火麻仁粕蛋白水解液對發酵乳品質及抗氧化活性的影響

肖瀟，王鵬，邵童，馬昕怡，顧瑞霞，陳霞

(江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室(揚州大學)，江蘇 揚州，225000)

發酵乳是牛乳經乳酸菌發酵制成的具有獨特風味、均衡營養以及多重生理功能的乳制品[1]。近年來，隨著人們對健康、營養型功能食品需求的不斷增加，功能性發酵乳開發已成為食品行業的研究熱點。目前，國內外許多學者開展了添加蛋白質和多肽的功能發酵乳研究，如添加蛋清蛋白[2]、乳清蛋白水解物[3]和大豆分離蛋白酶解物[4]等可以提高發酵乳的貯藏穩定性和益生菌活性；同時也有人研究將核桃粕多肽[5]、膠原蛋白肽[6]、小麥面筋蛋白肽[7]等用于功能性發酵乳的開發，結果發現不僅可以提高發酵乳的小分子肽含量，還可以提高發酵乳的抗氧化活性等功能。

火麻是一種重要的食品、醫藥和纖維植物，在我國廣西、云南等地種植廣泛[8]。火麻仁是火麻的成熟種仁，富含油脂、蛋白質和礦物質，是優質的植物油脂和蛋白資源[9]。火麻仁粕是火麻仁提取完油脂后的副產物，約含33%的蛋白質，不含蛋白酶抑制劑，且必需氨基酸和精氨酸含量較高，屬高價值植物蛋白資源。但目前大多數火麻仁粕都被用于飼料或肥料，造成極大的資源浪費[10]。本試驗從火麻仁粕中提取蛋白質，并利用堿性蛋白酶酶解不同時間后，得到不同水解度的火麻仁粕蛋白水解液(hemp seed meal protein hydrolysate, HP)。然后將HP添加到發酵乳中，研究不同酶解度的HP對發酵乳品質及抗氧化活性的影響，以期為開發新的功能發酵乳和提高資源利用率提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

乳粉，揚大康源乳業有限公司；脫脂火麻仁粕，遼寧俏牌生物科技有限公司；白砂糖，揚州麥德龍超市采購；嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌，江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室分離保藏；堿性蛋白酶，浙江一諾生物科技有限公司；水楊酸、鐵氰化鉀，國藥集團化學試劑有限公司；硫酸亞鐵，天津科密歐試劑有限公司；DPPH，麥克林；三氯乙酸，上海山浦化工有限公司；NaOH、HCl、濃H2SO4及其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

1510型酶標儀，美國Thermo公司；JF-SX-500全自動滅菌鍋，日本TOMY公司；5804R高速冷凍離心機，德國EPPEENDORF公司；SPX-150BS生化培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；pH S-25 型數顯pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；TMS-PRO質構儀，美國FTC公司；全自動凱氏定氮儀，北京盈盛恒泰科技有限責任公司；FREEZONE18L冷凍干燥機，美國LABCONCO公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 火麻仁粕蛋白的提取

參考林金鶯[11]的方法提取火麻仁粕中的蛋白質，并將其冷凍干燥。

1.3.2 火麻仁粕蛋白水解

火麻仁粕蛋白與去離子水以質量比1∶25配制蛋白溶液，每克蛋白質加入2 000 U堿性蛋白酶，酶解溫度45 ℃，酶解pH 8.5，分別水解4、8、12、16、20 h，沸水滅酶10 min，冷卻，將溶液調至中性，離心收集上清液，得HP，分別記為H-4、H-8、H-12、H-16、H-20。

1.3.3 火麻仁粕蛋白水解度測定

參考陳霞等[12]的方法測定火麻仁粕蛋白水解度。

1.3.4 發酵乳樣品制備工藝流程

發酵乳樣品制備工藝流程如下：

12%全脂復原乳+7%白砂糖+6%HP→混合→均質(55 ℃，20 MPa)→滅菌(95 ℃，10 min)→冷卻(42 ℃左右)→接種(3%)→發酵(42 ℃)→后熟(4 ℃，24 h)→成品

1.3.5 凝乳時間確定

參考胡凱麗等[13]的方法，待發酵乳滴定酸度至75 °T時記為發酵完成，記錄時間。

1.3.6 質構特性測定

參考陳霞等[12]的方法，采用質地剖面分析(texture profile analysis,TPA)法，使用TMS-PRO 質構儀進行發酵乳質構的測定。測試條件：力量感應元的量程25 N；起始力0.01 N，檢測速度1 cm/min，形變百分量60%。

1.3.7 pH值和滴定酸度測定

發酵乳的pH值參考GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》使用精密pH計進行測定；發酵乳的滴定酸度參考GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》進行測定。

1.3.8 持水率測定

參考陳霞等[12]的方法，稱取7.00 g的發酵乳置于10 mL離心管中，6 000 r/min，30 min條件下離心，稱量上清液質量。發酵乳的持水率計算如公式(1)所示：

(1)

1.3.9 活菌數測定

參考GB 4789.35—2016中的平板計數法測定發酵乳中的活菌數。

1.3.10 感官評價

感官評價標準參照GB 19302—2010《食品安全國家標準 發酵乳》進行設定，參評人員為接受過感官評定培訓的食品科學專業的10位學生(5男5女)，按照表1對發酵乳進行感官評分。

表1 感官評定標準Table 1 Criterion of sensory evaluation

1.3.11 抗氧化能力測定

1.3.11.1 樣品前處理

于10 mL離心管中加入3 g發酵乳樣品和4 mL甲醇，超聲1 h，8 000 r/min條件下離心15 min，收集上清液。

1.3.11.2 DPPH自由基清除能力測定

參考LEE等[14]的方法，于517 nm處測定吸光度。

1.3.11.3 羥自由基清除能力測定

參考SHEN等[15]的方法，于510 nm處測定吸光度。

1.3.11.4 總還原能力測定

參考WANG 等[16]的方法，于700 nm測定吸光度。吸光值越高，還原能力越強。

1.4 數據分析

實驗數據均采用SPSS 17.0和Origin 8.0軟件進行統計分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 火麻仁粕蛋白酶解液的水解度分析

火麻仁粕蛋白經堿性蛋白酶酶解不同時間的水解度如表2所示。火麻仁粕蛋白酶解液的蛋白質含量、氨態氮含量和水解度均隨著酶解時間的延長而不斷升高，且在前12 h內水解度顯著升高(P< 0.05)，12 h后水解度上升緩慢。說明在前12 h內絕大多數的火麻仁粕蛋白被酶解成短肽鏈，之后由于底物濃度和酶濃度的降低，且受酶解產物的抑制，酶解速率降低。為研究不同水解度HP對發酵乳品質的影響，選取低(H-4)、中(H-8)、高(H-12)3 個不同水解度的HP添加到發酵乳中，研究發酵乳品質及抗氧化活性的變化。

表2 火麻仁粕蛋白酶解液的水解度變化Table 2 Changes in the hydrolyzing degree of hemp seed meal protein hydrolysate

2.2 不同水解度HP對發酵乳品質的影響

由表3可知，添加HP能顯著降低發酵乳的凝乳時間和膠黏性，提高發酵乳的內聚性、彈性和感官評分。空白組的凝乳時間為8.04 h，H-4、H-8和H-12組的凝乳時間分別比空白組縮短了1.44、1.80和1.99 h，說明水解度高的HP促發酵效果較好。原料奶里非蛋白氮含量較低，添加HP增加了發酵乳中小分子肽類和游離氨基酸的含量和種類，增加了乳酸菌可利用的氮源物質，可以促進乳酸菌生長代謝，使凝乳時間顯著縮短。發酵乳的質構特性與酪蛋白的凝膠特性有直接的關系，HP含有的小分子肽可以增大發酵乳的黏度，同時可以促進乳酸菌生長產生胞外多糖，從而使發酵乳的內聚性和彈性增大[17]。趙強忠等[18]研究發現大豆分離蛋白經胰酶酶解24 h得到的酶解液對酸乳有較強的促發酵作用和增黏作用。添加了HP的3組發酵乳樣品兼具發酵乳的香味和HP的香氣，口感細膩，質地均勻，感官評分均顯著高于空白組(P<0.05)，其中H-8組感官評分最高，為88.0分，產品的發酵乳香氣和肽液的香氣協調，口感最佳。

表3 發酵乳的發酵性能表Table 3 Fermentation performance table of fermented milk

2.3 HP水解度對發酵乳貯藏特性的影響

2.3.1 發酵乳貯藏過程中滴定酸度的變化

由圖1可知，隨著貯藏時間延長，4組發酵乳的滴定酸度均不斷升高，其中空白組升高的幅度最大，到第21天時達到92.0 °T，比第0天高了17.0 °T；而添加量HP的3組樣品的滴定酸度增幅均明顯低于對照組，其中H-8組在冷藏至21 d時的滴定酸度最低，為87.5 °T。這是因為在低溫貯藏過程中，乳酸菌仍會利用發酵乳中的乳糖發酵產酸，造成發酵乳酸度的持續上升，酸度過高則會影響產品的可接受度。HP中的蛋白質具有一定的酸中和能力，對于延長發酵乳的保質期和儲藏期間的穩定性有一定的效果。趙強忠等[4]研究發現，大豆分離蛋白酶解產物中的小分子組分可通過降低酸奶中的桿/球菌比值從而減緩酸奶的后酸化過程。

圖1 發酵乳在貯藏期間的滴定酸度變化Fig.1 Changes of titration acidity fermented milk during storage

2.3.2 發酵乳貯藏過程中持水率的變化

持水率的高低可以反映發酵乳凝膠網絡體系的穩定性。由圖2可知，H-8組的持水率隨貯藏時間延長一直保持上升趨勢，到第21天時的持水率為33.87%；其余各組的持水率呈先上升后下降趨勢；其中H-4和H-8組的持水率在貯藏期內一直保持較高狀態，到第21天時的持水率均大于30.00%，而空白組和H-12組到此時已經降到25.00%以下，說明在貯藏后期發酵乳的凝膠網絡結構不穩定。這是因為發酵乳在貯藏初期的凝膠結構緊實，隨著貯藏時間的延長，酸度不斷降低，會影響酪蛋白凝膠網絡的穩定性，其中空白組和H-12組樣品的酸度較低，使得發酵乳的持水率下降[19]。

圖2 貯藏期內發酵乳持水率的變化Fig.2 Changes in the water holding rate of fermented milk during storage

2.3.3 發酵乳貯藏過程中活菌數的變化

在4 ℃貯藏21 d發酵乳的活菌數變化見圖3。添加了HP的3組發酵乳的活菌數在21 d內均顯著高于空白組，H-4和H-8組在21 d內活菌數呈上升趨勢，而空白組在第7天后開始下降，第21天時的活菌數下降為8.92 lgCFU/g；H-12組的活菌數呈先上升后下降的趨勢，在第14天時活菌數達最高值，為9.31 lgCFU/g。上述實驗結果說明添加HP可以促進乳酸菌的增殖，HP中的小分子肽和非極性游離氨基酸是乳酸菌理想的氮源，具有促進乳酸菌的生長代謝的作用，而牛乳中的蛋白質因分子質量較大，需經過保加利亞乳桿菌水解成酪蛋白才能被嗜熱鏈球菌利用，因而空白組在后期活菌數下降迅速。胡月等[20]將大豆肽加入凝固型酸奶，發現大豆肽可以顯著提高其貯藏期內的活菌數和氨基酸含量，可能是因為大豆肽本身含有谷氨酸、亮氨酸、甘氨酸等氨基酸有利于保持乳酸菌生長。

圖3 貯藏期發酵乳活菌數的變化Fig.3 Changes in the number of viable cells of fermented milk during storage

2.4 不同水解度的HP對發酵乳體外抗氧化活性的影響

由表4可知，添加了HP的3組樣品的DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和總還原能力均顯著高于空白組(P<0.05)，其中H-8組和H-12組的DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力顯著高于H-4組，而H-4組的還原能力最高，為0.61%。上述結果說明，添加HP可顯著提供發酵乳的抗氧化能力，這是因為蛋白質被蛋白酶水解后分子構象發生變化，一些具有抗氧化能力的氨基酸殘基被暴露出來，如色氨酸、酪氨酸、組氨酸和苯丙氨酸等，是樣品組抗氧化能力提高的原因[21]。戴梓茹等[22]研究發現添加牡蠣肽可以顯著提高酸奶的總還原能力和DPPH自由基清除能力。伍亞龍等[23]利用胰蛋白酶將原料乳適度水解后再接入發酵劑發酵，制得的發酵乳抗氧化活性也顯著提高。

表4 發酵乳的體外抗氧化活性Table 4 In vitro antioxidant activity of fermented milk

3 結論

從火麻仁粕中提取蛋白質，經堿性蛋白酶酶解不同時間后，得到水解度分別為8.45%、13.24%和16.62%的HP。將HP添加到發酵乳中，發現不同水解度的HP均顯著縮短了發酵乳的凝乳時間，降低了發酵乳的膠黏性，提高了發酵乳的內聚性、彈性和感官評分；對發酵乳貯藏特性的研究表明，添加HP能緩解發酵乳的后酸化，提高發酵乳的持水率和活菌數。發酵乳的抗氧化活性研究表明，添加HP顯著提高了發酵乳的抗氧化活性，但H-8組和H-12組的抗氧化活性無顯著差別。H-8組在貯藏末期酸度上升幅度較小，第21天時持水率最高，感官評分最高，活菌數含量和抗氧化活性也較高，為品質最佳的一組樣品發酵乳。