鐵線蓮品種耐熱生理指標檢測

莫健彬， 蔣昌華*

(1.上海植物園， 上海 200231； 2.上海城市植物資源開發應用工程技術研究中心， 上海 200231)

鐵線蓮屬(Clematisflorida)為毛茛科(Ranunculaceae)直立灌木、草本，木質或草質藤本，是一類觀賞價值高、具有多種抗逆性的藤本植物。全世界約有鐵線蓮屬植物335種，廣泛分布于除南極洲以外的各大洲。中國鐵線蓮屬植物極其豐富，約有147種，全國各地均有分布，大部分種類分布于華中和西南地區。鐵線蓮喜涼爽氣候，在野生環境中常與灌木伴生。上海地區2017—2021年夏季持續的高溫(35 ℃以上)天氣多達1個月，嚴重影響了鐵線蓮的生長，如葉片變黃、萎蔫、脫落，莖稈還易感枯萎病，限制了鐵線蓮在上海地區的大面積推廣應用。因此，如何提高鐵線蓮品種耐熱性是園林工作者面臨的重要任務。

本研究從上海植物園現有的鐵線蓮品種中初步篩選20個觀賞性、耐熱性均較好的品種，通過一系列耐熱生理指標檢測，從中篩選耐熱性、觀賞性都比較優良的品種，為園林綠化增添了夏花植物品種，具有較強的綠化應用前景。

1 材料與方法

本研究選取上海植物園已引種的鐵線蓮品種中田間耐熱性能較強且有明顯差異的20個品種，上盆澆透水，恢復一周。在常溫(25 ℃)及熱激條件下(42 ℃/5 h)分別剪切成熟度相當的葉片用作試驗材料。

1.1 葉片相對電導率的檢測

用直徑1 cm的打孔器取樣(不取中脈)，稱取0.2 g樣品置于20 mL的試管中，加入10 mL去離子水，真空機抽氣15 min，室溫下靜置30 min(期間每隔5 min輕搖一次)后用DDS-11A型電導率儀測電導值。沸水中水浴保溫10 min，取出冷卻至室溫，輕搖后測電導值，計算相對電導率，以每克鮮重占有的相對電導率表示電導值[1]。

1.2 葉片相對含水量的檢測

稱取0.2 g剪碎的葉片置于稱量瓶中，放入烘箱中105 ℃殺青30 min，然后調至80 ℃烘至恒重，取出冷卻至室溫，稱干重，計算相對含水量，以每克鮮重占有的相對含水量表示[2-3]。

1.3 可溶性總蛋白含量檢測

0.2 g葉片按質量體積比1∶3加入提取緩沖液(50 mmol·L-1Tris-HCl，5 mmol·L-1MgCl2，1 mmol·L-1DTT，0.2 mmol·L-1EGTA，pH 7.5)，在冰浴中充分研磨，4 ℃下27 000 r·min-1離心15 min，重復離心2次，吸取上清液，備用。考馬斯亮蘭染色法測定蛋白含量，對照Bradford法制定的蛋白質標準曲線確定樣品濃度[4]。

1.4 葉片SOD活性的檢測

參照蔣昌華等[5]的方法，剪取葉片0.2 g在液氮中迅速研磨成均勻粉末。約0.1 g材料于3 mL提取緩沖溶液(50 mmol L-1Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH 7.0，含1.0 mmol L-1EDTA，0.05% Triton X-100，2%不溶性聚乙烯吡咯烷酮)中研磨成勻漿。經過10 000 r·min-15 min和16 000 r·min-120 min，4 ℃下兩次離心后，取上清液進行SOD活性測定。

SOD活性測定利用SOD抑制氮藍四唑(NBT)在光下被·O2-還原的反應。反應液為含13 mmol·L-1甲硫氨酸(核黃素電子供體)，75 μmol·L-1氯化硝基四氮唑藍，16.7 μmol·L-1核黃素(產生·O2-)，0.1 mmol·L-1EDTA的50 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.8)。在波長560 nm處，檢測吸光值。SOD活性以每毫克蛋白抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位，SOD比活力是SOD總活性與蛋白含量的比值。

1.5 丙二醛含量檢測

硫代巴比妥酸活性產物(TBARS)即丙二醛(molonaldehyde，MDA)，參考劉志洋等[6]方法，利用MDA和TBA反應生成粉紅色化合物來測定其含量。準確稱取約0.1 g材料于3 mL提取緩沖溶液(50 mmol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH 7.0，含1.0 mmol·L-1EDTA，0.05% Triton X-100，2%不溶性聚乙烯吡咯烷酮)中研磨成勻漿。經過10 000 r·min-15 min和16 000 r·min-120 min，4 ℃下兩次離心后，取上清液1 mL加入3 mL 0.5%硫代巴比妥酸，90～100 ℃(沸水中水浴)，反應15 min。冷卻至室溫下3 000 r·min-1離心5 min，取上清液可見分光光度計下分別讀取450 nm、532 nm和600 nm吸光值。計算MDA量(排除多糖干擾)，用每克鮮重中MDA的量表示。

2 結果與分析

2.1 葉片相對電導率

由表1可知，排名前12的品種在熱激過程中，葉片相對電導率上升不明顯，而排名后8的品種上升更為明顯。電導率與細胞膜損傷程度正相關，而與品種的耐熱性呈負相關[7]，說明排名前12的鐵線蓮品種耐熱性強，而排名后8的品種耐熱性弱。這些品種的耐熱性由強到弱順序為絨>直立鐵線蓮>豐富>卡梅西塔>阿拉貝拉>波蘭精神>勇士舞>華沙女神>暗夜天使>中國紅>東方晨曲>朱莉>阿柳>吉普賽皇后>愛莎>拉莫娜>如步>白王冠>索利納>金斯托韋克。

表1 各品種熱激后葉片相對電導率的變化

2.2 葉片相對含水量

表2數據表明，排名前12的品種在熱激過程中，葉片相對含水量上升明顯，而排名后8的品種上升不明顯，甚至略有下降。葉片相對含水量與品種耐熱性呈正相關[7]，說明排名前12的鐵線蓮品種耐熱性強，而排名后8的品種耐熱性弱，耐熱性由強到弱的順序為直立鐵線蓮>豐富>絨>卡梅西塔>阿拉貝拉>波蘭精神>華沙女神>勇士舞>暗夜天使>中國紅>東方晨曲>朱莉>阿柳>吉普賽皇后>拉莫娜>愛莎>如步>白王冠>索利納>金斯托韋克。

表2 各品種熱激后葉片相對含水量的變化

2.3 葉片可溶性蛋白含量

表3數據表明，排名前12的品種在熱激過程中，葉片可溶性蛋白含量上升較明顯，而排名后8的品種上升不明顯，甚至略有下降。可溶性蛋白含量與品種耐熱性呈正相關[5]，說明排名前12的鐵線蓮品種耐熱性強，而排名后8的品種耐熱性弱。它們耐熱性由強到弱的順序為絨>直立鐵線蓮>豐富>卡梅西塔>阿拉貝拉>波蘭精神>華沙女神>勇士舞>暗夜天使>中國紅>東方晨曲>朱莉>阿柳>吉普賽皇后>拉莫娜>如步>愛莎>索利納>白王冠>金斯托韋克。

表3 各品種熱激后葉片可溶性蛋白含量的變化

2.4 葉片SOD比活力變化

表4數據顯示，SOD比活力在熱激脅迫過程中均有上升，上升值與品種耐熱性呈正相關[5]，排名前列的品種耐熱性強于排名靠后的品種。它們耐熱性由強到弱的次序為絨>直立鐵線蓮>豐富>卡梅西塔>阿拉貝拉>波蘭精神>華沙女神>勇士舞>暗夜天使>中國紅>東方晨曲>朱莉>阿柳>吉普賽皇后>拉莫娜>如步>愛莎>索利納>白王冠>金斯托韋克。

表4 各品種SOD比活力的變化

2.5 葉片MDA含量變化

丙二醛是過氧化產物，不耐熱品種在熱激脅迫過程中產生的氧化產物越多，也就是MDA含量越高[5]。表5數據表明，排名靠前的品種越耐熱。它們耐熱性由強到弱的次序為直立鐵線蓮>絨>豐富>卡梅西塔>阿拉貝拉>波蘭精神>華沙女神>勇士舞>暗夜天使>中國紅>東方晨曲>朱莉>阿柳>吉普賽皇后>拉莫娜>如步>索利納>愛莎>白王冠>金斯托韋克。

表5 各品種MDA含量的變化

3 討論

高溫是影響植物生命活動的主要外界環境因子之一，其對細胞膜體系的損傷是造成植物熱害的根本機制。高溫傷害對組織的損傷主要是使細胞膜受到破壞，從而引發生理、代謝及生物化學方面的功能障礙。植物在受到熱激脅迫時，細胞膜的不飽和脂肪酸會發生氧化降解，導致膜的孔隙變大，細胞內離子大量外泄，從而導致組織滲出液電導率的增加，因此通過組織滲出液電導率的變化來判斷細胞受害情況，是最為常用的耐熱性測定方法[5]。

植物在熱激脅迫條件下，葉片持水能力下降，水份流失。耐熱性強的品種，其葉片保水能力較強，表現為葉片的含水量略有上升。而耐熱性差的品種葉片失水更為嚴重，葉片含水量下降。所以，植物葉片相對含水量的變化幅度與鐵線蓮品種的耐熱性有一定的相關性[6]。

在熱脅迫開始階段，不耐熱品種即開始產生熱激蛋白，而耐熱品種對熱激脅迫反應相對滯后。當脅迫時間延長，耐熱品種的蛋白合成增加，而不耐熱品種的蛋白合成在下降，表現出可溶性蛋白含量的降低[7]。在脅迫初期，氧的積累會誘導SOD比活力增加，隨著脅迫程度的加劇，細胞結構和功能受到嚴重損傷，則SOD比活力最終會下降。耐熱品種在熱激脅迫過程中其SOD比活力一直能保護較高水平，抗氧化能力較強。所以，SOD活性與耐熱性正相關[8]。

MDA是脂質過氧化的主要產物之一，其含量可表示脂質過氧化的程度，而且MDA本身對植物細胞具有明顯的毒害作用。隨著鹽脅迫程度的增加，植物細胞過氧化程度加劇，過氧化產物MDA含量上升。抗性強的品種抗氧化酶活性高，抗過氧化能力強，產生的過氧化產物MDA就少，反之，MDA產量則多[8]。

上述生理生化指標在常溫與熱激過程中的變化趨勢與鐵線蓮品種的耐熱性相一致，也與鐵線蓮品種田間耐熱表現基本吻合，可作為鐵線蓮品種耐熱性篩選指標，本研究結果也可作為其他園林植物耐熱性篩選指標，為園林植物耐熱篩選生理指標體系的建立奠定了理論基礎。