玉竹多糖低共熔溶劑提取工藝優化及其抗氧化和抗糖基化活性研究

何瑞陽，王鋒*，蘇小軍，李清明，楊華，朱曉慧，范寬秀，江雪梅

1(湖南農業大學 食品科學技術學院，湖南 長沙，410128)2(湖南省發酵食品工程技術研究中心，湖南 長沙，410128) 3(湖南農業大學 生物科學技術學院，湖南 長沙，410128)

玉竹(Polygonatumodoratum)為百合科黃精屬玉竹的根莖，又名葳蕤、鈴鐺菜、尾參，是我國重要的藥食同源大宗藥材，具有滋陰潤燥、生津止咳的功效。現代藥理學研究表明，玉竹具有抗氧化、調節免疫力、降糖、降血壓等作用[1]。玉竹含有豐富的多糖、黃酮、多酚等成分[2]，其中，多糖是其主要活性成分，在醫藥、食品、化妝品行業具有廣闊的應用前景[3]。

低共熔溶劑(deep eutectic solvents, DESs)自ABBOTT等[4]2003年首次提出之后，由于其具有成本低、易合成、高溶解度、微毒甚至無毒等優點[5]，在生物活性成分提取領域受到廣泛關注。其中，由氯化膽堿作為氫鍵受體(hydrogen-bond acceptor，HBA)與其他氫鍵供體(hydrogen-bond donor，HBD)組成的DESs在黃酮、多酚等生物活性物質的提取方面[3]研究較多。也有文獻報道用于植物活性多糖的提取方面，如梁靜[6]采用氯化膽堿與甘油組合DESs提取鐵皮石斛多糖，提取率高達44.35%，顯著高于傳統提取方式。唐蘭芳[7]采用氯化膽堿與1,4-丁二醇組合提取黃精多糖(Polygonatumsibiricunmpolysaccharide extracted by deep eutectic solvents， DPsP)，最終提取率可達33.81%，約為熱水浸提法的4倍。DESs自身的極性、黏度等對多糖提取率起決定性作用；除此之外，提取過程中的溫度、時間與液料比等也對多糖的提取率有影響[8]，所以在利用DESs提取植物活性多糖時，對提取條件進行優化以獲得最優提取條件至關重要。

大多數關于玉竹的研究，均是熱水提取[1]，鮮有采用DESs提取玉竹多糖(Polygonatumodoratumpolysaccharide extracted by deep eutectic solvents， DPoP)的研究報道。本研究采用DESs提取玉竹中的活性多糖，比較不同DESs組合，研究DESs摩爾比、DESs含水量、提取溫度、提取時間、液料比等因素對多糖提取率的影響，通過響應面優化工藝參數，采用DPPH法、ABTS法、氧化自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)法對其進行抗氧化活性測定，并測定DPoP對糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)生成的抑制作用，旨在建立一種玉竹多糖的高效提取方法，并為玉竹多糖的開發利用提供理論依據和技術參數。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉竹(品種：豬屎尾)，產自湖南郴州桂陽；葡萄糖(純度≥99%)，上海麥克林生化科技有限公司；DPPH(純度>97%)，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；ABTS(純度≥98%)，上海瑞永生物科技有限公司；2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine，TPTZ，純度≥98%)，上海瑞永生物科技有限公司；氨基胍(純度≥98%)，美國Sigma公司；乙醇(含量≥99.7%)，成都市科隆化學品有限公司；考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)、無水葡糖糖、氯化膽堿、尿素、硫酸、甲醇等均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；BJ-100型高速多功能粉碎機，德清拜杰電器有限公司；101A-3ET電熱鼓風干燥箱，上海實驗儀器廠有限公司；SCIENTZ-18 N冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；TGL16M冷凍離心機，長沙英泰儀器有限公司；RE-2000B旋轉蒸發器，鞏義市予華有限責任公司；SHZ-D(I)W循環水式多用真空泵，上海力辰邦西儀器科技有限公司；UV1901G/UV1901PCS紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；H-8數顯恒溫水浴鍋，上海浦東物理光學儀器廠；VarioskanFlash多功能讀數儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；IRAffinity-1傅立葉紅外光譜儀，日本島津有限公司；F-7000熒光分光光度計，日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料預處理

新鮮玉竹洗凈、去須、切片，放入烘箱中，60 ℃烘干至水分含量10%以下，使用高速多功能粉碎機粉碎，過70目篩得玉竹粗粉，低溫密封保存備用。

1.3.2 玉竹多糖提取

(1)熱水浸提法(Polygonatumodoratumpolysaccharide extracted by hot water,HW)：根據《國家藥典》第三部(2015版)，稱取1 g玉竹粗粉置于圓底燒瓶內，加入蒸餾水100 mL，加熱回流1 h，脫脂棉過濾，重復提取2次，濾液合并濃縮置100 mL容量瓶定容，得水提多糖溶液(HWPoP)。

(2)DESs提取法：稱取1 g玉竹粗粉置于三角瓶中，以一定比例加入DESs，熱水浴提取，提取結束冷卻后加入4倍體積無水乙醇，4 ℃醇沉12 h后離心、復溶于100 mL蒸餾水，得DESs提取多糖溶液(DPoP)[9]。

1.3.3 玉竹多糖提取率計算

葡萄糖標準曲線制備：采用苯酚-硫酸法制作標準曲線，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。回歸方程為y=26.337x-0.003 9，R2=0.999 5。

按照1.3.2提取操作各重復3組，采用苯酚-硫酸法比對標準曲線測定多糖含量，按照公式(1)計算多糖提取率：

(1)

式中：C，通過標準曲線計算得多糖質量濃度，mg/mL；V，樣品體積，mL；N，稀釋倍數；m，稱取玉竹粗粉質量，g。

1.3.4 不同組合DESs對玉竹多糖提取率的影響

以多糖提取率為指標，選取酰胺(尿素)、羧酸(丁二酸、檸檬酸)和多元醇(1,4-丁二醇、乙二醇)作HBD，氯化膽堿作HBA，以摩爾比2∶1的比例配成5種不同組合的均勻穩定的DESs溶液[10]，在溫度90 ℃、液料比30∶1、提取時間40 min，按照1.3.2(2)提取方法提取玉竹多糖，并計算提取率。5種DESs組合見表1。

表1 DESs類型Table 1 Type of DESs

1.3.5 單因素實驗設計

從1.3.4提取結果中選擇提取率最高的DESs組合，在本實驗室的研究基礎上選取DESs摩爾比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1)、提取溫度(50、60、70、80、90、100 ℃)、提取時間(20、30、40、50、60、70 min)、溶劑含水量(0%、10%、20%、30%、40%、50%)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1)進行單因素考察，考察各因素對提取率的影響。

1.3.6 響應面優化實驗設計

在單因素考察結果上固定DESs摩爾比，對提取溫度(A)、提取時間(B)、溶劑含水量(C)、液料比(D)4個單因素進行響應面優化實驗，以多糖提取率作響應值進行響應面Box-Behnken(BBD)分析，確定多糖提取最優條件組合。響應面實驗因素與水平設計見表2。

表2 響應面實驗因素與水平設計Table 2 Factors and level of Box-Behnken

1.3.7 DPoP制備

參照宗鑫妍等[1]的方法，采用Sevage試劑對1.3.2制備的DPoP溶液進行脫蛋白處理，并采用考馬斯亮藍法測定處理后溶液中可溶性蛋白含量。以BSA作對照，在吸光度595 nm處，以吸光度為縱坐標，蛋白濃度為橫坐標，繪制可溶性蛋白標準曲線，回歸方程為y=5.162 9x+0.040 5，R2=0.999 2。重復脫蛋白操作直至上層多糖溶液中可溶性蛋白含量穩定。經脫蛋白處理的DPoP溶液濃縮至一定體積后加入4倍體積無水乙醇，4 ℃冷藏6 h后離心、凍干得DPoP粉末，將其低溫貯藏備用。

1.3.8 DPoP紅外光譜測定

取1 mg低溫烘干的DPoP粉末，加入100 mg烘干至恒重的KBr，置研缽中研磨均勻，壓片，在波數4 000～400 cm-1內進行紅外掃描。

1.3.9 玉竹多糖抗氧化活性測定

DPPH自由基清除能力測定參照ZHAO等[11]的方法進行；ABTS陽離子自由基清除能力測定參照CHENG等[12]的方法進行；ORAC法參照ZAR等[13]的方法進行。

1.3.10 DPoP抗糖基化能力測定

參照張家成[14]的方法稍做改動，測定多糖的抗糖基化能力，配制20 mg/mL BSA溶液、0.5 mol/L葡萄糖溶液(glucose，Glu)，按照體積比1∶1混合過無菌濾膜，取3 mL BSA-Glu混合液，分別加入樣品1 mL與6.0 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖溶液，搖勻后避光37 ℃ 恒溫孵育6 d，以氨基胍代替樣品做對照組，磷酸緩沖溶液代替樣品做空白對照，測定AGEs在激發波長370 nm，發射波長440 nm處的熒光值，玉竹多糖對AGEs的相對抑制率按公式(2)計算：

(2)

式中：Fc,空白組熒光值；Fs,樣品組熒光值；Fs1,反應體系由緩沖溶液代替Glu樣品的熒光值；Fs2,反應體系由緩沖溶液代替BSA樣品的熒光值。

1.4 數據分析

所有操作均重復3次，實驗數據采用“平均值±標準偏差”表示，采用SPSS 19 LSD法進行方差分析，P<0.05為差異顯著，采用Origin 2018進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同組合DESs對多糖提取率的影響

如圖1所示，多糖提取率依次是UCC>EGCC>BCC>HW>AACC>CACC，尿素與氯化膽堿組合DESs對多糖的提取率顯著高于其他組合，氯化膽堿與多元醇組合DESs提取率高于HW，氯化膽堿與羧酸組合DESs則低于HW，這與汪濤等[15]在提取DPsP時結果類似，引起提取效果差異的原因可能是不同DESs之間的擴散度、溶解度、黏度、極性等理化性質不同。實驗確定以尿素與氯化膽堿組合做后續優化。

圖1 不同組合DESs對多糖提取率的影響Fig.1 Effects of different types of DESs on the yield of polysaccharide 注：不同字母代表差異顯著(P<0.05)，相同字母代表差異不顯著

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 尿素與氯化膽堿摩爾比對提取率的影響

如圖2所示，當尿素與氯化膽堿摩爾比開始增大時，多糖提取率呈現增長趨勢，在3∶1時達到最大，超過3∶1之后，多糖提取率降低，這與尿素中的NH2基團與Cl-形成的氫鍵強弱對DESs的熔點與黏度造成的影響有關[16]，在摩爾比為5∶1時的提取率出現上升現象，而夏伯候等[17]在采用1,2-丙二醇與氯化膽堿組合提取夏枯草總黃酮時于摩爾比5∶1處也出現類似現象，具體原因有待進一步研究。本研究選擇尿素與氯化膽堿摩爾比3∶1做后續優化。

圖2 DESs摩爾比對多糖提取率的影響Fig.2 Effects of DESs molar ratio on the yield of polysaccharide

2.2.2 提取溫度對提取率的影響

如圖3所示，隨著溫度的升高，多糖提取率不斷增大，當溫度超過90 ℃以后多糖提取率呈現下降的趨勢，可能是高溫導致的多糖降解，溫度對DESs的黏度、極性和物料的溶解度都會造成影響[18]，所以選擇提取溫度90 ℃做后續優化。

圖3 提取溫度對多糖提取率的影響Fig.3 Effects of temperature on the yield of polysaccharide

2.2.3 提取時間對提取率的影響

如圖4所示，隨著提取時間延長提取率快速上升，在40 min時達到最大，提取時間超過40 min后提取率降低，在一定時間內，提取時間與活性成分溶出率成正比，超過40 min后可能出現多糖結構破壞降解，導致提取率降低，而在60 min時較50 min時的提取率略有升高，但不具有顯著性(P>0.05)，可能是多糖繼續溶出與結構破壞共同作用的結果。本研究選擇提取時間40 min做后續優化。

圖4 提取時間對多糖提取率的影響Fig.4 Effects of time the yield of polysaccharide

2.2.4 DESs含水量對提取率的影響

如圖5所示，當DESs水分含量在0%～20%時，提取率隨含水量增大而增大，在20%時達到最大，當含水量超過20%，提取率開始下降。含水量在30%～40%出現上升趨勢，然而有趣的是宋歆睿[19]在采用低共熔溶劑提取蒲公英主要活性成分時，目標物的提取率在含水量為40%時較含水量30%時也有所上升，這可能是由于未結合的水降低了DESs的黏度與表面張力，提取率出現上升現象，而含水量繼續增加導致分子間作用力降低，提取率迅速下降[20]。本研究選擇DESs含水量20%做后續優化。

圖5 DESs含水量對多糖提取率的影響Fig.5 Effects of DESs water content the yield of polysaccharide

2.2.5 液料比對提取率的影響

如圖6所示，液料比在10∶1至30∶1時，溶劑量的增加，使得物料細胞與外界溶劑之間造成濃度差，濃度差增加更易使得植物細胞破碎，多糖提取率呈上升趨勢，而當液料比超過30∶1時，過多的DESs可能使得物料之間相互作用減弱，不利于多糖提取，所以選擇提取液料比30∶1做后續優化。

圖6 液料比對多糖提取率的影響Fig.6 Effects of liquid-solid ratio on the yield of polysaccharide

2.3 響應面試驗結果分析

根據2.2結果分析，固定尿素與氯化膽堿摩爾比為3∶1，選取提取時間、提取溫度、DESs含水量與液料比作為單因素，選取多糖提取率為響應值，進行響應面優化實驗，Box-Behnken實驗設計與結果見表3。

2.3.1 回歸方程模型與方差分析

采用Design-Expert 8.0對數據進行回歸擬合分析，二次方程模型為Y=29.69+0.76A+0.46B-0.35C-0.36D-0.14AB-0.58AC+0.54AD+0.14BC-0.29BD+1.02CD-2.20A2-2.30B2-3.09C2-3.07D2。

表3 響應面試驗設計與結果Table 3 Design and result Box-Behnken

根據表4結果分析，回歸模型總回歸系數R2=0.973 4，且模型P<0.01，實驗模型達到極顯著水平，模型方差失擬項P=0.492 6>0.05，說明該模型擬合度良好，可用于預測4種因素不同組合情況下多糖的提取率，模型變量A、B、CD、A2、B2、C2、D2均達極顯著水平(P<0.000 1)，單因素變量C、D及相交變量AC均達顯著水平(P<0.05)，各單因素在取值范圍內，對玉竹多糖提取率影響大小順序為：提取溫度(A)>提取時間(B)>液料比(D)>溶劑含水量(C)。

2.3.2 響應面分析

通過Design-ExPert8.0對數據進行擬合得到響應面圖，響應面的三維圖與等高線圖可以看出2個變量之間的相互作用，如圖7-a所示，隨著提取溫度與含水量的增加，提取率呈現先增大后減小的趨勢，等高線圖密集且呈橢圓形，表明兩變量相交對提取率影響極顯著，如圖7-b所示，隨著含水量與液料比的增大，提取率呈現先增大后減小的趨勢，等高線圖呈橢圓形，證明兩變量相交對提取率影響顯著，如圖7-c所示，隨著提取溫度與液料比的增大，提取率也呈現先增后減的趨勢，三維圖呈凸面，等高線圖橢圓形，但相比圖7-a，等高線較為稀疏，證明兩變量相交對提取率有一定影響，這與方差分析結果一致。

表4 響應面結果分析Table 4 Analysis of Box-Behnken

2.3.3 回歸模型驗證實驗

通過響應面優化分析，得到DESs提取玉竹多糖預測最優工藝條件為：提取溫度91.73 ℃、提取時間40.97 min、溶劑含水量19.2%，液料比29.38∶1，預測多糖提取率為29.80%，為驗證回歸模型可信性，采取上述最佳操作條件進行提取實驗，考慮到實際操作與儀器限制，將最終選取提取條件設為：摩爾比3∶1、提取溫度92 ℃、提取時間41 min、溶劑含水量19%，液料比29∶1，在此優化條件下，多糖提取率為(29.03±0.54)%，與預測值接近，表明該實驗回歸模型可靠，能較為準確的預測玉竹多糖提取率。多糖提取率為熱水浸提法(6.21±0.05)%的4.67倍。

2.4 玉竹多糖紅外光譜測定結果分析

圖8 DPoP紅外光譜圖Fig.8 FTIR of spectra of DPoP

2.5 DPoP對DPPH自由基清除能力

自由基由在人體內積累會引發某些慢性疾病，如動脈粥樣硬化、神經病變、慢性抑郁癥、癌癥等。天然抗氧化劑能清除自由基且具有安全、健康等優點，受到人們廣泛關注[23]，如圖9所示，在測定質量濃度為2～20 mg/mL時，清除率隨樣品質量濃度的增大而增大，當質量濃度達到20 mg/mL時，清除率達到了(17.97±0.47)%，表明DPoP對DPPH自由基有一定的清除能力。經擬合，DPoP曲線方程為y=0.02x2+1.33x-1.98，R2=0.994，IC50=31.03 mg/mL。

圖9 DPoP對DPPH自由基清除率Fig.9 DPPH radical scavenging rate of DPoP

2.6 DPoP對ABTS陽離子自由基清除能力

ABTS陽離子自由基為穩定的有機自由基，在氧化劑作用下氧化成綠色的ABTS陽離子，當抗氧化物存在時，ABTS的產生會被抑制。如圖10所示，結果表明DPoP對ABTS陽離子自由基有一定的清除作用，且在測定濃度范圍內DPoP對ABTS陽離子自由基的清除效果具有濃度依賴性，當質量濃度達到20 mg/mL時，清除率達到了(40.69±0.34)%，經擬合，DPoP曲線方程為y=0.01x3-0.34x2+5.22x+0.38，R2=0.998，IC50=23.25 mg/mL。綜合圖9和圖10，DPoP雖然具有一定的清除DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的能力，但其清除作用均顯著低于陽性對照維生素C，這可能是由于多糖的抗氧化機制與維生素C不同所致。多糖在體內是通過調節抗氧化酶的活性，利用抗氧化酶的還原作用將氧化物還原為低毒或無害的物質，從而達到清除自由基作用[24]，玉竹多糖抗氧化機理有待進一步深入研究。

圖10 DPoP對ABTS陽離子自由基清除率Fig.10 ABTS cationic radical scavenging rate of DPoP

2.7 DPoP的ORAC值

ORAC值最接近真實的生理環境氧化過程，具有可操作性強、靈敏度高等優勢而被廣泛應用于食品功能性成分抗氧化測定方面[10]。以水溶性維生素E為對照組，經計算得玉竹多糖的ORAC值為(121.67±3.65) μmol/g，DPoP在ORAC法中表現出較強的抗氧化能力。唐蘭芳[7]測定低共熔溶劑提取DPsP的ORAC值也達到(130.53±8.29) μmol/g，與DPoP的ORAC值相近；唐仕榮等[25]通過超聲輔助提取枸杞多糖，測得枸杞多糖的ORAC值為78.34 μmol/g，顯著低于DPoP的ORAC值。圖11為對照組標準曲線。

圖11 熒光衰退標準曲線Fig.11 Fluorescent decay standard curve

2.8 DPoP抗糖基化能力

AGEs是糖基化反應的終末端產生的對人體有害物質，與糖尿病、心臟病、腎衰竭和老年癡呆等許多疾病的發展有關[16]。如圖12所示，DPoP對BSA-Glu體系中糖基化終末產物AGEs的抑制作用僅稍低于氨基胍，表現出很強的抗糖基化能力。在測定范圍內，DPoP對AGEs相對抑制率呈線性增長，當DPoP質量濃度達到2.0 mg/mL時，抑制率達到(87.63±0.66)%，展示出良好的抑制效果，作為從食物資源中提取的天然成分，DPoP必將具備很好的應用前景。

圖12 DPoP對AGES相對抑制率Fig.12 Relative inhibition rate of AGES of DPoP

3 結論

DESs提取玉竹中的活性多糖較熱水有更強的溶出能力，工藝確定以尿素-氯化膽堿體系作溶劑，采取響應面優化設計，得到最優提取條件：在尿素-氯化膽堿摩爾比為3∶1，提取溫度92 ℃、提取時間41 min、DESs含水量19%，液料比29∶1的條件下，玉竹多糖最終提取率可達(29.03±0.54)%，為熱水浸提法的4.67倍。

通過紅外光譜分析確定DPoP性質與糖苷鍵類型，DPoP為酸性多糖，存在β-吡喃糖苷鍵與α-吡喃糖苷鍵。DPoP抗氧化測定結果均表明,DPoP具有抗氧化能力，DPoP對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力隨多糖質量濃度增大而增大，在質量濃度為20 mg/mL時，清除率分別達到(17.97±0.47)%、(40.69±0.34)%，ORAC值達到(121.67±3.65)μmol/g；糖基化終末端產物AGEs在體內積累是引發糖尿病的直接因素，抗糖基化結果表明，DPoP對AGEs的生成具有良好的抑制效果，當DPoP質量濃度達到2.0 mg/mL時，抑制率可達到(87.63±0.66)%，DPoP在新型降糖保健食品的開發方面有較大的應用潛力，有望進一步研究體內抗糖作用與機制以及進行相關功能性食品開發。