辣椒根際促生菌篩選鑒定及其促生效應初探

張垚， 張芝， 王志剛， 徐偉慧

(1.齊齊哈爾大學 生命科學與農林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2.黑龍江省農業微生物制劑產業化技術創新中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

辣椒是世界上最主要的蔬菜作物之一，隨著人民生活水平的不斷提高，對辣椒周年供應的需求更加迫切[1]。由于經濟效益的誘惑和化學肥料的增產作用顯著，致使辣椒長期連作以及設施生產中過量施用化肥[2]，從而帶來了土壤酸化、板結、病原菌富集、微生物群落環境惡化等問題，使辣椒發病率增高，品質降低，嚴重影響辣椒產業的可持續發展[3-4]。因此，尋求一種綠色環保、科學高效并能減少或代替化學肥料的新型肥料是當代農業生產所必需的[5]。微生物肥料含有活的微生物制劑，具有特定肥效，因能增加作物產量、提高作物品質、拮抗病原菌、誘導植物抗性、保護作物健康而備受關注，逐步成為現代農業生產中的重要肥料[6-7]。

植物根際促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)是一種附生于植物根系或棲于根際土壤的有益菌，可促進植物生長及營養元素的吸收和利用，拮抗有害微生物，是開發和利用微生物肥料的有效菌種資源[8]。不同作物根際蘊藏著不同的菌種資源，且在根際上的定殖能力與作物的基因型及根系成分密切相關[9]。考慮到菌株在根際上的定殖能力、穩定性及菌株地域性等特點，從特定作物根際篩選菌株，制備專用作物的微生物菌劑或微生物肥料，能更好地實現對作物的增產作用。本研究以黑龍江省齊齊哈爾龍江縣辣椒根際土為供試材料，篩選解磷菌、溶磷菌、固氮菌等根際促生菌，并對其促生效應進行初步探究，為辣椒專用微生物肥料的開發和應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試土壤采自龍江縣辣椒的根際，供試培養基種類和配方如下：

LB培養基(1 L)：酵母膏5.0 g，NaCl 8.0 g，蛋白胨10.0 g，pH 7.0。

PKO無機培養基(1 L)：葡萄糖10.0 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，Ca3(PO4)22.0 g，KCl 0.3 g，MnSO4·H2O 0.03 g，FeSO4·7H2O 0.036 g，瓊脂20.0 g，pH 7.0。液體培養基不加瓊脂。

蒙金娜有機培養基(1 L)：葡萄糖10.0 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，KCl 0.3 g，MnSO4·H2O 0.03 g，卵磷脂0.2 g，CaCO31.0 g，酵母粉1.0 g，pH值7.0。

無氮培養基(1 L)：蔗糖10.0 g，KH2PO40.2 g，CaCO31.0 g，MgSO40.2 g，NaCl 0.12 g，瓊脂20.0 g，pH值7.2。

CAS(chrome azurolsul phonate)培養基：每100 mL含20%蔗糖溶液1 mL，10%酸水解酪素3 mL，1 mmol·L-1CaCl2100 μL，1 mmoL·L-1MgSO42 mL，瓊脂1.8 g，在約60 ℃時緩慢加入磷酸鹽緩沖液和CAS染液各5 mL，即得CAS藍色培養基。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離與鑒定

稱取辣椒根際土壤10 g，置于含有90 mL無菌水和少量玻璃珠的三角瓶中，在25 ℃、140 r·min-1下振蕩培養20 min。梯度稀釋后，將10-4、10-5、10-6、10-7、10-8濃度的土壤懸液0.2 mL分別涂布到固態PKO、蒙金娜和無氮培養基上，以篩選溶磷菌、解磷菌和固氮菌，每個梯度重復3次。涂布后將平板置于30 ℃恒溫箱中培養，定期觀察，挑取營養圈明顯的單菌落純化，并多次傳代后保藏。

使用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取細菌DNA。采用細菌通用引物27F和1492R進行16S rDNA的PCR擴增。

PCR反應體系(20 μL)。DNA模板0.5 μL，10×ExTaqbuffer 2.0 μL，2.5 mmol·L-1dNTP Mix 1.6 μL，正向引物(27F)0.8 μL，反向引物(1492R)0.8 μL，5U ExTaq0.2 μL，ddH2O 14.1 μL。

PCR反應程序。95 ℃ 5 min→95 ℃ 30 s→51/57 ℃ 30 s→72 ℃ 1 min，24個循環，72 ℃10 min。

PCR產物送至上海美吉公司測序，核酸序列在NCBI的GenBank數據庫中進行Blast比對，采用MEGA 5.0軟件構建系統發育樹，鑒定菌株種屬[10]。

1.2.2 菌株分泌激素、鐵載體、溶磷能力及安全性評價

溶磷能力測定。參考Ji等[11]的方法。將菌株接種于液體PKO培養基，于30 ℃下120 r·min-1振蕩培養。24、48、72 h后取菌液離心，取上清液定容至25 mL后加入顯色劑，以無菌培養基為對照組，測定菌株溶磷能力，每組重復3次。

生長素(IAA)測定。參考劉國強等[12]的方法。采用Salkowski顯色法測定吸光值D530，繪制標準曲線。將菌株接于LB液體培養基中，置于搖床培養(30 ℃，120 r·min-1)24 h，制備種子液，按1%的接種量將種子液接入含有200 mg·L-1色氨酸的液體LB培養基中，置于搖床培養(30 ℃，120 r·min-1)24、48、72 h后，采用Salkowski顯色法定量測定IAA，每組重復3次。

鐵載體測定及安全性評價。參考王歡等[13]的方法。配置CAS培養基。每100 mL含20%蔗糖溶液1 mL，10%酸水解酪素3 mL，1 mmol·L-1CaCl2100 μL，1 mmol·L-1MgSO42 mL，瓊脂1.8 g，在60 ℃時緩慢加入磷酸鹽緩沖液(0.1 mol·L-1，pH 6.8，稀釋10倍使用)和CAS染液各5 mL，即得CAS藍色培養基。將菌接種于藍色固體培養基，倒置培養，如出現透明圈則表明有鐵載體生成。

溶血試驗。參考李煜等[14]的方法，將待測菌株接種于血瓊脂平板，置于保溫箱里培養18～24 h，觀察有無溶血環產生。

赤霉素(GA)測定。參考徐偉慧等[15]的方法，將分析純赤霉素溶于體積分數為70%的乙醇中，配置成赤霉素標準液，按照一定濃度梯度進行稀釋，取各濃度的赤霉素溶液0.5 mL與4.5 mL濃硫酸充分混勻，置于冰浴中10 min，再置28 ℃水浴中1 h，取出置室溫下放置15 min，測定D412吸光值，繪制標準曲線。將菌株接種于LB培養基中，置于搖床(30 ℃，120 r·min-1)上振蕩培養24 h，制備種子液，按1%的接種量將種子液轉接LB培養基中，搖床振蕩(30 ℃，120 r·min-1)培養24、48和72 h后，分別取菌懸液離心(10 000 r·min-1，10 min)，取上清測定菌株赤霉素濃度，每組重復3次，確定各菌株最大赤霉素分泌量。

1.2.3 促生實驗

促生菌劑對辣椒種子的萌發。參考韓麗珍等[16]的方法，選取辣椒種子于55～60 ℃水中浸泡15～20 min，分別將NC1和NC3菌培養至D600=1，然后將辣椒種子置于稀釋20倍的菌懸液中浸泡8 h，將浸泡后的種子放入鋪有2層濾紙的無菌培養皿(Ф=9 cm)中，每個培養皿中為15粒種子，每處理重復3次，以相同濃度的LB培養基浸種為對照(CK)，將其放入28 ℃、相對濕度60%的氣候箱中培養，培養期間使用無菌水保持濕潤狀態，培養7～14 d，發芽結束后統計種子發芽率，計算種子的發芽及活力狀況，測量辣椒種子胚根長。

發芽指數=∑不同時間的發芽數/發芽日數。

活力指數=發芽指數×規定日期內幼苗或幼根的長度或質量。

菌劑對辣椒幼苗的促生效應。辣椒幼苗長至4～5片葉時，用NC1、NC3的菌懸液(D600=1)稀釋20倍對幼苗進行澆灌，每7～10 d澆灌1次，以澆灌相同濃度的LB培養基為對照，試驗期間澆灌清水保持各處理的土壤墑情一致，每處理重復10株。在澆灌7次菌懸液后，測量植株莖粗、株高和干鮮重。

1.3 數據處理

采用Excel 2010進行數據整理，采用Origin 9.0 作圖，應用SPSS軟件系統進行數據處理及方差分析，采用DNAMAN軟件進行序列間的兩兩比對。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離和16S rRNA序列鑒定

在辣椒根際土壤分離到6株菌，包括1株溶磷菌(PC5L)、3株解磷菌(CJ1、CJ2、CJ3)和2株固氮菌(NC1、NC3)。根據16S rRNA測序結果和GenBank中已登錄的核苷酸序列進行同源性比較發現，菌株PC5L與BacillusoryzaecorticisWJB118(KU877661.1)同源性較高，菌株NC3與BacillusmegateriymN1564-A29(JXD80182.1)同源性較高，菌株NC1與KlebsiellaaerogenesAY3(MT557012.1)同源性較高，菌株CJ3與Bacillussp.(in：Bacteria) CJKOP-125(MF537170.1)同源相似性高，菌株CJ2與Bacillussp.(in：Bacteria) 4B21(MZ277411.1)同源性較高，菌株CJ1與Bacillussp.(in：Bacteria) Y172001(MG914006.1)同源性較高，并采用MEGA 5.0軟件構建菌株PC5L、NC3、NC1、CJ3、CJ2、CJ1的系統發育樹(圖1)。基于菌株的16S rRNA基因序列分析，將菌株PC5L、NC3、NC1、CJ3、CJ2、CJ1分別確定為Bacillusoryzaecorticis、Bacillusmegaterium、Klebsiellaaerogenes、Bacillussp.、Bacillussp.、Bacillussp.。經16S rRNA基因比對，菌株CJ1、CJ2、CJ3都屬于Bacillussp.，通過DNAMAN軟件進行兩兩間的序列比對分析，確定菌株CJ1、CJ2、CJ3非同種菌，只是親緣關系較近。

2.2 菌株分泌IAA、GA和P的能力

由圖2可知，24 h后，菌株溶磷能力依次是NC1>NC3>CJ3>CJ1>CJ2>PC5L，菌株NC1和NC3溶磷能力顯著高于其他4個菌株；48 h后，菌株溶磷能力依次為NC3>NC1>PC5L>CJ3>CJ1>CJ2，菌株NC3溶磷能力顯著高于其他菌株；72 h后，菌株溶磷能力依次是CJ3>NC1>CJ2>CJ1>PC5L>NC3。24和48 h后，供試菌株產生的赤霉素相差不大；72 h后，產生赤霉素含量最高的菌株是PC5L，其次是CJ2和CJ1。24 h后，菌株NC1與NC3分泌的IAA含量相近。48 h后，菌株分泌的IAA依次是CJ1>CJ3>CJ2>PC5L>NC1>NC3；在72 h供試菌株不分泌IAA。

同一時間比較，柱上無相同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

2.3 菌株產鐵載體及溶血性評價

由表1可知，供試的6個菌株不產鐵載體，也不具有溶血性。

表1 菌株產鐵載體能力及溶血性評價

2.4 促生菌劑對辣椒種子萌發的影響

由于菌株NC1、NC3具有較高的溶磷能力和分泌IAA的能力，故選取菌株NC1、NC3分別對辣椒種子和幼苗進行處理，評估其對辣椒種子萌發和幼苗生長的影響。

由表2和圖3可知，NC1菌懸液(D600=1)稀釋20倍浸泡辣椒種子，對辣椒種子的萌發率影響不大，相比對照顯著提高了辣椒種子的活力指數和主根長度，主根長度較對照提高88.3%。

圖3 NC1和NC3菌懸液處理后辣椒種子萌發形態

表2 NC1和NC3菌懸液處理對辣椒種子萌發的影響

2.5 促生菌劑對辣椒幼苗的促生的結果與分析

由表3和圖4可知，2個菌株不同程度地促進了辣椒幼苗的生長，菌株NC1顯著提高了辣椒的株高和干重，相比對照分別提高36.1%和58.8%；菌株NC3在株高和干重上分別比對照提高了19.3%和25.1%。可見在幼苗促生方面，菌株NC1優于菌株NC3。

圖4 NC1和NC3菌懸液處理后辣椒幼苗形態

表3 NC1和NC3菌懸液對辣椒幼苗的促生效應

3 討論

氮和磷在動植物生長過程中都是十分重要的營養元素，但在自然條件下，能被植物吸收利用的卻很少。本研究篩選辣椒根際土壤中具有溶磷、解磷和固氮功能的菌株，共篩選出6株PGPR菌株，其中1株溶磷菌(PC5L)，3株解磷菌(CJ1、CJ2、CJ3)，2株固氮菌(NC1、NC3)。溶磷菌和解磷菌可通過產酸、整合、沉淀等方式直接或間接提高磷的利用率，促進作物增產，有效減少磷肥施用量[17-18]，增加磷的利用率[19]。本研究結果表明，篩選出的6株菌都有不同程度的溶磷能力，且分離的2株固氮菌NC1和NC3也具備溶磷能力，可能與同一菌株具有不同功能有關。PGPR可通過產生植物激素、嗜鐵素等物質促進植物生長[20]。本試驗研究結果表明，PC5L菌株產赤霉素能力最強，NC1與NC3菌株產IAA能力最強，NC1菌株溶磷能力最強，6株菌都不產鐵載體。

大部分PGPR可產生IAA，促進植物根系的生長發育[21]。王辰月等[22]研究也發現，產IAA的細菌對種子萌發有促進作用。一些PGPR自身不產植物激素，但可誘導宿主產生激素物質，促進其生長發育[23]。本研究以2種菌懸液的浸種萌發試驗表明，菌株NC1、NC3對辣椒種子萌發和辣椒幼苗生長有不同程度的促進效應，原因可能是與2種菌株分泌IAA和赤霉素等有密切關系。根際促生菌能刺激側生根的萌動、伸長、發育，影響根系形態，促進植物生長[24-26]。Sajeesh等[27]從茄子根際中篩選到溶磷菌，盆栽試驗結果表明，接種溶磷菌的植株，其莖長、葉綠素含量、花果葉數量等均顯著高于未接種溶磷菌的組別。本試驗表明，菌株NC1和NC3能促進辣椒幼苗的生長，也可能與其提高了土壤中磷的利用率有關。

綜上，本試驗從辣椒根際篩選到6株PGPR，經16S rRNA堿基序列同源性分析，將6株菌分別鑒定為Bacillusoryzaecorticis、Bacillusmegaterium、Klebsiellaaerogenes、Bacillussp.、Bacillussp.、Bacillussp.。供試6株菌有不同的溶磷能力及產IAA和GA的能力，均無產鐵載體的能力，不具有溶血性。種子萌發和促生試驗表明，菌株NC1的菌懸液能促進辣椒種子的萌發和幼苗生長，菌株NC3菌懸液對辣椒幼苗生長有促進作用。