL220、菌株WL230發酵結束時間分別為90h、84h、78h，平均耗糖速率分別為0.67g/(L·h)、0.71g/(L·h)、0.76g/(L·h)。

對比出發菌WL210，菌株WL220和菌株WL230利用木糖的平均速率分別降低了7.14%、15.38%，發酵周期分別縮短了6.67%、15.38%。在生產乳酸方面，菌株WL210、菌株WL220、菌株WL230最終乳酸產量分別為43.12g/L、 45.98g/L、50.12g/L，生產強度分別為0.51g/(L·h)、0.59g/(L·h)、0.69g/(L·h)。對比出發菌WL210，菌株WL220、菌株WL230的生產強度分別提高了14.84%、35.60%。表明敲除ΔmglB、ΔgalP基因后，消耗木糖速率加快。

圖 5 三菌株利用6%木糖發酵產L-乳酸能力比較

2.4 三菌株利用混合糖能力對比

為了探究三菌株混合糖中葡萄糖和木糖的利用速率，以6%混合糖(3%葡萄糖+3%木糖)為碳源，對比WL210，WL220、WL230的菌體生長情況，結果如圖6所示。菌株WL210發酵36h時，OD達到最大7.1進入穩定期；WL220在48h時OD值達到最大7.58，WL230在54h時OD值達到最大8.38。雖然WL210最先進入穩定期，但其最大OD值是三菌株中最小，而WL220和WL230的最大OD值分別為WL210最大OD值的1.07倍、1.18倍。在12h之前菌株WL210的生物量高于菌株WL220和菌株WL230，而12h之后菌株WL230的生物量都高于菌株WL210和菌株WL220。結果表明，mglB/galP雙基因缺陷菌株WL230所攝取的糖更多用于菌體生長，也具有更高的生物量[17]。

圖 6 三菌株混合糖發酵(3%木糖和3%葡萄糖) 的菌體生長情況

由圖7可知，菌株WL210優先利用葡萄糖，待發酵至18h時，開始利用木糖，至48h還剩余23.02g/L木糖未利用，而葡萄糖完全耗完；WL220同時利用葡萄糖和木糖，42h時葡萄糖利用完畢，發酵至48h時木糖剩余量為11.45g/L；菌株WL230可同時利用葡萄糖和木糖，發酵48h時木糖無殘余，發酵至72h時葡萄糖消耗完畢。

圖 7 三菌株混合糖發酵(3%葡萄糖+3%木糖) 的木糖和葡萄糖消耗曲線

菌株WL210、WL220、WL230消耗葡萄糖的速率分別為1.21g/(L·h)、0.78g/(L·h)、0.66g/(L·h)，消耗木糖速率分別為0.15g/(L·h)、0.45g/(L·h)、0.62g/(L·h)。對比出發菌WL210，菌株WL220、菌株WL230，木糖的消耗速率分別提高了188.03%、298.92%。結果表明，mglB、galP兩基因的缺失，可有效降低分解代謝阻遏效應，使葡萄糖消耗速率降低，而木糖消耗速率升高可能是兩個基因對木糖消耗具有疊加效應[18]。

三菌株的L-乳酸產量如圖8所示。在發酵30h之前，菌株WL210的乳酸產量高于菌株WL220、WL230，菌株WL210利用葡萄糖產L-乳酸的速率大于菌株WL220、WL230 產L-乳酸速率，分別為0.98g/(L·h)、0.88g/(L·h)、0.79g/(L·h)；發酵30h后WL220、WL230的L-乳酸產量超過菌株WL210。發酵至36h，菌株WL210、菌株WL220、菌株WL230的乳酸產量分別為37.95g/L、43.02g/L、54.13g/L，生產強度分別為0.79g/(L·h) 、0.90g/(L·h)、 1.13g/(L·h)，轉化率分別為63.13%、71.88%、90.21%。對比出發菌WL210，菌株WL220、WL230生產強度分別提高了13.30%、42.63%，轉化率分別提高了13.86%、42.90%。菌株WL230已消耗完所有碳源，而菌株WL210、WL220分別剩余22.01g/L、11.39g/L的木糖。結果表明，敲除mglB、galP后，WL220、WL230利用木糖產L-乳酸的能力遠大于菌株WL210，由于mglB、galP這兩個基因的缺失，葡萄糖消耗速率減弱[19]。

圖 8 三菌株混合糖發酵(3%葡萄糖+3%木糖) 的乳酸產量

3 結論

本研究敲除甲基半乳糖苷轉運系統基因mglB、半乳糖轉運系統基因galP，構建mglB/galP雙缺陷乳酸工程菌WL230。在混合糖(3%葡萄糖和3%木糖)發酵時，具有木糖利用效率高、發酵周期短、乳酸轉化率高的特點。對比出發菌WL210，其木糖利用速率和乳酸生產強度分別提高了298.92%、42.63%，轉化率高達90.21%，為采用基于木質纖維素等可再生原料高效利用木糖生產L-乳酸提供理論基礎。