西紅花球莖病變對內生真菌多樣性及菌群結構的影響

任航潔， 吳啟婷， 陸潔淼， 張家豪， 鄭呂， 秦路平， 朱波

(浙江中醫藥大學 藥學院， 浙江 杭州 311402)

中藥西紅花是鳶尾科植物番紅花(CrocussativusL.)的干燥柱頭，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神的功效，用于治療經閉癥瘕、產后瘀阻、溫毒發斑、優郁痞悶 、驚悸發狂[1]。現代醫學研究發現，西紅花有著抗腫瘤、抗氧化、降血脂、抗凝血、保護腦損傷等作用[2]。我國西紅花主要分布于浙江、上海、河北、江蘇、西藏、安徽等地區，國外主要分布在伊朗、新西蘭與西班牙等地[3-4]。球莖腐爛病是西紅花生產上常見的一種重要病害，其主要危害部位是未成熟的球莖，在重茬田、低洼田和排水不良的田塊中發病較為嚴重，嚴重影響西紅花球莖產量與藥材質量[5]。

植物內生菌是指生活史中某一階段或整個階段生活在健康植物組織或細胞內，并對宿主植物沒有引起明顯病害癥狀的一類真菌[6]。植物內生真菌和宿主植物之間存在著相互依存、互利共惠的關系[7]。現有報道表明，西紅花中存在數量眾多的內生真菌，部分內生真菌有著抑制病原菌生長、促進宿主西紅花生長等作用[8-9]。

植物體良好的內生微環境對正常生長發育至關重要，目前，針對西紅花內生真菌種群結構與分布規律鮮有報道。因此，本試驗在前期西紅花內生真菌分離鑒定的基礎上，擬分析西紅花健康球莖與病變球莖在內生真菌菌群結構、多樣性等方面的差異，探討球莖病變對西紅花內生微環境的影響，以期為西紅花大田栽培與病害防治提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌種材料

課題組前期從浙江建德、浙江湖州、河北保定3個產地收集了健康與病變西紅花球莖，并從中分離純化得到內生真菌380株，根據菌株的形態學特征以及通過5.8S以及ITS區片段序列進行相似性對比及系統發育分析，共鑒定了26個分類單位，歸屬于10個屬，6個目，3個綱，2個門。其中22個分類單位(占總數的86.58%)歸屬于子囊菌門，4個(占15.79%)歸屬于擔子菌門。

1.2 數據統計分析

統計物種數、物種優勢度與多樣性指數：物種數用來記錄西紅花球莖中內生真菌的種類數目；物種優勢度用來判斷所有內生菌群中占有優勢的菌群及內生菌群的組成情況。常用相對分離頻率(relative frequency，RF)體現，RF=(某類內生真菌菌株數/內生真菌菌株總數)×100%[10]。優勢菌種的判定：Pi>1/S[11]。Pi即相對分離頻率，i表示第i種菌落，S表示該類別中總的菌落數。多樣性指數(diversity index)用來描述內生真菌的菌種數量及其分布的均勻度，常使用Shannon-Wiener多樣性指數(H′)[12]與Simpson多樣性指數(1-D)[13]。Shannon-Wiener(H′)=-ΣPi×lnPi；Simpson指數(1-D)=1-Σ(Ni/N)2；其中Ni為類別中第i種的個體數，N為類別中所有種的個體數。

2 結果和分析

2.1 物種數和物種組成

西紅花健康球莖共有內生真菌10個屬，26個種；病變球莖共有內生真菌7個屬，19個種。健康球莖中，湖州產地內生真菌物種數最高，為16；病變球莖中，建德產地內生真菌物種數最高，為11(表1)。

表1 3個產地西紅花球莖中內生真菌的物種數

3個產地西紅花球莖在病變后內生真菌物種數均下降，其中湖州產地下降最多。病變同時影響了內生真菌的物種分布，如湖州健康球莖中分離有黏帚霉屬(Clonostachys)真菌，而病變球莖中卻未發現。部分真菌物種分布未受球莖病變影響，如鐮刀屬(Fusarium)、青霉屬(Penicillium)和踝節菌屬(Talaromyces)內生真菌在健康和病變球莖中均有分布(表2)。

表2 西紅花球莖中內生真菌的物種組成

2.2 種群優勢度

球莖病害影響西紅花內生真菌菌群結構與種群優勢度，病變后，球莖中鐮刀屬Fusarium的相對豐度明顯增加。在屬水平，河北健康球莖最優勢屬為踝節菌屬Talaromyces(RF=50.00%)，其次為青霉屬Penicillium(RF=44.12%)，病變后最優勢屬為青霉屬(RF=42.31%)，其次為鐮刀屬Fusarium(RF=38.46%)；湖州健康球莖最優勢屬為踝節菌屬(RF=38.00%)，病變后最優勢屬為鐮刀屬Fusarium(RF=43.48%)；建德健康球莖最優勢屬為青霉屬(RF=54.05%)，病變球莖最優勢屬為踝節菌屬(RF=48.48%)，其次為鐮刀屬(RF=24.24%)(表3)。

表3 球莖病變后西紅花內生菌在屬水平的相對豐度變化

在種水平，Fusariumoxysporum病變球莖中豐度顯著升高，除建德產地外，其他產地病變后西紅花球莖的最優勢種從Talaromycesrugulosus變為Fusariumoxysporum(圖1)。

圖1 不同產地西紅花優勢菌種相對分離頻率比較

2.3 多樣性指數

球莖病變影響西紅花內生真菌多樣性，病變后3個產地內生真菌多樣性指數均下降，其中建德產地下降幅度最大，Shannon-Wiener(H′)指數下降20.26%，Simpson指數(1-D)下降11.68%(表4)。

表4 3個產地西紅花球莖中內生真菌的多樣性指數

3 小結與討論

本文對浙江建德、浙江湖州、河北保定3個產地的健康與病變球莖中分離得到的內生真菌進行了多樣性與菌群結構的分析，研究發現，西紅花球莖病變后內生真菌的物種數下降，物種優勢度也發生了改變，病變后西紅花球莖的優勢種從Talaromycesrugulosus變為Fusariumoxysporum。西紅花健康球莖的內生真菌多樣性指數在病變后下降，內生真菌多樣性的降低與鐮刀菌等有害菌群的增加可能是西紅花球莖病變的主要原因。

已有多項研究表明，植物病害會影響植物內生真菌的菌群結構。周琳等[14]對崇明西紅花球莖根腐病進行研究，從屬水平分析得出，西紅花球莖中細菌和真菌群落組成和相對豐度存在明顯差異。唐鑫等[15]在對天麻褐腐病的研究中發現健康天麻中的優勢真菌屬為被孢霉屬(Mortierella)和隱球菌屬(Cryptococcus)，而褐腐天麻中的優勢為真菌屬(Neobulgaria)、土赤殼屬(Ilyonectria)和花邊傘屬(Hypholoma)。

西紅花球莖腐爛病是西紅花種植過程中最主要的病害之一，其致病菌種類繁多，如鐮刀菌(Fusarium)、青霉菌(Penicillium)、叢花青霉(Penicilliumcorymbiferum)等[16-17]。吳李芳[5]在對建德西紅花球莖病變研究中得出茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)是主要致病菌之一。趙麗娟[2]從崇明西紅花病變球莖中分離得到3種致病菌，鑒定為曲霉屬(Aspergillus)的巴西曲霉(Aspergillusbrasiliensis)、鐮刀菌屬(Fusarium)的尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和青霉菌屬(Penicillium)的橘青霉菌(Penicilliumcitrinum)[2]。本文分析了球莖病變后西紅花內生真菌菌群結構與多樣性變化，為西紅花病害生物防治真菌的篩選及防治策略提供了參考依據。