利用離體葉片相對病斑面積快速鑒定茭白對胡麻葉斑病的抗性

李芳， 張玨鋒， 鐘海英， 陳建明

(浙江省農業科學院 植物保護與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

茭白又稱茭瓜、蒿筍、菰首等，為禾本科菰屬多年生水生宿根草本植物，受茭白黑粉菌侵染后刺激而形成的可食用肉質莖，品質鮮嫩、營養豐富，經濟價值高，是我國重要的水生蔬菜，也是浙江省種植面積最大的水生蔬菜。2015年浙江省茭白種植面積為2.85萬hm2，產量為86.7萬t，約占全國種植面積的40%，已成為全國種植面積最大的省份[1]。

茭白胡麻葉斑病是茭白生產上的主要病害，在全國茭白產區普遍發生，嚴重時造成較大產量損失[2]。胡麻葉斑病主要為害葉片，初密生褐色小點，后擴大為褐色紡錘形或橢圓形斑，長如芝麻粒，病斑周圍有黃暈，后期中心變為灰白色[3-4]。目前，茭白胡麻葉斑病的防治主要依靠化學農藥，由于頻繁施用殺菌劑，導致生產上時常出現茭白不孕茭或茭白植株抽穗的現象，嚴重影響茭白產量[5]。實踐證明，推廣抗病品種是防治茭白病害最有效的方法之一。通過茭白田間的胡麻葉斑病抗性調查，可有效篩選出抗性品種，此方式可靠性和重復性較好，但試驗周期長，受季節限制，環境可控性較差。利用茭白葉片離體培養進行室內胡麻葉斑病抗性鑒定可有效縮短鑒定周期，試驗規模小，易重復和大批量操作。單一接種胡麻葉斑病菌可避免多種病菌對植株抗性造成干擾，利用病斑面積計算發病程度更加科學準確。

本研究共收集12個單季茭白新品種(系)，通過茭白葉片的室內離體培養，快速鑒定胡麻葉斑病的抗性特征，結合田間調查，驗證室內評價結果，對比不同品種對胡麻葉斑病的抗病性差異，為茭白抗性品種選育提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試茭白品種

在浙江省余姚市河姆渡鎮茭白種質資源圃收集12個單季茭白品種(系)(表1)，部分品種已通過審定，如鄂茭1號、金茭1號、大洋茭[6]，其他品種(系)均未審定。

1.2 菌株收集和培養

茭白胡麻葉斑病菌分離自茭白染病葉片，將染病葉片經75%乙醇浸泡沖洗，再由無菌水沖洗后，剪取小塊帶病葉塊置于PDA平板上，28 ℃下培養5 d后，將葉片病斑處長出的菌絲劃線培養，將生長出來的單克隆體進行品種鑒定，鑒定正確的病菌用于抗性鑒定。將胡麻葉斑病菌的菌絲塊接種至PDA平板中央，于28 ℃下培養3～4 d，至菌絲長滿整個培養基表面時備用。

1.3 茭白離體葉片的病菌接種

取不同品種茭白分蘗期完全展開的倒二葉，剪取6 cm左右，先后經75%乙醇和無菌水沖洗后，將葉片背軸面向上平鋪在含有Kana抗性的PDA平板表面。在長滿病菌菌絲的培養基相同半徑處，用表面滅菌的打孔器，取帶有菌絲的PDA瓊脂塊，直徑約5 mm，將菌塊置于離體葉片中間部位，使帶有菌絲的一面緊貼葉片背軸面，每品種重復3個葉片，以不貼菌絲片的葉片為對照。將平板置28 ℃培養5 d后，用數碼相機拍攝清晰照片[7-8]。

1.4 茭白離體葉片病斑面積測量及計算

利用Photoshop軟件，將拍攝照片的病斑面積換算成像素[9]，將病斑面積與葉片總面積的百分率減去對照組的病斑所占百分率，計算相對病斑面積，以此衡量不同品種胡麻葉斑病菌的抗性。利用DPS生物統計軟件對病斑面積比例進行單因子方差分析和Tukey HSD多重比較[10]，分別在P<0.05和P<0.01兩水平分析顯著性差異。

1.5 茭白田間胡麻葉斑病的抗性調查

調查資源圃中12個單季茭白對胡麻葉斑病的抗性[11-12]。分別觀察茭白植株完全展開的倒一、二、三葉片上胡麻葉斑病病斑的數量，每個品種觀察茭白20株，進行葉片病情分級。

分級標準。無病斑為0級，1～5個斑點為1級，6～10個斑點為3級，11～15個斑點為5級，16～20個斑點為7級，>21個斑點為9級。統計病情分級數據，計算病情指數，依此衡量不同品種(系)茭白對胡麻葉斑病的抗性。

2 結果與分析

2.1 室內鑒定

為了檢測茭白品種對胡麻葉斑病菌的抗性程度，剪取分蘗期完全展開的倒二葉葉片組織，接種含有胡麻葉斑病菌的PDA瓊脂塊，于28 ℃下恒溫培養，5 d后接種部位出現大小不一的病斑，計算病斑面積比例，并進行方差分析。圖1顯示，收集到的12個單季茭白品種(系)均受到胡麻葉斑病菌的侵染，葉片出現典型的褐色斑塊，不同品種會出現不同面積的病斑，依此可衡量不同品種的抗性。

圖1 胡麻葉斑病菌侵染葉片的病斑特征

圖2顯示，收集到的12個單季茭白品種(系)接種胡麻葉斑病菌后，杭州一點紅葉片上相對病斑面積最大，極顯著大于其他品種，說明對胡麻葉斑病抗性最弱，相對病斑面積比例均值為7.26%。金茭1號、余茭1號B、本地八月茭和大洋茭的相對病斑面積較小，所占面積為3.25%，2.91%，2.64%和2.60%，分別是杭州一點紅病斑面積的44.77%，40.08%，36.36%和35.81%，其間無顯著性差異(P<0.05)，對胡麻葉斑病表現出較強抗性。

柱間無相同大小寫字母者分別表示組間差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)。

2.2 田間抗性

對資源圃中的12個單季茭白品種(系)進行胡麻葉斑病病害調查，并通過計算病情指數來衡量不同品種(系)茭白對胡麻葉斑病的抗性水平。

由表1可知，在田間種植時，12個品種(系)的單季茭白發生了不同程度的胡麻葉斑病，根據病情指數的統計結果可知，杭州一點紅胡麻葉斑病病情指數高達42.84，發病情況較嚴重；大洋茭、本地八月茭、余茭1號B和金茭1號的病情指數都相對較低，發病情況較輕。

表1 茭白品種(系)胡麻葉斑病的病情指數

3 小結與討論

本研究利用完全展開的倒二葉離體培養接種病原菌，接種胡麻葉斑病菌5 d后記錄病斑面積，再利用像素換算面積比例的方式計算葉片菌斑的相對面積比例，以此衡量茭白品種對胡麻葉斑病的抵抗力。此方法具有快速簡便和易于重復的優勢，適用于大規模鑒定茭白種質資源對常見病害胡麻葉斑病的抵抗力，為田間選育抗病品種提供了參考依據。利用病情指數來衡量病害的發生情況，數據統計效果較好，能夠較全面地表現出植株的病害情況。利用室內離體葉片病斑面積鑒定抗性，并結合田間抗性調查結果，既驗證了利用離體葉片相對病斑面積比例進行抗性鑒定的可行性，又為田間選育高抗品種提供更全面可靠的依據。

根據試驗中不同茭白品種對胡麻葉斑病菌的抵抗力分析，胡麻葉斑病在侵染單季茭白時，葉片呈典型的褐色斑塊，驗證了接種方法的可行性。對田間病害調查發現，胡麻葉斑病在杭州一點紅植株上發生情況較嚴重，而在大洋茭、本地八月茭、余茭1號B和金茭1號上發生較輕，這與實驗室內的抗性檢測結果一致，與鄧建平等[13]報道的金茭1號在田間抗性監測中對胡麻葉斑病表現出較強的抗性相符。

綜上，結合室內抗性鑒定和田間抗性調查的結果，在12個單季茭白品種(系)中，本地八月茭、大洋茭、余茭1號B和金茭1號在室內和田間都表現出對胡麻葉斑病較高抗性，杭州一點紅抗性最弱，鄂茭1號、余茭3號、余茭1號A、浙農5號、浙農7號、回山茭、JJ11等的抗病性居中，為田間篩選高抗品種提供參考。利用茭白葉片離體培養鑒定胡麻葉斑病的抗性為大規模快速篩選高抗品種提供一種高效的技術手段。