微量元素與生長因子對L-苯丙氨酸發酵的影響

陳志超，王金多，徐慶陽,2,3*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)2(天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津，300457) 3(代謝控制發酵技術國家地方聯合工程實驗室，天津，300457)

L-苯丙氨酸(L-phenylalanine，L-Phe)與L-酪氨酸(L-tyrosine，L-Tyr)、L-色氨酸(L-tryptophan，L-Trp)同屬芳香族氨基酸，為莽草酸途徑產物之一[1-2]。可作為新型甜味劑阿斯巴甜的合成前體[3]，也可作為抗癌藥物的載體[4]，在食品與醫藥方面具有極大的應用價值，目前常采用微生物發酵法獲取[5]。

微生物利用葡萄糖等為碳源合成L-Phe的代謝途徑較長，需要經過糖酵解途徑(glycolytic pathway，EMP)、檸檬酸(tricarboxylic acid，TCA)循環、戊糖磷酸途徑(pentose phosphate pathway，PPP)與莽草酸途徑(shikimic acid pathway)，其中多個關鍵酶與L-Phe的合成關系密切。金屬離子作為重要的酶激活劑，其種類與用量影響到關鍵酶活力的強弱進而影響到L-Phe 產量與糖酸轉化率。金屬離子對酶的激活/抑制作用機理錯綜復雜，表現為：不添加或添加過少的金屬離子無法對酶起激活作用，如5×10-3～10×10-3moL/L的Mg2+可激活NADH+合酶，但低于或高于此濃度均無法起到激活作用；金屬離子對酶的作用具有一定的選擇性，如Ca2+對肌球蛋白腺三磷酸起到激活作用，卻對脫羧酶有抑制作用；有時離子之間也有拮抗作用，如Ca2+可以抑制Mg2+激活的酶，再者金屬離子之間也可以相互取代，如Mn2+離子可以取代Mg2+激活的激酶[6]。核黃素(維生素B2)在生物體內是重要輔酶黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)和黃素單核苷酸(flavin mononucleotide，FMN)的合成前體[7]，FAD和FMN作為黃素蛋白的輔酶參與傳遞氫的有關代謝，在呼吸和生物氧化中起著重要的作用[8]。磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)是細胞140多種酶的輔酶，在氨基酸的合成、相互轉化和降解等代謝反應中起重要作用，常見的反應包括：催化α-酮酸轉化為氨基酸的轉氨酶以及一系列的消旋作用、脫羧作用和羥醛反應[9]。維生素H過量會導致菌體代謝旺盛[10]，生長過快，出現糖酸轉化率大幅降低的問題；過少或者不添加維生素H會導致菌體生長較慢、生物量較低，產酸效率偏低等問題。

為解決上述問題，本研究對L-Phe發酵中使用的微量元素與生長因子(Mg2+、Fe2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Ca2+、Ni2+、PLP、維生素B2、維生素H，以下統稱為微量元素)用量進行了優化調整，以關鍵酶活力、L-Phe產量與糖酸轉化率等為指標，展示了優化后微量元素用量的優越性，解決了微量元素用量粗放的問題，對工業化微生物發酵生產L-Phe具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 菌種

L-Phe大腸桿菌生產菌，天津科技大學代謝工程實驗室。

1.2 培養基

種子培養基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉4，蛋白胨2，MgSO4·7H2O 1.5，KH2PO42.0，硫酸銨2.0，維生素B11×10-3，FeSO4·7H2O 1×10-2，MnSO4·H2O 5×10-3，維生素H 1×10-3，酪氨酸1.5，卡那霉素20。

發酵培養基(g/L):葡萄糖20，MgSO4·7H2O 2，酵母粉4.5，蛋白胨1.5，硫酸銨2，K2HPO4·3H2O 6，酪氨酸1.2，谷氨酸1.2，維生素B1、維生素B3、維生素B5、維生素B122.5 mL/L，維生素H 0～2×10-3，FeSO4·7H2O 0～40×10-3，MnSO4·H2O 0～25×10-3，CaCl2·2H2O 0～33×10-3，CuSO4·5H2O 0～0.7 ×10-3，CoCl2·6H2O 0～60×10-3，ZnSO40～3×10-3，維生素B20～10×10-3，PLP 0～10×10-3，卡那霉素1×10-2。

1.3 儀器與設備

LDZH-100KBS型全自動立式蒸汽滅菌器，天津博鑫生物科技有限公司；5 L自動控制發酵罐，上海保興生物設備工程有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所；Agilent1200高效液相色譜儀、Agilent Technologies；752分光光度計，上海分析儀器廠；OLYMPUS生物顯微鏡，日本OLYMPUS會社；S-433D氨基酸分析儀，德國賽卡姆公司。

1.4 培養方法

1.4.1 菌種活化

取甘油保菌管中菌株置于固體斜面培養基上，于37 ℃恒溫培養12 h，傳代2次。

1.4.2 搖瓶、5 L發酵罐培養

參考文獻[10]。

1.5 檢測與分析方法

1.5.1 pH、溶氧值、生物量、溫度值測定

參考文獻[11]。

1.5.2L-Phe及副產物測定

發酵液中L-Phe、丙氨酸(L-alanine,L-Ala)產量采用LC20AT高效液相色譜儀測定[12]，乙酸檢測參考文獻[13]，谷氨酸使用SBA生物傳感分析儀測定。

1.5.3 酶粗液提取

取發酵液，4 ℃、6 500 r/min低速低溫離心6 min，棄上清液，收集菌體，稱量菌體濕重。利用0.1 mol/L的Tris-HCL緩沖液沖洗菌體2次，離心后棄上清液，再次使用該溶液重懸。利用超聲細胞破碎儀破碎細胞，過程持續冰浴，將處理后的液體離心，取上清液即為酶粗液。

1.5.4 DAHP、CM、PDT、芳香族氨基酸轉氨酶(tyrB編碼)酶活測定

參考文獻[14-16]，其中DAHP又稱3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶(3-deoxy-D-arabinone glycolic acid-7-phosphate synthetase，DAHP)，CM為分支酸變位酶(chorismate mutase, CM)，PDT為預苯酸脫水酶(prephenate dehydratase, PDT)。

1.5.5 酶活力定義方式

本實驗所測酶活力定義方式均為：1 g鮮重菌體在1 mL反應體系中1 h產生1 μmoL產物定義為1個酶活力單位[μmoL/(h·g鮮重)]。

1.5.6 殘糖測定及耗糖速率、轉化率計算

參考文獻[17]。

1.5.7 單因素試驗用量表

按表1所示微量元素設置10組實驗，每組添加單一微量元素，設置5個濃度梯度與3個平行實驗，實驗結果取3組平行實驗平均值，特別指出，鑒于自來水中Ca2+、Mg2+離子含量較多，因此實驗用水均為純凈水。

表1 微量元素及其用量Table 1 Trace elements and their dosage

1.5.8 正交試驗探究部分微量元素與生長因子的最適濃度

如表2所示，本部分實驗在單因素試驗結果的基礎上設置5個因素4個水平的正交試驗L16(54)，對起較大影響作用的PLP、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、維生素B2、CoCl2·6H2O 5種微量元素的用量通過正交試驗進一步優化研究。

表2 正交實驗因素水平表Table 2 Level table of orthogonal experimental factors

2 結果與分析

2.1 添加單一微量元素對發酵的影響

如圖1所示，以CuSO4·5H2O、CoCl2·2H2O、ZnSO4、FeSO4·7H2O為例，實驗涉及的10種微量元素對L-Phe產量的影響主要有4種形式：(1)CuSO4·5H2O 添加量≤0.47×10-3g/L時，產量較對照組(11.2 g/L)有一定提高，當添加量達到1.17×10-3g/L時，產量較對照組降低了7.1%；(2)CoCl2·2H2O 質量濃度≤6×10-3g/L時，產量隨添加量提高而提高，在6×10-3g/L時產量為14.9 g/L，較對照組提升了33.0%，當添加量提高到8×10-3g/L時，產量相對穩定，未出現明顯的升降趨勢，具有類似效果的還有NiCl2·6H2O、PLP、維生素B2；(3)ZnSO4、CaCl2·2H2O的添加對L-Phe的產量沒有明顯的影響，不具備分析意義；(4)FeSO4·7H2O添加量≤3×10-2g/L時，產量隨添加量的升高而升高，且在添加3×10-2g/L時產量為18.2 g/L，較對照組提高了62.5%，當添加量>3×10-2g/L時，產量出現一定程度的下滑，但始終高于對照組，具有類似效果的還有MnSO4·H2O、維生素H。值得注意的是，單一添加MnSO4·H2O時發酵液顏色隨著MnSO4·H2O添加量的提高而變黑，檢測得知生成大量乙酸，因此也可以認為添加MnSO4·H2O的實驗組中L-Phe產量的下降和乙酸的積累具有直接關系。

圖1 單一微量元素對L-Phe產量的影響Fig.1 Effect of single trace element on the yield of L-phenylalanine 注：A、B、C、D指相應微量元素不同濃度梯度

如圖2所示，FeSO4·7H2O、維生素H對生物量的影響較大，Fe2+在電子傳遞、氧的傳遞、TCA循環、基因調控和DNA的生物合成等生物學過程具有重要作用[18]，因此不難解釋FeSO4·7H2O對生物量的正向作用，當過量添加時，鐵在有氧條件下并不利于微生物生長，氧氣和還原氧類可以與鐵反應對生命產生破壞性的影響[19]，因此在添加量為30×10-3g/L時生物量為66.4，繼續添加時生物量降低；維生素H可在脂肪酸生物合成、氨基酸代謝和糖異生的羧化反應中作為酶促輔因子，例如作為乙酰CoA羧化酶的輔酶，參與脂肪酸的合成，進而影響磷脂的合成[20]，后者作為細胞膜的主要成分，是限制細胞生長的主要因素，因此維生素H的添加量越高，生物量越大，但漲幅逐漸降低，其中添加2×10-3g/L的實驗組，生物量為62.0，較對照組提高了19%。MnSO4·H2O的添加同樣對生物量起到了促進作用，Mn2+離子在EMP中作為多個關鍵酶的輔因子，影響糖的利用進而影響到能量代謝，進一步影響到微生物的生長代謝，不過在Mg2+存在時，這種促進作用并不明顯。其他微量元素相對FeSO4·7H2O、維生素H、MnSO4·H2O對生物量的影響并不明顯，但適量添加時還是會有一定的促進作用。

圖2 單一微量元素對生物量的影響Fig.2 Effect of single trace element on biomass

2.2 微量元素缺失對發酵的影響

2.2.1 微量元素缺失對產量、轉化率、生物量的影響

綜合2.1中的實驗結果，認為CaCl2·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、NiCl2·6H2O、PLP、維生素B2、維生素H最適添加量分別為1.1×10-2、4.7×10-4、6×10-3、6×10-4、3×10-2、1.5×10-2、6.06×10-3、1×10-2、6×10-3、1×10-3g/L，在均添加最適濃度的前提下，以實驗涉及的10種微量元素全部添加為對照組，探究微量元素單一缺失對發酵的影響，結果取3組平行實驗平均值，如圖3所示。

圖3 微量元素缺失對發酵的影響Fig.3 Effect of lack of trace elements on fermentation 注：橫坐標代表缺失對應的微量元素的實驗組

如圖3所示，從生物量差異來看，FeSO4·7H2O、維生素H的缺失對生物量影響最大，較對照組分別降低了10.0%、10.6%，剩余8種微量元素對生物量影響并不顯著，因此可以看出FeSO4·7H2O、維生素H在菌體生長過程中的必要性，且不能通過添加其他微量元素彌補；從L-Phe產量來看，MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O的缺失對產量的影響最為顯著，分別較對照組降低了15.0%、10.1%，其次是CoCl2·6H2O、PLP，當兩者缺失時產量較對照組分別降低了7.0%、8.5%，Mn2+、Fe2+和Co2+離子作為NADH酶的酶激活劑[21-22]，能夠很大程度上提高L-Phe的產量，即使報道[21]稱Mn2+能夠優先與NADH酶結合，但本實驗證明了Mn2+、Fe2+、Co2+的單獨缺失均會影響L-Phe的產量。PLP的缺失也影響到了最終產量，推測該物質可作為其他關鍵酶的輔酶，進而影響L-Phe的產量。其他微量元素的缺失并未造成明顯的產量下降，其中CuSO4·5H2O的缺失反而使得產量較對照組提高了2.1%；從糖酸轉化率來看，CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、PLP、維生素B2的缺失分別使得糖酸轉化率較對照組下降了2.8%、4.6%、3.5%、6.3%、2.8%，CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、PLP對轉化率造成的影響與產量的變化趨勢相同，因此認為轉化率下降是由于產量下降引起，維生素B2是生物體內一些氧化還原酶的輔基，對電子傳遞、脫氫等反應具有催化作用，可以認為維生素B2促進了菌體的能量代謝，進而提高了糖酸轉化率，但其具體作用機制還待研究。維生素H的缺失很大程度上提高了糖酸轉換率，較對照組提高了8.5%，對應菌體量下降明顯，即使在2.1的結果中證明了維生素H單一存在可以一定程度的提升L-Phe的產量，但這種提升完全能夠被其他微量元素替代，因此外源添加維生素H并不適合大腸桿菌發酵生產L-Phe。

2.2.2 微量元素缺失對酶活力的影響

L-Phe合成途徑中的限速酶為DAHP、CM、PDT[4]，最終生成的苯丙酮酸在芳香族氨基酸轉氨酶的作用下生成L-Phe，因此將上述4種酶統稱為關鍵酶。

根據2.1中的結果得知，實驗涉及的10種微量元素對提高L-Phe產量的影響順序為：MnSO4·H2O>FeSO4·7H2O>CoCl2·6H2O>PLP>維生素B2>維生素H>>NiCl2·6H2O、CaCl2·2H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4(后4位不分先后，且遠遠小于前6位)；對提高L-Phe糖酸轉化率的影響順序為：PLP>FeSO4·7H2O>MnSO4·H2O>維生素B2、CoCl2·6H2O>>維生素H、NiCl2·6H2O、CaCl2·2H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4(后5位不分先后，且遠遠小于前5位)，因此默認對實驗結果影響較小的NiCl2·6H2O、CaCl2·2H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4以通過單因素試驗得到了最佳添加量，并猜測CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、PLP、維生素B2為L-phe合成途徑中關鍵酶的輔酶或輔因子，因此本部分實驗以5種物質均添加最適用量作為對照組，單一缺失任意一種為實驗組，取樣檢測4種關鍵酶的酶活力，實驗結果如圖4所示。

圖4 微量元素缺失對酶活力的影響Fig.4 Effect of lack of trace elements on enzyme activity

如圖4所示，對照組DAHP酶活力為4 347.3 μmoL/(h·g)，FeSO4·7H2O的缺失使得酶活力較對照組下降了21.5%，MnSO4·H2O的缺失使得酶活力下降了23.4%，證明了FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O的不可缺少性，其余微量元素的缺失并未引起酶活力的明顯下降；對照組CM酶活力為3 292.5 μmoL/(h·g)，FeSO4·7H2O的缺失使得酶活力較對照組下降了35.2%，其余微量元素并未引起酶活力的明顯下降，因此可以認為CM是Fe2+依賴性的；對照組PDT酶活力為3 321.4 μmoL/(h.g)，FeSO4·7H2O的缺失使得酶活力下降了33.6%，這與CM情況類似，因此認為Fe2+對CM-PDT是至關重要的輔因子；對照組芳香族氨基酸轉氨酶活力為3 813.8 μmoL/(h·g)，PLP的缺失使得酶活力下降了39.3%，因此認為PLP是芳香族氨基酸轉氨酶至關重要的輔因子。維生素B2的缺失使得每個酶相對對照組均出現了一定程度的下降，但未引起某個具體的關鍵酶活力的明顯下降，認為維生素B2作為氧化脫氫類酶的輔酶，并不能直接影響到芳香族氨基酸的生成，但能在EMP、磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway，HMP)等途徑中加快能量代謝，從而間接提高L-Phe的產量與轉化率。CoCl2·6H2O的缺失使得DAHP、CM活力輕微下降，并未影響到其他3種酶的活力，但結合2.2.1中結論，CoCl2·6H2O的缺失使得產量與轉化率均下降明顯，推測該物質可作為莽草酸途徑相關酶的輔因子，從而影響到L-Phe的生成。

2.3 正交分析探究關鍵微量元素的最適用量

2.2.2的實驗結果證明了CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、PLP、維生素B2為L-Phe發酵過程中的關鍵因素，因此本研究繼續對這5種物質的用量進行優化，結果如表3所示。

表3 L-Phe產量正交試驗結果Table 3 Results of orthogonal experiment on L-Phe yield

如表3所示，從產量均值來看，因素FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、PLP、維生素B2的最適添加量分別為28×10-3、14.0×10-3、5.5×10-3、10×10-3、6.5×10-3g/L，由產量極差可知因素FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O為影響L-Phe產量的主要因素，其中MnSO4·H2O為關鍵因素。因素CoCl2·6H2O、PLP、維生素B2極差均較小，對產量的影響并不顯著，為次要因素；由轉化率均值可知，因素FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、PLP、維生素B2的最適添加量分別為2.8×10-2、1.45×10-2、5.5×10-3、1×10-3、5.5×10-3g/L。由轉化率極差可知因素FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、PLP為影響糖酸轉化率的主要因素，其中FeSO4·7H2O為關鍵因素。因素CoCl2·6H2O、維生素B2極差較小，對轉化率的影響并不顯著，為次要因素。

綜合來看，FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、PLP用量的進一步優化對產量與轉化率有較大影響，因素FeSO4·7H2O在2.8×10-2g/L時兩項均值均為最大，因素MnSO4·H2O取1.4×10-2g/L時產量均值最大，取1.45×10-2g/L時轉化率均值最大，因此可有選擇性的選擇MnSO4·H2O的添加量，PLP取1×10-2g/L時產量均值最大，取9.5×10-3g/L時轉化率均值最大，但PLP對轉化率的影響遠大于對產量的影響，因此選取9.5×10-3g/L為最適添加量。CoCl2·6H2O、維生素B2的濃度變化在本部分實驗中并未明顯影響到轉化率與產量，因此可以認為二者已達最適用量，再次優化并無意義。

2.4 5 L發酵罐發酵驗證

前期實驗確定了維生素H對L-Phe發酵的不利影響，得知了其余9種微量元素的最適添加量，但由于搖瓶發酵具有較大的局限性，因此在之前實驗的基礎上，以CaCl2·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、NiCl2·6H2O、PLP、維生素B2分別添加1.1×10-2、4.7×10-4、6×10-3、6×10-4、2.8×10-2、1.4×10-2、6.06×10-3、1×10-2、6×10-3g/L為實驗組，以不添加微量元素作為對照實驗，使用5 L發酵罐進行發酵實驗，檢驗前期微量元素用量優化結果。

2.4.1 微量元素對生物量與耗糖速率的影響

由圖5可知，實驗組生物量與耗糖速率在發酵過程中始終高于對照組，最大生物量122.8遠遠大于對照組最大生物量101.3，達到最大耗糖速率的時間比對照組提前了4 h，但在數值上相近；在發酵進行到34 h時，對照組生物量開始呈現下降趨勢，耗糖速率也呈現大幅度的下滑，此時實驗組生物量與耗糖速率均處于穩定期；當發酵進行到40 h，對照組幾乎無法繼續攝糖，生物量持續下降，無法繼續進行發酵，此時實驗組生物量依據處于穩定期，但耗糖速率有所下降；發酵50 h，實驗組生物量依舊沒有明顯的下降趨勢，但此時耗糖速率下降嚴重，因此結束發酵，發酵周期較對照組延長了10 h。

圖5 耗糖速率與生物量過程變化Fig.5 Variation of sugar consumption rate and biomass in fermentation process

2.4.2 微量元素對L-Phe產量及實時轉化率的影響

實時轉換率是指發酵進行到某一時刻時，在該時刻生產的總酸與總糖之比，該數據可體現出發酵過程中各個時間段的產酸效率，因此設法延長高效率時期或者提高最大實時轉化率均有利于L-Phe的發酵生產。

由圖6可知，當微量元素缺失時，L-Phe產量總體偏低，且增加趨勢平穩，最終產量為56.4 g/L，這與轉化率曲線趨勢大致相同，整體呈上升趨勢，在22～26 h出現下降趨勢，這是因為L-Phe在臨近結晶濃度時會形成松軟的假晶體狀態[23]，同時伴隨大量的發酵泡沫，此時難以繼續生成L-Phe，但菌體持續耗糖，導致轉化率下降；實驗組產量在經歷了0～20 h的緩慢積累后，在20～35 h達到了產酸的高峰期，之后增長速度減緩，但總量依舊在增長，最終產量為85.4 g/L，較對照組增加了51.4%。實驗組實時轉化率曲線波動程度較對照組較大，在0～6 h急劇上升，由于種子液培養時間較長，因此在接發酵后菌體立即開始產酸，且此時菌體擴增速度較緩慢，轉換率急劇上升，在6 h后，生物量開始迅速增加，雖然產酸也在增加，但大部分葡萄糖用于菌體生長，因此糖酸轉化率呈現下降趨勢，在24 h前后，產量接近結晶濃度，與對照組相同，此時轉化率進一步下降，當L-Phe結晶后，菌體進入產酸高峰期，此時轉化率與產量均迅速增加，直至發酵后期(40 h后)產酸速率再次減緩，但耗糖速率下降并不明顯，轉化率再次降低，最終轉化率為26.3%，遠大于對照組的21.4%，即使實驗組轉化率曲線波動較大，但在整個發酵過程中，實時轉化率均高于對照組，因此實驗組更具優勢。

圖6 實時轉化率與產量過程變化Fig.6 Variation of real-time conversion rate and yield in fermentation process

2.4.3 微量元素對副產物的影響

取發酵結束時發酵液進行副產物含量檢測，結果如圖7所示。

實驗組產生了0.8 g/L的乙酸、1.2 g/L的谷氨酸(L-glutamic acid，L-Glu)與0.2 g/L的L-Trp，均不會對菌體的生長代謝以及后續提取造成影響。對照組乙酸含量為6.7 g/L，此時的乙酸含量可嚴重影響菌體的生長代謝，是對照組發酵后期生物量迅速下降的主要原因；L-Glus與L-Trp含量達到了3.3、1.4 g/L，分別比對照組增加了175%、600%，既影響轉化率，又提高了后續分離提取難度；對照組發酵液中檢測出來了L-Ala(1.8 g/L)，這在實驗組并未檢出，推測是由于莽草酸途徑關鍵酶活力不夠，導致糖酵解途徑大量積累丙酮酸，而丙酮酸作為L-Ala的直接前體，經過一步反應即可生成L-Ala，通常來講L-Ala只作為氨基酸代謝的中間體，難以積累[24]，但對照組在發酵后期衰亡嚴重，菌體幾乎無法進行代謝反應，使得L-Ala能夠少量積累。

圖7 副產物產量對比Fig.7 Comparison of by-product yield

3 結論

金屬離子、維生素等微量元素可在微生物眾多代謝途徑中起到關鍵作用，如作為關鍵酶的輔酶、輔因子，或者作為反應前體物質的載體等，L-Phe作為莽草酸途徑的主要代謝產物，其合成路徑長、副產物多，涉及的酶促反應較多，因此對微量元素的種類及用量要求較高，本研究通過單因素試驗、正交試驗、發酵罐驗證實驗，以關鍵酶活力、L-Phe產量、糖酸轉化率、副產物含量等為指標，對L-Phe發酵涉及的微量元素種類及用量進行優化了，最終確定的種類為及用量分別為：CaCl2·2H2O 1.1×10-2g/L、CuSO4·5H2O 4.7×10-4g/L、CoCl2·6H2O 6×10-3g/L、ZnSO46 ×10-4g/L、FeSO4·7H2O 2.8×10-2g/L、MnSO4·H2O 1.4×10-2g/L、NiCl2·6H2O 6.06×10-3g/L、PLP 9.5×10-3g/L、維生素B26×10-3g/L。以不添加微量元素為對照組，優化后產酸期明顯延長，DAHP、CM、PDT、芳香族氨基酸轉氨酶的酶活力顯著提高，生物量(OD600)達到了122.8，較對照組提高了17.5%，L-Phe產量達到了85.4 g/L，較對照組提高了51.4%，糖酸轉化率達到了26.3%，較對照組提高了18.6%，副產物種類與含量均遠低于對照。本實驗確定了維生素B2對L-Phe發酵的促進作用與生物素(維生素H)的負面影響，針對性優化了CoCl2·6H2O、PLP的用量，進一步優化了FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O等微量元素的用量。最終L-Phe產量較文獻[4]最高記載提高了4.5%，這對L-Phe的工業化生產具有積極意義。