蛋清蛋白/殼聚糖復合物和微凝膠理化性質的比較研究

姚家鈺，曹可軒，鄒云帆，單媛媛

(西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌，712100)

隨著人們對可持續型和環境友好型產品的廣泛關注，利用天然生物大分子構建活性成分的遞送體系愈發受到重視。其中，蛋白質/多糖復合載體因其高生物相容性、可生物降解性及無毒性，逐漸成為用于構建膠體粒子的最常見食品級生物聚合物[1]。例如，利用反溶劑法制備具有核殼結構的玉米醇溶蛋白/阿拉伯膠運載體系，可以實現對生育酚的高效負載且具備良好的酸堿穩定性[2]；大豆分離蛋白與大豆多糖可通過自組裝制備單分散納米顆粒并與姜黃素結合形成微膠囊結構[3]；乳清蛋白、酪蛋白可以同帶有相反電荷的多糖以靜電力相結合，而后通過疏水作用和靜態猝滅與花色苷發生相互作用，增強花色苷的穩定性[4]。但目前關于蛋白/多糖相互作用的研究主要聚焦在單一的蛋白和多糖，而對以蛋清蛋白為代表的復雜蛋白體系與多糖相互作用的研究較少。殼聚糖(chitosan， CS)是自然界中為數不多的堿性食品級陰離子多糖，具有良好的抗氧化性、成膜性和抑菌性[5]。諸多研究結果表明，蛋白質與多糖間的相互作用力主要是靜電力，此種作用力高度依賴生物高分子的自身特性，如總濃度，混合比例，側鏈基團種類，同時還受環境條件如pH和溫度的影響[6]。此外，熱處理可加速多糖/蛋白體系相變的發生，適當加熱可制備微凝膠[7]，此種微凝膠與蛋白質/多糖復合物在理化性質上是否存在差異尚缺少充分的實驗證據。

本研究以蛋清蛋白(egg white protein， EW)與CS為原料，利用簡單的靜電相互作用制備EW/CS復合物，并將其加熱得到EW/CS微凝膠。從濁度、粒徑、Zeta電位、紫外光譜及流變學角度分析微凝膠與復合物性質上的差異，并進一步探究兩者用于花青素(anthocyanin， AN)的穩態維持與遞送的可行性[8]，以期為構建特定的膠體遞送體系提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

蛋清蛋白粉末，使用新鮮蛋清進行冷凍干燥制備，由95%的蛋白質組成，脂肪含量以干重計小于1%；殼聚糖(脫乙酰度為75%)，北京索萊寶科技有限公司；藍莓花青素提取物，密蘇里州圣路易斯公司(中國)。

1.2 儀器與設備

UV-1900 紫外分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；DHR1型流變儀，美國TA公司；ZS90型激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 EW/CS復合物與微凝膠的制備

稱取殼聚糖粉和蛋清粉，于室溫下分別溶解于0.8%(體積分數)醋酸溶液和0.1%(質量分數)NaOH溶液，磁力攪拌使之完全溶解以制備成2 mg/mL溶液。將EW溶液按照不同比例緩慢滴入CS溶液中，同時以純蛋清和CS為對照。通過加入0.1 mol/L的醋酸或0.1 mol/L的NaOH調節體系至不同pH值，室溫下攪拌30 min以制得復合物。將制備的復合物于60 ℃加熱30 min得到微凝膠。

1.3.2 聚合物質量比對EW/CS體系性質的影響

在pH為6.0，EW質量濃度為1.0 mg/mL的條件下，分別按照EW與CS質量比=10∶2、10∶4、10∶6、10∶8和10∶10制備EW/CS復合物和微凝膠，進行濁度、粒徑、Zeta電位、紫外吸收光譜及流變學性質的測定。

1.3.3 pH值對EW/CS體系性質的影響

設置EW質量濃度為1.0 mg/mL，EW與CS質量比=10∶8，通過添加0.1 mol/L HCl或NaOH溶液調整復合體系pH值=2、3、4、5、6、7，制備EW/CS復合物和微凝膠，進行粒徑、Zeta電位、紫外吸收光譜及流變學性質的測定。

1.3.4 AN提取物含量對EW/CS體系性質的影響

設置EW質量濃度為1.0 mg/mL，EW與CS質量比=10∶8，pH 6.0，添加1%、3%、5%、7%、9%和12%(質量分數)的藍莓AN提取物，制備EW/CS/AN復合物和微凝膠，進行理化性質的測定。

1.3.5 濁度、粒徑和Zeta電位分析

使用UV-分光光度計，以蒸餾水為空白對照，于600 nm，25 ℃條件下測量樣品濁度。使用激光粒度儀，以相同濃度的CS溶液和EW溶液作為對照，在25 ℃測量樣品的粒徑和Zeta電位。

1.3.6 紫外吸收光譜掃描

使用分光光度計，測試溫度25 ℃，掃描范圍220～500 nm，測量不同樣品的UV-Vis吸收光譜。同時以1.0 mg/mL的CS溶液和EW溶液作為對照。

1.3.7 流變學性質的測定

使用流變儀在室溫(25 ℃)下測定不同樣品的表觀黏度和動態黏彈性質，測試夾具CP4/40，間距1.0 mm，錐角4°，平衡5 min，應力0.1 Pa，應力剪切范圍1～100 s-1[9]。

1.3.8 AN負載量的測定

稱取CS粉和花青素，于室溫下溶解于0.8%醋酸溶液，磁力攪拌使之完全溶解以制備成CS 1.6 mg/mL、AN 0.5 mg/mL的溶液。與等量2 mg/mL EW溶液混合并調節體系pH=6，分別制備復合物與微凝膠。負載率的計算方法參照文獻[10]并加以改動：分別精密吸取5 mL的微粒溶液至于Ultra-15超濾離心管中(截留分子質量10 000)，于4 000 r/min轉速離心30 min，游離AN分離至外部離心管，在530 nm處用紫外分光光度計測定其吸光值，通過制作的標準曲線確定未負載AN含量，按公式(1)計算負載率：

(1)

1.4 數據分析

使用Origin 2017和Excel 2017分析所有數據。通過單向方差分析(ANOVA)對樣本進行比較，并通過SPSS軟件使用Duncan檢驗分析顯著差異。所有數據重復測量3次并表示為平均值±標準偏差。

2 結果與分析

2.1 聚合物質量比的影響

2.1.1 濁度、Zeta電位和粒徑

生物高分子間的相互作用可以用濁度進行簡單表征。濁度主要由溶液中聚合物分子質量和大小的變化引起，因此濁度的變化被認為是蛋白質-多糖聚合物形成或解離的結果[11]。一般情況下，膠體乳液的濁度受溶液中顆粒的濃度、折射率以及粒徑影響，而這些指標在溶液中形成復合物或微凝膠的過程中都會發生改變。因此，本研究結合濁度、粒徑和Zeta電位的測量結果來表征EW與CS間發生的相互作用，結果如圖1所示。

如圖1-a，純CS溶液(0∶10)在pH 6.0時不含有大的懸浮顆粒，吸光度接近于0。在EW濃度固定的條件下，隨著混合體系中CS的濃度增大，復合物與微凝膠體系的濁度均下降，ZHANG等[6]研究中豌豆分離蛋白/殼聚糖復合物水溶液濁度隨著CS濃度的升高而下降的趨勢一致。由圖1-b中也可以看出，CS的添加使復合物與微凝膠的粒徑均降低，這可能是由于CS濃度的增加，體系中與單位蛋白結合的殼聚糖分子增加，改變了蛋白原有的伸展結構，使其折射率下降、光散射減少，從而引起濁度和粒徑的降低[12]。

CS是一種堿性多糖，在廣泛的pH的范圍內都帶有正電荷。蛋清中大部分蛋白質的等電點在4.5～6.0，在低pH條件下蛋清溶液帶負電荷。EW/CS體系相比于EW(10∶0)溶液具有更高的正電荷，但相對于CS溶液(0∶10)電性較弱(圖1-c)，說明EW和CS在一定pH范圍內發生了電荷中和，可以推測它們之間很有可能形成靜電復合物[13]。

a-濁度；b-粒徑；c-電位圖1 EW與CS質量比對復合物與微凝膠濁度、粒徑和Zeta電位的影響(P<0.05)Fig.1 Effect of mass ratio of EW to CS on turbidity, particle size and Zeta potential of complexes and microgels(P<0.05) 注：大寫字母不同表示相同原料比例下兩處理組樣品結果差異顯著；小寫字母不同表示同處理組樣品在不同原料比例下結果差異顯著(下同)

2.1.2 紫外吸收光譜

為了進一步驗證CS的結合對EW微觀構象的影響，對不同比例的復合物與微凝膠進行了紫外吸收光譜掃描。構成蛋白質的酪氨酸和色氨酸殘基具有紫外吸收性質，當蛋白質分子所處的微環境發生改變，會引起氨基酸殘基構象變化，進而使基團的紫外吸收光譜發生變化[14]。當蛋白質與多糖相互作用后會引起吸收峰的位移和吸光度的改變，這些變化于280 nm附近對環境變化高度敏感[15]，故可利用UV光譜曲線反映EW與CS的相互作用結果。如圖2所示，CS溶液在280 nm處無紫外吸收，復合物與微凝膠在280 nm處的吸收峰強度高于相同濃度的EW溶液，說明CS與EW蛋白間發生了相互作用，這種相互作用導致EW結構骨架趨于松散，肽鏈的伸展使得蛋白質分子內部疏水區中芳香族氨基酸殘基裸露。吸收峰強度的增強也表明此種構象的變化有利于蛋白質分子中色氨酸和酪氨酸殘基芳香環的π-π*躍遷[14]。隨著CS添加量的增加，復合物在280 nm處的吸收峰值下降，這可能是由于長碳鏈殼聚糖的空間屏蔽作用使蛋白質與多糖的結合更為緊密，減少了蛋白質中芳香族氨基酸的暴露[6]。微凝膠在280 nm處的吸收峰值均高于對應的復合物，這可能與熱處理導致的蛋白質結構改變有關。

a-復合物；b-微凝膠圖2 EW與CS質量比對復合物與微凝膠紫外吸收的影響Fig.2 Effect of mass ratio of EW to CS on UV absorption of complexes and microgels

2.1.3 流變學性質

黏彈性質是反映高分子內部結構與性質的重要指標。先前的研究結果表明，復合物黏度與對小分子藥物的包埋率存在正相關性[16]，因而分析復合物與微凝膠的黏度可在一定程度上反應其功能性質。EW/CS不同體系黏度變化如圖3所示。復合物和微凝膠黏度均隨剪切速率增加而降低，表明二者為假塑性流體[17]，在剪切速率增加的過程中，分子按照剪切的方向呈現線性排列。在復合物中(圖3-a)，CS的添加明顯提高了蛋清溶液的黏度，說明CS與EW發生相互的作用改變了體系的物理特性。在微凝膠體系中，純EW溶液黏度的明顯增加，可能是由于蛋白在變性溫度附近長時間加熱導致部分凝集造成的(圖3-b)。低濃度CS的添加并沒有顯著影響蛋清蛋白的黏度，但當EW與CS的質量比達到1∶1后，微凝膠體系的黏度反而下降，這可能是由于蛋白可以通過物理相互作用與多糖結合，導致體系電荷被中和，分子鏈的運動和擴散更容易進行，體系更容易達到能量較低的穩定狀態[18]，這可以進一步通過動態掃描獲得相應的黏彈性參數來進行驗證。圖3-c、圖3-d顯示了不同的EW/CS體系中儲能模量(G′)隨時間的變化情況。EW和CS發生相互作用時G′值會迅速增加，凝膠點是體系G′為1 Pa時的參數點，是多糖/蛋白體系相轉變的重要參數[19]。由圖3可以看出，CS的添加縮短了EW形成可溶性復合物及凝膠網格的時間，但是當復合物中EW∶CS超過10∶4后(微凝膠10∶6)，CS的添加使得體系中未被中和的電荷量增加，體系能量較高難以達到穩定狀態，EW/CS凝膠網格形成延緩。

a-復合物黏度；b-微凝膠黏度；c-復合物儲能模量；d-微凝膠儲能模量圖3 EW/CS質量比對復合物與微凝膠流變學性質的影響Fig.3 Effect of mass ratio of EW to CS on the rheological properties of complexes and microgels

2.2 環境pH的影響

2.2.1 粒徑和Zeta電位

pH值會影響靜電相互作用的大小與范圍，進而對通過此種相互作用結合的蛋白/多糖性質造成改變[20]。如前所述，EW和CS在一定pH范圍內會發生電荷中和，實驗pH范圍內(pH 2.0～6.0)就有此種中和反應發生，復合物與微凝膠2種體系在此范圍內都較為穩定，但復合物體系比微凝膠體系的Zeta電位具有更高的pH穩定性(圖4-a)。此外，在pH變化過程中微凝膠平均粒徑均高于復合物(圖4-b)。以上結果表明，對復合物進行熱處理會引起其微觀結構的改變和電位特性的變化，這些變化將會影響其穩定性。

a-電位；b-粒徑圖4 環境pH對復合物與微凝膠Zeta電位和粒徑的影響 (P<0.05)Fig.4 Effect of environmental pH on the Zeta potential and particle size of complexes and microgels(P<0.05)

2.2.2 紫外吸收光譜

如圖5-a，單一EW溶液于pH 5時紫外吸收峰達最大值，在此等電點附近的環境pH條件下，蛋白分子間發生凝集導致吸光度增加。CS的加入改變了其原有的電荷性質，使EW溶液于280 nm處的吸收峰降低。pH 4條件下EW溶液與EW/CS混合溶液吸光度峰值基本相同，說明較低的pH值更有利于復合物結構的穩定。如圖5-b，微凝膠中紫外吸收光譜整體變化趨勢與復合物近似，隨著環境pH改變，EW/CS微凝膠峰值波動較大，表明微凝膠隨環境pH變化結構改變更為明顯，有望用于酸堿觸發釋放載體的構建。而復合物相對穩定，可適用于持續釋放載體的構建。

2.2.3 流變學性質

EW與CS在酸性水溶液中均帶電荷，具有聚電解質特性，因而環境pH對其溶液性質存在一定影響。如圖6-a，EW/CS復合物黏度隨pH增大而上升，并于pH 6時達到最大值，微凝膠中pH-黏度整體變化趨勢與復合物基本一致，但黏度曲線隨環境pH變化更顯著，進一步表明EW/CS微凝膠對環境pH的改變更為敏感。

2.3 AN提取物含量

AN具有多種生理活性，但其自身性質結構不穩定[21]。本研究對EW與CS質量比為10∶8，環境pH為6，AN提取物添加量為8%時，EW/CS復合物與微凝膠對花青素的負載率進行計算。結果如圖7所示，EW/CS復合物與微凝膠均可實現對AN的有效負載，負載率分別為55.31%和50.61%，這可能是由于復合物在加熱形成微凝膠的過程中結構發生改變，影響了對AN的負載。因此，本研究進一步考察了AN添加量對EW/CS復合體系結構與性質的影響，如圖8和圖9所示。

a-復合物；b-微凝膠圖5 環境pH對復合物與微凝膠紫外吸收光譜的影響Fig.5 Effect of environmental pH on the viscosity of complexes and microgels

a-復合物黏度；b-微凝膠黏度；c-復合物儲能模量；d-微凝膠儲能模量圖6 環境pH對復合物與微凝膠流變學性質的影響Fig.6 Effect of environmental pH on the rheological properties of complexes and microgels

2.3.1 濁度、粒徑和Zeta電位

AN在水溶液中溶解呈弱酸性，帶負電，其添加會影響蛋白/多糖體系的特性[22]。如圖8所示，當AN添加量低于3%(質量分數)時，復合物與微凝膠體系濁度、粒徑降低，Zeta電位升高。當AN添加量超過3%，復合物與微凝膠體系濁度、粒徑升高，Zeta電位降低，電荷平衡狀態難以維系，溶質部分析出，體系穩定狀態被破壞。微凝膠體系的粒徑在AN添加量為1%～5%時低于復合物(圖8-a)。綜上所述，在AN添加量為3%時體系較為穩定。

2.3.2 流變學性質

AN可以與多糖產生氫鍵相互作用而影響體系的流變學性質[23]。如圖9所示，EW/CS復合物和微凝膠體系中，AN添加量對復合物體系黏度的影響不大，但加入AN后EW/CS微凝膠黏度明顯高于復合物(圖9-a，圖9-b)。同時，微凝膠的凝膠網格形成時間明顯延長(圖9-c，圖9-d)，這是由于AN自身帶有的電荷影響了體系原有的靜電相互作用[22]，這種相互作用的改變破壞了EW/CS間結合的穩定性，進而也對體系的熱穩定性造成影響。

圖7 復合物與微凝膠對花青素的負載(P<0.05)Fig.7 Complexation of anthocyanin by complexes and microgels (P<0.05)

3 結論

利用簡單的靜電相互作用驅動方法可以制備EW/CS復合物，對復合物加熱可得微凝膠，2種體系均可用于AN的負載與遞送。EW與CS的質量比對

a-粒徑；b-電位；c-濁度圖8 花青素添加量對復合物與微凝膠粒徑、Zeta電位和濁度的影響(P<0.05)Fig.8 Effect of anthocyanin addition on particle size, Zeta potential and turbidity of complexes and microgels(P<0.05)

a-復合物黏度；b-微凝膠黏度；c-復合物儲能模量；d-微凝膠儲能模量圖9 花青素添加量對復合物與微凝膠流變學性質的影響Fig.9 Effect of anthocyanin addition on the rheological properties of complexes and microgels

復合物和微凝膠的粒徑及電荷性質有顯著影響。通過改變pH和AN的添加量，可以調節EW與CS間的靜電相互作用，從而可對形成的復合物及微凝膠的性質進行調控。2種體系相比，EW/CS的微凝膠對環境變化更為敏感，適用于酸堿觸發釋放載體的構建，而復合物性質相對穩定，適用于持續釋放載體的構建。