羧甲基纖維素誘導培養下羅倫隱球酵母的轉錄組差異分析

馬電通，常雪苗，李文清，黃二賓，杜嶸宇，楊清，王芳, 2，鄧佳,3*

1(西南林業大學 林學院，云南 昆明，650224)2(西南地區生物多樣性保育國家林業局重點實驗室，云南 昆明，650224) 3(西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明，650224)

羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)作為眾多拮抗酵母菌中的一種，因其具有繁殖速率快、對人體無毒、廣譜性和不對環境產生危害等特點[1]。在國內外常被應用于果蔬采后病害的防治與貯藏中，如柑橘、蘋果和草莓等[1-2]。然而，C.laurentii單獨使用時，存在其拮抗效力不及化學殺菌劑、穩定性差、生產成本高、對病原菌具有選擇性等缺點[3]。利用激發子誘導培養增強拮抗酵母生防效力的方法，近年來受到了越來越廣泛的關注。有研究表明利用糖類作為保護劑，能夠增加酵母細胞內ATP、單糖、多糖等的積累，此外，糖保護劑還使酵母活性氧的積累減少，從而保護細胞減弱氧化損傷[4]。LI等[5]以1%海藻糖作為外源物質誘導培養C.laurentii，使其酵母體內海藻糖的含量升高，并提高酵母在凍干條件下的生活力，同時，還顯著增強低溫及可控氣調條件下C.laurentii對蘋果青霉病的生防效力。因此，在培養基中添加糖類物質，可以提高菌體的抗氧化脅迫和生防能力。

酵母在外源物質的誘導下其形態會發生變化并會對酵母自身產生特定的影響，比如抗逆性、存活率和酶的活性等，從而影響自身和應用于果蔬中相關指標的變化[6]。遲孟山[7]研究發現，在0.3%瓊脂的YPD固體培養基上酵母Pichiakudriavzevii和Pichiacecembensis表現為生物膜形態，而在2%瓊脂的YPD固體培養基上酵母表現為單細胞形態，進一步研究發現生物膜形態的酵母比單細胞形態表現出更好的抗逆性、存活率和抗氧化性，當把生物膜形態的2種酵母分別接種于梨和蘋果的傷口時，均表現出更好的繁殖速度，對灰霉和青霉病的防治效果更佳。王東升等[8]研究結果表明，在低葡萄糖濃度下，扣囊復膜孢酵母大多為單細胞酵母形態，少部分酵母為菌絲體形態，其葡聚糖酶和幾丁質酶活性顯著高于菌絲體形態，更能提高酵母的生防效力。上述研究表明，添加糖類外源物質，能夠誘導酵母形態發生變化，并使酵母體內抗病物質積累、增強酶活性，提高作用于果蔬的生防效力。

羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose，CMC)是纖維素的羧甲基化衍生物，為一種糖類物質，性狀為白色或淡黃色纖維狀粉末，無臭、無味。在食品中具有廣泛的用途，常作為食品添加劑和果蔬保鮮劑[9]，對于食品和果蔬貨架期的延長具有明顯的促進作用。轉錄組測序技術(RNA-Seq)作為近年來發展起來的一種研究技術，能夠從RNA水平上分析出不同環境條件下同種生物基因的差異表達量，從而找出關鍵差異表達基因，更進一步探究差異基因(differential genes，DEGs)的調控機制及功能作用[10]。本實驗室在前期研究中發現，在培養基中添加CMC誘導培養，能提高C.laurentii對青霉病的生防效力。因此，結合轉錄組分析，進一步探索CMC對C.laurentii生理特性的影響，揭示其拮抗作用的分子機制，以期為C.laurentii在果品采后病害防治的分子機制研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酵母菌

C.laurentii：ATCC18803，廣東微生物研究所。

1.1.2 試劑

CMC，上海騰準生物科技有限公司；蛋白胨和麥芽浸粉，北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖，天津市科密歐化學試劑有限公司；酵母粉，賽默飛世爾科技公司。

1.1.3 儀器與設備

SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；MIKRO220R冷凍型臺式高速離心機，廣東市華粵儀器有限公司；HH·B11-BS-Ⅱ恒溫培養箱，上海躍進醫療器械有限公司；TS-2102C恒溫搖床，上海天呈實驗儀器制造有限公司；702型超低溫冰箱，賽默飛世爾科技公司；70型離子交換純水器，上海南華醫療器械；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；DM750徠卡顯微鏡，成貫儀器(上海)有限公司顯微系統；Nikon YS100型電子顯微鏡，廣州頤騰貿易有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制

YM液體培養基(g/L)：蛋白胨5.0、葡萄糖10.0，酵母粉3.0，麥芽浸粉3.0，pH自然；配制完畢后于121 ℃ 的高壓滅菌鍋滅菌21 min。自然冷卻后，備用。

1.2.2 CMC誘導酵母形態變化率觀測

參考楊新等[11]的操作方法，略作修改。將事先準備好的種子液按照2%的接種量接種于CMC含量為0(對照組)、0.5%(質量分數)(處理組)的YM液體培養基中(每個處理組3個重復)，裝液量為50/100mL；接種完畢后，在28 ℃、120 r/min的搖床上培養，之后分別在12、24、36、48、72、84、96 h于徠卡顯微鏡取樣觀察酵母形態變化(每個樣品記錄6個視野)，并計算其酵母誘導形態變化率(當酵母的縱徑和橫徑比等于1時視為酵母形態沒有改變，當其縱橫徑比小于或大于1視為酵母形態發生變化)，計算如公式(1)所示：

(1)

1.2.3 轉錄組測序菌體的培養與收集

參考1.2.2中CMC誘導酵母形態變化率的操作方法，略作修改。將事先準備好的種子液按照2%的接種量接種于CMC含量為0(對照組：CK-1、CK-2、CK-3)、0.5%(處理組：CMC-1、CMC-2、CMC-3)的YM液體培養基中(每個處理組3個重復)，裝液量為300/500mL；接種完畢后，在28 ℃、120 r/min的搖床上培養。培養結束后，在4 ℃、8 000 r/min、15 min的條件下離心收集菌體，然后立即置于-80 ℃中冰箱保存。

1.3 RNA提取

冷凍保存的酵母樣品委托廣州基迪奧生物科技有限公司進行酵母RNA提取、文庫構建、測序及過濾和生物學信息分析。

1.4 文庫構建、測序數據分析

在轉錄組學中，錯誤發現率(false discovery rate，FDR)<0.05且差異倍數(fold change，FC)>1(|log2FC|>1)被認為是差異表達基因，對達到此標準的DEGS進行GO(Gene Ontology)功能和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析。實驗中各數據表示平均值±標準誤差，數據為3次重復的平均值，采用t檢驗方法分析不同處理組間差異，P<0.05表示差異達顯著水平，另使用Excel 2010進行數據統計、并使用Origin 2019軟件進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 CMC誘導C.laurentii形態變化率觀測

由圖1可知，0.5%CMC誘導培養24 h時，酵母形態變化率比CK組高出4.02%，酵母形態開始發生顯著性的差異變化(P<0.05)，且其顯著差異變化一直持續到誘導培養72 h；72 h之后，0.5% CMC和CK處理組之間變化差異不顯著(P<0.05)。0.5% CMC誘導培養24 h時，酵母細胞形態如圖2所示。CK組細胞多以正圓形細胞酵母形式存在(圖2-a)，0.5% CMC處理組正圓細胞酵母逐漸減少，橢圓形細胞酵母逐漸增多(圖2-b)。該結果表明，CMC誘導對C.laurentii細胞形態變化可能存在某種作用關系。因此，以0.5% CMC誘導培養24 h，細胞發生顯著形態變化的C.laurentii，進行轉錄組測序并對測序數據進行生物信息學分析，從分子水平揭示C.laurentii對CMC培養的誘導響應機制。

圖1 CMC誘導C.laurentii的形態變化率Fig.1 Rate of morphological change of C.laurentii induced by CMC 注：圖中不同時間段的不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05)

2.2 測序數據質控報告

對CMC誘導(0.5%)和未誘導培養24 hC.laurentii進行轉錄組測序，結果如表1所示，測序質量控制后，共得到36.82 Gb純凈數據。CK處理組和CMC處理組堿基堿基Q30平均值分別為6 487 935 247、5 907 988 763條，占比為93.48%和94.80%；堿基Q20平均值分別為6 774 082 121、6 117 749 022條，占比為97.56%和98.16%；同理，GC的堿基平均值分別為4 157 214 861、3 722 095 089條，占比為59.86%和59.72%。以上數據，說明該轉錄組測序堿基質量好，準確性高，可用于后續實驗進一步分析。

a-未誘導的酵母；b-CMC誘導的酵母圖2 CMC誘導處理24 h的C.laurentii形態變化(10×40)Fig.2 Morphological changes of C.laurentii induced by CMC treatment for 24 h(10×40)

表1 堿基信息統計表Table 1 Statistical table of base information

2.3 基因比對率統計

由表2可知，轉錄組測序獲得的純凈序列中，能定位到基因組上的純凈序列平均值為42 588 444條和38 122 146條，占比為91.58%～92.08%，在參考序列上，能比對上多個序列的基因的平均值為38 903和34 678條，占比為0.08%～0.09%，在參考序列上，只有唯一比對位置序列基因的平均值為42 549 542條和38 087 468條，占比為91.49%～92.0%。其中能定位到純凈序列上的基因占比都>91.58%，而在參考序列上有多個比對位置的基因序列數均<1%，因此，本次所測序列沒有受到污染，可以開展后續基因序列的組裝和分析。

2.4 組裝質量統計

從表3和圖3-a可得，N50的數量遠低于基因的數量，而且其長度高于基因的平均長度，平均GC含量為60.014%，說明該基因的組裝質量合格，效果較好，可用于后續數據的分析和挖掘。

表2 基因比對率統計表 單位：條

表3 組裝質量統計表Table 3 Statistical table of assembly quality

2.5 Unigene基本注釋

對C.laurentii組裝轉錄本分別與Nr、KEGG、KOG和Swissprot四大數據庫進行比對。測序得到的7 191個基因，進行基因功能注釋并分別結果如表4所示，有6 402條(89.03%)Unigene被注釋到Nr數據庫、5 958條(82.85%)Unigene被注釋到KEGG數據庫、3 480條(48.39%)Unigene被注釋到KOG數據庫、3 998條(55.60%)Unigene被注釋到Swissprot數據庫；總共有6 409條(89.13%)Unigene被注釋到數據庫，沒有注釋到數據庫的一共有782(10.87%)條。

Nr作為非冗余蛋白數據庫，通過比對基因序列可以確定物種相似性。由圖3-b可知，C.laurentii與銀耳(Naemateliaencephala)、新型隱球酵母(Cryptococcusneoformans)和白茅草考克娃酵母(Kockovaellaimperatae)的種源相似性最高，分別為996(15.56%)、817(12.76%)、768(11.20%)，表明C.laurentii與酵母有較高的種源相似性。

表4 功能注釋統計表Table 4 Statistical table of function notes

2.6 CMC誘導C.laurentii差異表達基因分析

2.6.1 DEGs的篩選

對于同一生物體而言，在不同的環境條件下其體內的基因表達會存在顯著性差異。因此，為了探究C.laurentii在CMC培養條件下基因的表達的差異情況，對2處理組樣品數據進行基因差異表達分析。篩選標準：FDR<0.05且FC>1(|log2FC|>1)。結果如圖3-c所示，添加0.5% CMC誘導培養24 h的C.laurentii總共篩選出顯著性差異表達基因58個，其中上調表達的有55個基因，占比為94.83%，3個基因為下調表達，占比僅有5.17%。

2.6.2 DEGs的GO富集分析

對所有的DEGs做二級GO數據庫富集分析，DEGs被涉及到生物過程、細胞組分和分子功能3個大類，總共包括在24個二級亞類中(圖4-a)。生物過程包括12個亞類，其中，以細胞過程、單生物過程和代謝過程富集的DEGs最多，分別為16、15、13個，該3個亞類可能與細胞的能量代謝、生長等相關；細胞組分的包括8個亞類，其中以細胞、細胞區域、膜和細胞器富集到最多的DEGs，分別為11、11、10、7個，該4個亞類可能與細胞內物質的運輸、轉運相關；富集到分子功能的亞類數目最少，僅有4個，分別為催化活性、結合、轉運體活性和電子轉運體活性，其參與的DEGs分別為13、9、3、1個，該4個亞類可能與細胞內酶的合成與電子的傳遞相關。

a-Unigene長度分布圖；b-Nr比對物種數量統計圖；c-DEGs火山圖圖3 Unigene長度分布圖、Nr比對物種數量統計圖和DEGs火山圖Fig.3 Diagram of Unigene length distribution、cartograph of the number of Nr comparison specie and volcano map of differential genes

2.6.3 DEGs的KEGG富集分析

在生物體內，不同基因相互協調共同行使其生物學功能。KEGG作為主要的基因通路公共數據庫，對篩選出的DEGs注釋到KEGG數據庫，能找到相關DEGs的通路并能夠確定DEGs參與的最主要生化代謝通路和信號轉導途徑。對本實驗所有DEGs進行通路富集分析(圖4)。

a-GO富集分類柱狀圖；b-KEGG富集條形圖圖4 GO和KEGG富集分析Fig.4 GO and KEGG enrichment analysis

DEGs被富集到14個通路上，其中呈顯著富集(Q<0.05)的是氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)和代謝途徑2個通路，分別富集了7和12個DEGs；其次，酪氨酸代謝、次生代謝物的生物合成和β-丙氨酸代謝途徑通路上各有2個DEGs；富集只有1個DEGs的通路為黃曲霉毒素生物合成、糖胺聚糖降解、苯丙氨酸代謝、磷脂酰肌醇信號系統、精氨酸與脯氨酸代謝、甘油脂代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、酵母MAPK信號通路和酵母細胞周期通路。其中，OXPHOS通路歸屬于能量代謝亞類、磷脂酰肌醇信號系統和酵母MAPK信號通路歸屬于信號轉導亞類、酵母細胞周期通路則歸屬于細胞生長與死亡亞類；其4條通路所參與的過程可能涉及酵母的能量代謝，生長與繁殖等。

2.7 相關DEGs的通路分析

由表5可知，在DEGs富集的14條通路中，所有通路中的DEGs都表現為上調表達且表達量均顯著高于未誘導處理，其中與酵母的能量代謝、生長繁殖相關的通路，包括OXPHOS、代謝途徑、磷脂酰肌醇信號系統、酵母MAPK信號通路和酵母細胞周期，差異表達基因呈現出不同幅度顯著(P<0.05)上調(表6)。

表5 CMC誘導C.laurentii后的DEGsTable 5 Differential genes of C.laurentii after induction by CMC

由圖5可知，CMC誘導培養C.laurentiiOXPHOS通路中，基因ND1(NADH-泛醌氧化還原酶鏈1)、ND3(NADH-泛醌氧化還原酶鏈3)、ND4(NADH-泛醌氧化還原酶鏈4)、Cytb(泛醌-細胞色素c還原酶細胞色素b亞基)、COX1(細胞色素c氧化酶亞基1)、COX3(細胞色素c氧化酶亞基3)和β-a(F型H+轉運ATP酶亞基)的表達量均上調；經誘導后，其表達量均顯著(P<0.05)高于未誘導處理，其分別提高48.86、2.56、25.62、28.03、15.38、35.03、21.53倍(表6)。C.laurentii的磷脂酰肌醇信號系統通路中，與鈣離子相關基因CALM(鈣調蛋白)為上調表達，其表達量增加了1.89倍，顯著(P<0.05)高于未誘導處理(表6)。此外，經過CMC誘導培養后，在C.laurentii的MAPK信號通路和細胞周期通路中，與細胞周期和有絲分裂相關的基因MIH1(M期誘導酪氨酸磷酸酶)呈現上調表達，其表達量高于未誘導處理2.05倍，差異達顯著(P<0.05)水平(表6)。

表6 CMC誘導C.laurentii與細胞能量代謝、生長相關的DEGs表達量Table 6 CMC induces differential gene expression in C.laurentill associated with cellular energy metabolism and growth

圖5 OXPHOS通路Fig.5 Oxidative phosphorylation pathway

3 討論與結論

本研究對C.laurentii進行CMC誘導培養，結果表明，當培養基中添加CMC培養，C.laurentii形態由正圓形向橢圓形變化，誘導培養24～72 h酵母形態變化率顯著(P<0.05)高于對照處理，推測這個過程汲及到細胞的分裂。進一步對誘導培養24 h形態發生顯著差異變化的酵母進行轉錄組測序，結果表明，經CMC誘導培養的C.laurentii，與對照組相比，C.laurentii共有58個DEGs，其中55個為上調表達，3個為下調表達。DEGs被注釋到24條GO分類中和14條KEGG通路中，分析結果表明，0.5% CMC誘導培養24 hC.laurentii涉及的DEGs功能主要與細胞能量代謝和生長、繁殖等有關，顯著(P<0.05)富集在OXPHOS、磷脂酰肌醇信號系統、酵母MAPK信號通路和酵母細胞周期通路中。

在能量代謝方面，OXPHOS是需氧細胞生長過程中細胞能量來源的主要途徑，能生成大量的ATP[12]，其由電子傳遞酶類(復合物I～Ⅳ)協同作用工作，復合物I～Ⅳ是由多亞基酶構成并協同作用與工作，而后在ATP合酶(復合物Ⅴ)的作用下產生ATP[13]，因此，該途徑能夠為細胞的生長、繁殖提供能量支持。OXPHOS代謝途徑中，復合物Ⅰ又稱還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶，是呼吸鏈中最大的酶[14]，其能夠轉移電子給輔酶Q，利于電子的轉移，最終促使質子泵入線粒體膜間隙。ND1(NADH-泛醌氧化還原酶鏈1)、ND3(NADH-泛醌氧化還原酶鏈3)、ND4(NADH-泛醌氧化還原酶鏈4)為NADH脫氫酶下的3個酶鏈，他們的聚集組合對NADH的產生具有重要的調控作用。本研究轉錄組數據中，基因ND1、ND3和ND4在CMC誘導培養后呈現上調表達，與NADH合成積累密切相關。復合物Ⅲ又名細胞色素c還原酶，其將電子從輔酶Q傳遞給細胞色素c，有助于質子傳遞進入膜間隙。主要參與了細胞呼吸、生物大分子合成等過程[15]，對于酵母的生殖生長和代謝起著至關重要的作用。亞基基因Cytb(泛醌-細胞色素c還原酶細胞色素b亞基)是調控復合物Ⅲ合成的核心構件關鍵基因。發現CMC誘導培養后，C.laurentii的Cytb基因表達量呈現上調，說明該基因參與了復合物Ⅲ積累，從而促進電子向載體細胞色素c的轉移。復合物Ⅳ又稱細胞色素c氧化酶，線粒體呼吸鏈的最后一種酶[16]，它接受來自細胞色素c的電子，把電子傳遞給O2轉化為H2O，將質子泵送至膜間隙。COX1(細胞色素c氧化酶亞基1)、COX3(細胞色素c氧化酶亞基3)作為細胞色素c氧化酶下的2個亞基，具有參與、穩定催化及調節活性的功能，對復合物Ⅳ的積累起到重要調節作用。轉錄組數據中，C.laurentii的COX1和COX3基因在CMC誘導后呈現不同幅度上調，推測添加CMC培養誘導酵母COX1、COX3基因表達，使酵母胞內細胞色素c氧化酶相對含量增加，有利于胞內電子的大量傳遞轉移。復合物Ⅴ又名ATP合酶，作為酵母能量代謝的關鍵酶，其利用復合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ產生的質子動力將ADP合成ATP，為細胞內多種化學反應和功能的進行提供能量[17]。本研究轉錄數據顯示，ATPase編碼基因β-a(F型H+轉運ATP酶亞基)在CMC誘導培養后表達量上調，β-a作為復合物Ⅴ的1種亞基組件對于ATP合酶的組裝合成具有促進作用，進一步利于ADP和Pi(無機磷酸鹽)在線粒體內膜上凝聚合成ATP[18]?；谝陨戏治鐾茰y，CMC誘導培養C.laurentii，酵母ND1、ND3、ND4、Cytb、COX1、COX3和β-a基因表達量均上調，促進復合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ積累，提高酵母細胞ATP的合成能力，為酵母細胞內各種代謝反應和物質合成提供能量保證，進而增強酵母的活力，上述研究結果與宋志強等[19]的研究結果類似。

CMC誘導培養提高C.laurentii生長繁殖能力，拮抗酵母的生長繁殖能力與其生防效力密切相關[20]。通過轉錄組學分析得出，磷脂酰肌醇信號系統通路中，基因CALM(鈣調蛋白)表達量呈現上調，該研究結果與韓秀娟等[21]的研究結果類似。CALM是真核細胞內調節鈣信號通路的一種關鍵蛋白[22]，其作為調節因子并幾乎存在于每一種細胞內[23]。CALM作為酵母細胞內Ca2+的主要受體，其功能主要是參與促進細胞的新陳代謝、細胞分裂、生殖生長和信號轉導等一系列過程[24]。此外，在酵母MAPK信號通路和酵母細胞周期通路中，MIH1(M期誘導酪氨酸磷酸酶)的表達量上調。MIH1p是一種控制細胞周期的蛋白酪氨酸磷酸酯酶，其通過調節Cdc28p的磷酸化程度影響酵母的有絲分裂。其與基因Swe1p共同形成有絲分裂的負反饋調節系統[25]。有研究表明，基因MIH1缺失的情況下，細胞進入有絲分裂的時間會延遲，而且細胞的體積會變大[26]，本研究轉錄數據表明，MIH1上調表達加速細胞有絲分裂進程，根據該結果推測細胞形態呈橢圓形態變化(圖2-b)，可能是酵母進行大量有絲分裂活動，兩者結果基本相符，其研究結果與PAL等[26]研究類似。因此，CMC誘導C.laurentii使酵母CALM、MIH1的表達量上調，促進酵母細胞的有絲分裂及生殖生長，提升酵母自身增殖與代謝效率，從而增強了其拮抗效力。上述研究結果為多糖誘導提高生防酵母拮抗效力分子機制的進一步深入研究提供了一定理論參考與及科學依據。