基于實時質譜快速監控牦牛肉水煮過程中羧甲基賴氨酸和羧乙基賴氨酸的生成

張聰，叢夢，傅小玲，黃琴，李偉麗，陳伍志，吳韜*

1(西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都，610039)2(四川紅原溜溜牛食品有限責任公司，四川 阿壩藏族羌族自治州，624400)

美拉德反應是指還原糖類等羰基化合物和氨基化合物之間的反應，其除了會賦予食品獨特的風味和誘人的色澤，還會產生糖基化終末產物(advanced glycation endproducts，AGEs)等有害物質[1]。AGEs 在食品中廣泛存在并通過攝入的食品積累在體內，有研究表明食品中羧甲基賴氨酸[Nε-(carboxymethyl)lysine，CML]、羧乙基賴氨酸[Nε-(carboxyethyl)lysine，CEL]是體內AGEs 的主要來源[2]，AGEs 的積累會使人體產生氧化應激反應，對糖尿病、腎病、動脈粥樣硬化、阿爾茲海默癥等疾病的誘發有著重要影響[3]。相對于低 AGEs 含量的飲食，攝取 AGEs 含量較高的食物容易引起實驗動物腎病的發生[4]。因此檢測與限制調控食品中的AGEs對于保障食品安全具有重要意義。目前報道的檢測方法主要為酶聯免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[5]、熒光檢測法[6]、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[7]、液相色譜-串聯質譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)[8]。ELISA準確度低，多用于檢測總的AGEs含量；熒光檢測法則一般用于能夠自發熒光的AGEs的檢測；GC-MS需要在測試前將樣品進行復雜的衍生化；LC-MS/MS則需要復雜的前處理，需要使用固相萃取小柱對AGEs進行凈化[9]，單次進樣需要進行長時間的色譜分離，費時費力。

實時直接分析質譜(direct analysis in real time mass spectrometry，DART-MS)是一種開放式離子化質譜技術[10], 其主要結構包括DART離子源、軌道式進樣器及質譜(圖1)。該技術優點在于，對樣品前處理要求較低、不需要色譜分離，因此能夠對樣品進行高通量檢測[11]。近年來，DART-MS已經廣泛應用于食品領域[12]。本研究以水煮牦牛肉為研究模型，擬建立一種基于DART-MS/MS技術的CML和CEL高通量快速檢測方法，并考察外源性抗氧化食品原料苦蕎、藤椒對牦牛肉水煮過程中CML、CEL生成的影響。研究結果將為食品中CML和CEL高通量快速檢測、開發高品質牦牛肉產品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛肉，四川省溜溜牛食品有限公司；苦蕎粉、藤椒粉，市售。

CML標準品(純度98%，加拿大TRC公司)；蘆丁標準品(純度98%)，成都普瑞法科技開發有限公司；甲醇(色譜級)，上海易恩化學技術有限公司；正己烷、NaNO2、AlCl3·6H2O，成都市科隆化學品有限公司；高純N2、高純He，成都泰竽工業氣體有限公司。

圖1 DART-MS檢測系統Fig.1 DART-MS determination system

1.2 儀器與設備

DART離子源，美國Ionsense公司；SCIEX 3500 三重四級桿質譜儀，美國AB SCIEX公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的制備

精確稱取CML標準品，用甲醇溶解、稀釋配制成質量濃度分別為50.0、30.0、20.0、10.0、5.0、1 μg/mL 的CML標準溶液[13-14]。

1.3.2 牦牛肉樣品的準備

將50 g牦牛肉均勻切成1 cm3大小的塊，加入200 mL冷水中進行煮制，煮制時分別加入牦牛肉質量0%(對照組)、10%、30%和50%的苦蕎粉或藤椒粉，12 min后取出。每組3個平行。

1.3.3 牦牛肉中CML與CEL的提取

參考ZHANG等[15]和HEGELE等[16]的研究：取煮制后的牦牛肉5 g剁碎，將剁碎后的牦牛肉樣品放于50 mL離心管中，加入20 mL預冷后的20 g/L三氯乙酸水溶液，除去蛋白沉淀。將上清液采用正己烷脫除油脂，將下清液置于真空離心濃縮機進行濃縮干燥，加入2 mL甲醇水溶液(體積比8∶2)復溶，經0.22 μm 微孔有機濾膜過濾后裝入樣品瓶中，備用。

1.3.4 苦蕎、藤椒總黃酮的測定

根據REMIREZ等[17]的研究方法略作修改后測定苦蕎粉和藤椒粉中的黃酮含量。結果以毫克蘆丁當量每100g干物質(mg RE/100g DW)計。

1.3.5 質譜條件

DART SVP離子源條件：采用高純He為工作氣體；DART離子源與質譜儀距離2 cm，進樣針移動速度為0.6 mm/s；進樣體積1 μL。質譜條件：正離子掃描模式，去簇電壓40 V，碰撞能量20 V。

1.4 計算方法

1.4.1 基質效應的計算

通過公式(1)計算牦牛肉樣品中CML的基質效應。

(1)

1.5 數據處理

實驗數據采用SPSS統計軟件進行分析，使用GraphPad Prism 8進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 CML和CEL的二級質譜裂解行為及定量離子對選擇

預試驗表明，CML、CEL均在正離子模式下才有信號，因此，本研究均采用質譜正離子模式進行測試。為了降低CML、CEL的檢出限，需要對CML、CEL二級質譜裂解行為進行研究，選擇合適的定量檢測離子對[多反應監測模式(multiple reaction monitoring，MRM)]。對牦牛肉樣品中CML、CEL分別進行二級質譜掃描，其二級質譜圖見圖2。

a-CML二級質譜圖；b-CEL二級質譜圖圖2 牦牛肉樣品中CML、CEL的二級質譜圖Fig.2 DART-MS/MS fragments of CML and CEL

由于CML與CEL僅僅相差1個—CH2結構，其二級質譜裂解規律非常類似。本文僅以CML的二級質譜裂解規律為例進行解析。如圖2和圖3所示，CML的分子離子峰為m/z205。碎片m/z130是m/z205經歷氫重排后，脫去1個氨基乙酸基團形成的；碎片m/z84是由m/z130脫去1個—HCOOH形成；m/z142 是由m/z205依次脫去—H2O、—CO，電子遷移形成雙鍵后脫去—NH3形成。由于碎片m/z130為最強信號峰，因此CML選擇205～130為定量離子對，CEL選擇219～130為定量離子對。

圖3 樣品中CML二級質譜裂解規律Fig.3 DART-MS/MS cracking law of CML

2.2 DART-MS條件優化

在DART-MS測試樣品的過程中，解析氣體的溫度會顯著影響待測樣品組分的電離效率[18]。因此，本研究考察了解析氣體的溫度對CML一級母離子(m/z205)響應強度的影響。如圖4-a所示，隨著氣體溫度從 300 ℃逐漸升至 450 ℃時，CML響應強度逐漸升高；當溫度升至 500 ℃時，CML的響應強度開始下降。因此，選用450 ℃為解析氣體的最優溫度。

柵網電極電壓能夠減少空氣中的雜質離子，可以減少質譜圖上的背景干擾[19]。本研究考察了100～300 V的柵網電極電壓對待測組分響應強度的影響。如圖4-b所示，CML的響應強度在150 V時信號強度最大，隨后CML母離子響應強度逐漸降低。因此，選擇150 V為最優的柵網電極電壓。

去簇電壓的大小會顯著影響CML(m/z205)母離子的響應強度。本實驗考察了10～50 V 去簇電壓對m/z205離子響應強度。如圖4-c所示，隨著去簇電壓的增加，CML的響應強度先增大后減小，當去簇電壓為40 V時，CML母離子峰的響應強度最高。因此，選擇40 V為實驗的去簇電壓。

質譜的碰撞能量也能顯著影響CML(m/z205)二級碎片離子的信號強度。因此，選擇合適的碰撞能量值對目標物的定量分析有著十分關鍵的作用。本研究采用m/z130作為CML的定量離子，以二級碎片離子m/z130的響應強度作為指標對碰撞能量值進行優化。如圖4-d所示，隨著CE值的增大，m/z130的響應強度先增大后減小；相較于碰撞能量值為15 V時，碰撞能量值為20 V時，二級碎片離子的峰形更佳，且母離子碎裂更加充分，綜合考慮，選擇20 V作為CML定量分析的碰撞能量。

a-溫度；b-柵網電極電壓；c-去簇電壓；d-碰撞能量圖4 基于DART-MS測定CML的測試條件優化Fig.4 Optimization of test conditions for CML determination based on DART-MS

采用優化好的質譜條件對CML標準品進行測試，采用MRM模式，以m/z205～m/z130作為定量離子對，如圖5所示，在2 min內即可完成8次平行樣品的測定。由于CML與CEL屬于同系物，其理化性質非常相近，采用傳統超高效液相色譜-串聯質譜(ultra-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)方法檢測，色譜分離需要 10 min以上，而 DART-MS/MS方法無色譜分離過程，在常壓下能夠直接進樣，可以大幅縮短分析時長。

圖5 CML 8次平行進樣的總離子流圖Fig.5 Total ion chromatography diagram of eight parallel injections of CML

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性方程、相關系數、檢出限(detection limit，LOD)及定量限(quantification limit，LOQ)

如圖6所示，以峰面積為縱坐標，CML質量濃度為橫坐標進行線性回歸分析，得到標準曲線和相關系數R2。CML在 1～50 μg/mL，R2為0.996 3，表明線性關系良好。LOD為0.1 μg/g，LOQ為0.5 μg/g。這表明本方法能有效地對CML進行檢測，具有良好的靈敏度。

圖6 CML標準曲線Fig.6 Standard curve of CML by DART-MS

2.3.2 基質效應

基質效應是指樣品中除目標組分以外的組分在電離過程中，對目標成分可能產生離子增強或者抑制效應[20]?；|效應在定量分析中可能會嚴重影響待測物的精密度和準確性，因此需要研究 DART-MS 方法測定CML的基質效應。

由于缺少商業化的空白基質(不含CML的牦牛肉)，因此本研究采用自由態AGEs的提取液直接溶解CML標準品，然后使用樣品提取溶液對其進行連續稀釋。最終牦牛肉中CML加標質量濃度為8.17～53.17 μg/mL，具體見表1。

表1 方法的線性參數、基質效應、檢出限及定量限Table 1 Linear parameters，matrix effect，detection limit and quantification limit of the method

當|基質效應|≤ 20 時，可以認為基質效應較弱[21]。由表1可知，牦牛肉中CML的基質效應為-15.63%，表明牦牛肉中的基質對CML含量有輕微抑制作用，但是影響不顯著，可以直接采用CML的標準曲線進行定量分析。

2.3.3 回收率與精密度

在樣品中添加50、20、5 μg/g 3個質量分數的目標分析物(表2)，每個添加量平行測定5次，分別測定加標回收率和精密度。精密度用相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)表示。結果如表2所示，整體上CML的平均回收率為100.77%～117.36%，RSD為8.22%～9.87%。因此，DART-MS 方法的準確性和穩定性較好，可用于快速檢測樣品中CML的含量。

表2 方法的加標回收率與精密度(n=5)Table 2 Results of standard recovery rate and precision of the method

2.3.4 苦蕎和藤椒對牦牛肉中CML、CEL生成的影響

苦蕎和藤椒中含有多種黃酮類物質，具有較強的抗氧化活性，總黃酮含量與抗氧化活性成正相關。本文采用的苦蕎粉中總黃酮含量為142.23 mg RE/100g DW，藤椒中總黃酮含量604.86 mg RE/100g DW。由于CML與CEL結構近似，采用上述建立的 DART-MS/MS快檢方法對牦牛肉樣品中的CEL含量進行估測(以CML計)。實驗結果如圖7所示，加入苦蕎粉煮制后的牦牛肉中的CML和CEL含量逐漸降低，對比空白樣，添加牦牛肉質量50%的苦蕎粉煮制后，樣品中CML含量降低7.72%，CEL含量下降1.46%，具有顯著性差異；而加入牦牛肉質量50%藤椒粉煮制后的牦牛肉CML含量相較于空白樣品降低了14.51%，CEL含量卻增加7.35%，差異極顯著，這可能是由于藤椒中富含蘇氨酸，在AGEs生成過程中參與了CEL前體物質丙酮醛的生成，導致CEL含量增多。前人研究也發現，在蛋白質糖化早期，木犀草素等黃酮成分能夠抑制AGEs形成[22]?？嗍w、花椒中均含有多種黃酮類物質[23-24]，這可能是加入苦蕎粉后牦牛肉中CML、CEL均顯著下降的原因。

a-苦蕎粉添加量；b-藤椒粉添加量圖7 苦蕎粉、藤椒粉添加量對AGEs的影響Fig.7 Effect of tartary buckwheat and zanthoxylum schinifolium powder on AGEs 注：ns表示無顯著差異(P>0.05)；*表示差異顯著(P<0.05)； **表示差異極顯著(P<0.01)

3 結論

與UPLC-MS/MS方法相比，DART-MS方法操作簡單，結果準確，單次樣品測定時間小于30 s，能大幅縮短分析時長，并且不使用流動相，具有環保的優點。消減工藝研究結果表明，苦蕎可以同時有效減少牦牛肉在煮制過程中CML和CEL的生成；藤椒能有效減少牦牛肉在煮制過程中CML含量，但卻增加了CEL含量，其具體機制有待進一步研究。