多層螺旋CT灌注成像評價乳腺癌微血管生成的研究

耿鶴群，張志林，張曉辰，梁占東，李永，崔書君

河北北方學院附屬第一醫院,a 醫學影像部，b 放射治療科，張家口 075000

腫瘤新生血管形成是腫瘤生長和發展過程中的重要生物學行為[1]。實體腫瘤的生長和轉移依賴于新生血管形成來供給能量。評價腫瘤新生血管情況對于判斷腫瘤的分期、良惡性，評估抗腫瘤療效及預后均有重要意義。應用目前傳統影像技術CT、核磁，只能分辨出直徑在200 μm以上的血管[2]。多層螺旋CT(MSCT)灌注成像檢查可較好地反映血流灌注情況[3-4]。目前國內MSCT灌注成像檢查應用于乳腺疾病的報道尚不多見。本研究對98例(137個)乳腺實質腫塊行MSCT灌注成像檢查，考察乳腺癌血流灌注特點，分析其與微血管生成(AG)的相關性，探討將MSCT技術應用于臨床評價乳腺實質腫塊的意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2018年1月至2019年12月河北北方學院附屬第一醫院接診的98例成年女性乳腺實質性腫瘤患者，年齡19～66歲，因自行或體檢做B超檢查發現單側乳腺腫塊，病灶最大直徑范圍0.8～11.0 cm。納入標準：成年女性；所有患者均有完整的臨床資料及手術病理資料；首診病例，經病理學檢查結果確診；患者均簽署知情同意書。排除標準：既往有乳腺實質性病變；乳腺良性增生；乳腺囊腫；乳腺炎性病變；其他部位的惡性腫瘤繼發乳腺轉移;對本研究中影像學檢查不耐受，或對造影劑過敏者；合并基礎性疾病，比如心、肝、腎等重大臟器的功能衰竭，不宜納入臨床研究的情況。本研究經河北北方學院附屬第一醫院倫理會批準。98例成年女性乳腺實質性腫瘤患者病理診斷結果見表1。

表1 98例成年女性乳腺實質性腫瘤患者病理診斷結果

1.2 研究方法

1.2.1 影像學檢查 患者均經乳腺超聲、鉬靶照射檢查等，發現單側乳腺腫塊。于其月經結束后的第3～5天分別行常規MSCT平掃和MSCT灌注掃描檢查。(1)掃描前：經肘正中靜脈穿刺，留置靜脈針(18G)。指導患者進行腹式呼吸，確?；颊哽o止不動，在各序列掃描過程中病灶保持同一位置。(2)常規MSCT平掃：于患者吸氣末平掃，掃描范圍自腋窩頂至乳腺下緣。管電壓：120 kV，管電流：100 mA，探測器寬：0.6～64 mm，容積采集重建層厚及間距：7.0 mm。(3)確定病變部位：采用最大層面全腫瘤法，分別選取實質性乳腺腫瘤組織、癌旁正常乳腺腺體組織為興趣區，選擇腫瘤最大中心層面作為灌注掃描層面，選取腫瘤所在最大層面胸主動脈為輸入動脈。分別取2～3個感興趣區測定參數值。(4)MSCT灌注掃描成像：掃描設備是Sensation 64層螺旋CT掃描儀(Siemens西門子公司)。經前臂靜脈注入20 mL 0.9%氯化鈉注射溶液，確定無滲漏，采用自動高壓注射器以6 mL/s速率注入非離子對比劑50 mL(300 mgI/mL),再以同樣速率注入20 mL 0.9%氯化鈉注射溶液，延遲5 s。行灌注掃描：選擇多層連續動態電影掃描模式。掃描分3個序列，每個序列30 s、間隔10 s。掃描中每次球管曝光0.5 s，間隔0.5 s、2.5 s、4.5 s,有效放射劑量=596.7×0.05=29.84 mSv。其他掃描參數的設置與平掃相同。探測器寬度：2～24 mm，重建層厚：7.2 mm。(5)圖像后處理：共可得到4×46幅掃描圖像，將掃描所得傳送至Leonardo圖像處理工作站。采用Functional CT中Body Perfiasion體部腫瘤灌注包進行灌注成像數據分析:由軟件自動處理數據，得出各興趣區的灌注參數血管表面通透性(PS)值。

1.2.2 標本取材及免疫組織化學檢查 (1)標本取材：全部98例患者均于MSCT檢查后3 d內手術。標本取材選取乳腺癌患者腫瘤實質部分(70例,72個單側病灶)及距標本癌塊l cm的無癌浸潤的腺體組織(30個,作為對照)，以及乳腺良性實質病變患者的腫瘤實質部分(28例,65個單側病灶)。標本均經中性甲醛溶液(10%)固定、石蠟包埋和切片(層厚3 m)，再經常規HE染色制成免疫組織化學切片。免疫組織化學檢查方法：鼠抗人CD105單克隆抗體試劑盒(產品貨號:561439)購自重慶市華雅干細胞技術有限公司。(2)免疫組織化學染色石蠟切片：水浴法修復抗原，磷酸緩沖液(PBS)沖洗后在室溫下孵育，加鼠抗人CD105單克隆抗體4 ℃過夜，PBS沖洗后加生物素標記的二抗，再PBS沖洗后加鏈霉菌抗生素，在過氧化物酶溶液室溫下孵育，PBS沖洗后3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)染色，蘇木素復染，水性封片劑封片。以已知乳腺癌陽性片為陽性對照；PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 結果判斷方法 (1)微血管密度(MVD)：按照Weidner等方法計數[5]。100倍光鏡下掃視整個切片，取3個密度最高區，在400倍光鏡下(日本尼康雙目光學顯微鏡，ECLIPSE Ci 系列)計數棕紅色微血管的數量。單個孤立或多個緊密排列的內皮細胞團，與鄰近腫瘤細胞或周圍結締組織分界清楚，無論有無管腔，計為1個微血管數[6]。管徑>8個紅細胞或伴明顯平滑肌脈管，不做計數。(2)Spearman相關性分析：對MSCT灌注成像的各個參數進行定量分析，考察其與MVD的相關性。參數包括：最大密度投影(MIP)、增強平均值(AV)、血流量(BF)、血容量(BV)、血管表面通透性(PS)、Patlak血容量(PBV)。

2 結果

2.1 不同乳腺組織MSCT灌注成像參數比較 乳腺癌組織MSCT灌注參數PS、MIP、AV、BF、BV、PS、PBV均值分別都高于乳腺良性實質腫塊組織和乳腺癌旁正常乳腺組織，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同乳腺組織MSCT灌注成像參數比較

2.2 不同乳腺組織標本MVD比較 400倍鏡下單個視野中,乳腺癌組織的MVD[(24±7)個]明顯高于乳腺良性實質腫塊組織[(2±1)個]及乳腺癌旁正常乳腺組織[(1±1)個]，差異有統計學意義(F=503.051，P<0.001)。

2.3 MSCT灌注成像參數與MVD的相關性 乳腺癌MSCT灌注成像參數中，MIP(r=0.42)、AV(r=0.44)、BF(r=0.49)、BV(r=0.47)、PS(r=0.48)、PBV(r=0.45)與MVD均呈正相關(P值均<0.05)。

3 討論

乳腺癌是血液供應豐富且表面通透性高的惡性腫瘤類型[7]。乳腺癌腫瘤浸潤和轉移是復雜的演變過程，其中腫瘤新生血管生成是惡性腫瘤生物學行為的營養保障。乳腺癌存在大量增加的新生腫瘤血管，這些不成熟的血管內皮間隙較正常血管明顯增寬，使得內皮細胞之間的連接松散、甚至部分毛細血管壁缺乏內皮細胞，加之腫瘤相關炎癥細胞因子等高表達，導致血管基底膜的完整性被破壞，因而腫瘤血管通透性增加。

CT灌注成像是一種可以定量分析腫瘤血管生成情況的成像方法,其可較好地反映腫瘤血管狀態，量化血管通透性[8-9]。應用MSCT灌注成像檢查，可較好地反映血流灌注情況，可避免穿刺活檢或手術切除活體組織標本行病理學檢查可能給機體帶來的諸多不利影響。

腫瘤新生血管與正常血管的功能不同，通透性也是不同的。腫瘤血管越豐富、幼稚性程度越高，其惡性程度越高[10]。不同分級和分期的惡性腫瘤，其腫瘤血管的通透性也不同。一項對Wistar雌性大鼠(n=35) 誘發乳腺腫瘤的動物實驗[11]中，應用CT灌注成像(CTPI)技術考察腫瘤血管生成的情況。其結果表明，CTPI可反映腫瘤組織分化程度,有助于判斷乳腺病變的良惡性。本研究中對不同性質的乳腺實質性腫塊患者均應用了MSCT灌注成像影像學檢查技術，考察其血管灌注參數。本研究結果可見，乳腺癌MSCT灌注參數MIP、AV、BF、BV、PS、PBV均值分別都高于乳腺良性實質腫塊組織和乳腺癌旁正常乳腺組織(P<0.05)。可見臨床應用MSCT技術、監測其灌注參數，可以較好地反映乳腺癌腫瘤新生血管的通透性。乳腺良性實質腫塊組織及癌旁正常乳腺組織血管與之相比，呈低灌注的顯像，可見通過MSCT參數可以較好地對乳腺實質性腫塊的良惡性進行初步評估。如上述乳腺癌MSCT灌注參數的結果，是符合乳腺癌的腫瘤血管通透性增加、MSCT下呈高灌注狀態的生物學行為的。乳腺癌的微血管管壁基底膜不完整，細胞間隙較大，可致對比劑外滲，故本研究結果中PS增高，證實了乳腺癌的MSCT灌注成像不同于良性實質腫瘤和正常腺體組織。另外，研究顯示，乳腺癌組織可能通過分泌血管內皮生長因子(VEGF)而促進腫瘤血管的生成[12-13]。本研究結果中，乳腺癌組織MSCT灌注成像參數BF、BV增高，提示其血管的高灌注、高滲透，與文獻報道[14]也是吻合的。

文獻[15]研究中對乳腺癌MSCT灌注成像參數與微血管密度(MVD)的相關性進行了探討。其研究結果顯示，MSCT灌注成像參數中，乳腺實質腫瘤(28個標本)MVD高于良性實質腫瘤(25個標本)及癌旁正常腺體(26個標本) (t=17.67、15.99,P<0.05)，乳腺實質腫瘤MVD與VEGF呈正相關(r=0.82,P<0.05)。該研究結果表明MSCT可作為考察乳腺癌腫瘤血管生成情況的無創性的影像學手段。

MSCT灌注成像可反映腫瘤瘤體的血流動力學情況[16-18]。本研究結果可見，乳腺癌組織MVD高于癌旁正常腺體組織及乳腺良性實質腫瘤組織(P<0.05)，與已有的研究報道[19-20]是一致的。本研究中乳腺癌組織MSCT灌注參數MIP、AV、BF、BV、PS、PBV與MVD均呈正相關(P值均<0.05)，可見應用MSCT灌注成像檢查可較好地反映乳腺癌微血管分布情況及其血流灌注的變化。由此提示，利用乳腺MSCT灌注對實質性腫塊區域進行定位，指導取活檢標本是更有意義的。

此外，MSCT灌注成像能近似地反映腫瘤的血管生成，其對功能性可灌注的毛細血管敏感。但腫瘤的血管生成是復雜的病理過程，可能有毛細血管內皮細胞增生，也可能未生成功能性的管腔化血管。因此，MSCT灌注成像在臨床的應用也有其局限性[21]。臨床需結合MSCT灌注成像結果及其他常規的影像學檢查結果來綜合分析做出對乳腺實質性腫塊的最終臨床診斷結論。本組認為，對于乳腺腫塊患者，臨床需采取合理的檢查手段盡快予以確診，以便采取相應的治療措施。新生血管形成是惡性腫瘤的重要生物學行為。借助目前常用的影像檢查技術只能分辨出直徑在200 μm以上的新生血管形成。MSCT檢查可良好地反映血流灌注情況，但有關其在臨床應用的研究報道比較少。本研究將MSCT灌注成像檢查技術應用于臨床，獲得了腫瘤新生血管的解剖細節，并經分析獲得了MSCT灌注參數與微血管生成的相關結果，故在無創性在體診斷乳腺實質性腫塊、鑒別診斷乳腺腫塊良惡性方面具有積極的輔助診斷價值，這是本研究的創新點所在。目前尚無乳腺癌患者年齡對MSCT灌注成像技術(參數)影響的相關文獻報道。本研究中也未以年齡分層做細致分析，這也提示我們未來可以在MSCT灌注成像相關參數及年齡等對乳腺癌微血管生成評估方面的影響進行深入探索。

綜上所述，MSCT灌注成像可作為檢測乳腺癌微血管生成情況的一種有價值的無創的影像學手段，其能顯示腫瘤新生血管的解剖細節、獲得其MSCT灌注參數，可為乳腺實質性腫塊的良惡性診斷與鑒別診斷、活檢定位等方面提供有價值的血流動力學信息，該檢查技術應用簡單、可重復操作，圖像結果不易受到其他因素的影響。