海洋生物來源免疫調節活性肽的研究進展

楊志艷，惠婷婷，李燕,2,3,李曉暉,2,3*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 2(上海水產品及加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306) 3(農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海，201306)

蛋白質是重要的營養物質，是人體必需氨基酸和能量的來源，除了基本的營養外，利用食物蛋白還可以產生活性肽來促進機體健康。免疫調節活性肽作為活性肽的其中一類，具有增強機體免疫，提高機體對外來病原體抵抗能力等生物功能[1]。

海洋蘊藏巨大的生物資源，擁有豐富多樣的物種以及獨特的化學物質。魚類、貝類、軟體動物、甲殼類動物等海洋生物及其副產物是優質蛋白質的豐富來源。從海洋生物來源的多肽具有抗氧化、調節血壓、抗菌、抗癌、增強免疫等功能。例如，從發酵魚露[2]中獲得了具有較強抗氧化活性的兩個肽段；大眼金槍魚魚頭蛋白[3]小于1 kDa組分對羥自由基、超氧陰離子等有較好的清除能力；此外，金槍魚骨架蛋白[4]中分離得到一種有效的血管緊張素轉化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)抑制肽；對牡蠣[5]進行酶解，從其酶解液中分離到一種新型的富含半胱氨酸的抗菌肽CgPep33，對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌及真菌具有抗菌活性。一些研究報道了海洋生物水解物的抗癌活性。南亞野鯪[6]和鱗半鰭鳳尾魚[7]水解液已被證明可顯著抑制Caco-2、DU-145前列腺癌、1299肺癌、109食道癌的增殖以及PC-3癌細胞。可見，這些海洋源生物活性成分功能多樣，在功能性食品和藥物研發方面具有潛在應用前景。此外，同一生物體不同部位可以制備不同功能活性的多肽，這有利于原料的高效利用。

隨著研究方向不斷拓展，人們把目光投向了海洋生物免疫調節活性肽。本文對目前免疫調節多肽的海洋生物資源種類、活性功能、分離和純化以及結構鑒定等方面進行概括，并淺顯分析了免疫調節活性肽結構與活性的關聯，以期為海洋生物免疫調節活性肽的發掘和產品開發提供參考。

1 海洋生物免疫活性肽的來源

1.1 貝類

目前，我國擁有較大養殖潛力的貝類約占總貝類的16.67%，產量較大的主要包括牡蠣、蛤蜊、扇貝、蟶和貽貝等[8]。在傳統加工食品中，貝類的加工產品主要是制成凍干品、干制品、罐頭、調味品等。在功能性食品和醫藥領域中，海洋貝類具有很大的開發潛力，利用酶水解貝肉中蛋白質可以產生大量的多肽、氨基酸等營養功能成分，形成一些具有特殊生物功能的活性肽。

張彩梅等[9]研究發現，扇貝多肽可顯著提高免疫力低下小鼠NK細胞殺傷活力，并增強腹腔巨噬細胞吞噬功能。葉盛旺等[10]選用青蛤肉為原料，對經篩選得到增殖活性最高的組分進行免疫調節作用研究，結果顯示，其對RAW264.7細胞的生長與增殖具有明顯的促進作用，且顯著增強巨噬細胞的吞噬以及細胞因子分泌能力。KIM等[11]研究貽貝可食用部分的酶解物，結果表明，高分子質量肽片段(>5 kDa)通過調節促炎因子對脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的RAW264.7巨噬細胞具有抗炎作用。WANG等[12]研究了牡蠣水解物發現其對BALB/c小鼠可移植肉瘤S180的生長有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性。同時，荷瘤小鼠的胸腺和脾臟重量系數、NK細胞活性、淋巴細胞脾臟增殖和巨噬細胞吞噬率均顯著升高。

1.2 魚類

海洋魚類蛋白質含量高達80%～90%[13]，且在氨基酸組成和結構功能與陸地生物存在較大差異，預示其蘊藏著結構特別、功能特異的活性肽物質。

紀麗娜[14]從金槍魚頭酶解物中篩選出具備免疫調節活性的組分，在一定的劑量范圍內該酶解物可促進巨噬細胞的增殖且無細胞毒性。袁學文等[15]研究了遠東擬沙丁魚蛋白提取肽的免疫活性，發現遠東擬沙丁魚低聚肽可以增強正常小鼠免疫力。CHALAMAIAH等[16]采用胰蛋白酶和胃蛋白酶分別酶解南亞野鯪魚卵蛋白，結果表明，胰蛋白酶酶解產物對小鼠脾臟中的CD4+和CD8+T細胞有刺激作用，而胃蛋白酶水解物也可對巨噬細胞的吞噬功能以及NK細胞的細胞活性起到增強作用。HOU等[17]從鱈魚骨架中提取了具有免疫活性的多肽。YANG等[18]研究了鮭魚膠原蛋白水解物，發現其可增加脾臟的抗炎因子分泌，通過增加CD4+T免疫細胞保護脾細胞。

1.3 無脊椎動物

海參作為擁有悠久歷史海洋無脊椎動物，種類多且分布廣泛。除具有抗氧化、降血壓、抗腫瘤以及調節血糖等生理功效，海參肽的免疫調節功能也已得到證實。盧連華等[19]研究結果顯示，海參肽對小鼠遲發型變態反應具有促進作用，Con A誘導的脾淋巴細胞增殖能力明顯增強。何麗霞等[20]發現從海參中提取的寡肽顯著提高小鼠細胞免疫、體液免疫、巨噬細胞吞噬功能及NK細胞活性(P<0.05)，且與乳清蛋白相比，效果更優。

1.4 其他海洋生物

在苛刻的海洋環境條件下，海洋微生物產生了耐高壓、耐低溫、厭氧、嗜鹽等特性。也因此，海洋微生物在免疫調節、抗氧化、抗菌等方面，較之于陸地微生物，具有獨特生物活性。研究表明，海洋微生物具有特殊的免疫活性能參與自身免疫病的調控。CIAN等[21]從一種紅色海藻中獲得富含Aps、Ala和Glu的蛋白酶解物，對大鼠脾淋巴細胞有促分裂作用且可增強脾細胞、巨噬細胞和淋巴細胞中IL-10的分泌，抑制巨噬細胞中TNF-α和其他促炎細胞因子的產生。另外，有研究者從海洋哺乳動物體中分離出具有免疫調節的活性肽。郭昱等[22]研究了鯊魚肽對小鼠免疫性肝損傷的保護作用，并探究其免疫調節活性，發現鯊魚肽能有效誘導外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,，PBMC)分泌IFN-γ，抑制TNF-β的表達。

2 海洋生物免疫活性肽的制備方法

2.1 酶解法

酶解法條件溫和，操作過程安全可控，已成為制備活性肽廣泛使用的手段。常用蛋白水解酶包括三大類，即動物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶。蛋白酶的作用具有專一性，每種酶都有其專一的酶切位點，因此根據不同底物選用不同的蛋白酶，以此從目標蛋白質中獲得所需肽段[23],如表1所示。

表1 常用蛋白水解酶Table 1 Proteolytic enzymes of different origin

鄧志程等[24]利用胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶的復合酶酶解馬氏珠母貝全臟器，多肽得率達55%以上。HOU等[17]用胰蛋白酶酶解阿拉斯加鱈魚，在pH 8.0，50 ℃條件下水浴4.8 h，發現水解度為15%～18%時所得產物活性最高。葉盛旺等[10]利用胃蛋白酶制備青蛤多肽，條件為料液比1∶10(g∶mL)、加酶量1 600 U/g，于pH 2.0，42 ℃酶解8 h，獲得產物具有體外免疫調節作用。胡旭陽等[25]采用5種不同的蛋白酶水解日本黃姑魚魚肉蛋白，最終得到料液比1∶11(g∶mL)、pH 6，59 ℃酶解5.4 h為最佳酶解工藝條件，細胞實驗得到小鼠巨噬RAW264.7增殖率為(61.8%±0.5)%。王敏等[26]以鮑魚漿為底物，水浴加熱至50 ℃，調節pH至7.0，酶添加量為4%，風味蛋白酶與中性蛋白酶以質量比3∶2復配，酶解4 h，制得鮑魚水解肽(純度≥90%)。結果顯示鮑魚水解物對LPS誘導MH-S細胞分泌IL-1β、IL-6、TNF-α活性具有抑制作用。蔡本利等[27]以金槍魚為原料，酶解條件為料水比1∶3(g∶mL)、加入1 400 IU/g原料的中性蛋白酶與1 100 IU/g原料的木瓜蛋白酶、溫度50 ℃，酶解2.5 h，所得金槍魚頭酶解液顯著提高了小鼠的脾淋巴細胞轉化能力及抗體細胞形成能力。

2.2 其他制備技術

DUARTE等[28]利用酵母發酵太平洋無須鱈魚蛋白，探討發酵物的免疫活性，發現小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力得到顯著提升， IL-4、IL-6和IL-10細胞數量也明顯增加。人工合成法包括化學合成法和基因重組法，適于大分子活性肽的制備。直接提取法即采用有機溶劑(如乙醇，丙酮等)萃取。蔣定文等[29]采用鹽溶液抽提、超濾、乙醇沉淀等步驟，從海洋星蟲制備提取物，實驗結果表明，該提取物具有免疫調節作用。然而直接提取法多用于內源性海洋生物活性肽，不足之處是存在溶劑殘留的風險。

3 海洋生物免疫活性肽分離純化技術

蛋白質初步分解得到的產物往往是包含不同分子大小的肽段，需要進一步的分離純化才能獲得高純度的目標活性肽分子。蛋白質水解物通常含有不同肽的混合物。肽的大小、電荷或極性的分餾通常是相當困難的，這使得肽的后續鑒定具有挑戰性。

目前，最常用的分離純化技術是膜技術和色譜技術。通常步驟是利用超濾進行初次分離，根據分子質量大小篩選活性較高的肽段組分，經離子交換色譜或凝膠色譜對超濾所得高活性組分進行二次分離，利用高效液相色譜或反高效液相色譜對目標組分進行純化。

3.1 膜分離技術

膜分離技術利用大小不同的微孔，通過壓力實現選擇性分離。大分子被截留在膜表面，小分子透過微孔進入膜的另一側。最常用到的是超濾膜(0.005～0.1 μm)，根據膜孔徑大小可分為：<1、3、5、10 kDa，或輔助以無機陶瓷膜進行多肽提取物的除雜及分離。由于采用膜分離過程中不會引起待測物的相變及化學變化，保護了其原有特性，并且操作簡單、選擇性高、耗能低，在活性肽分離提取中應用十分廣泛。

袁學文等[15]對遠東擬沙丁魚酶解液先經陶瓷膜(孔徑0.2 μm)過濾，再由5 kDa超濾膜超濾，得到在1 kDa以下組分低聚肽，具有增強正常小鼠免疫功能。李婉等[30]對香港牡蠣進行研究，利用200 μm陶瓷膜過濾裝置除去牡蠣酶解液中雜質，然后將濾液經超濾膜進行分級處理，得到4個不同分子質量組分，各超濾組分質量濃度為0.25～4.0 mg/mL，其體外免疫活性強度與濃度呈相關性。丁霈希等[31]利用<3 kDa超濾膜對等邊淺蛤肉酶解產物進行分離，得到兩個組分(<3 kDa和>3 kDa)，通過細胞實驗和動物實驗結果表明，<3 ku組分具有一定的免疫調節效果。

3.2 凝膠層析

凝膠層析根據多肽分子質量大小進行分離。常用的是葡聚糖凝膠G-25和G-10，G-25適用分子質量較大的肽，G-10除分離多肽外還可以用于樣品脫鹽。凝膠層析分離技術操作較為簡單，且不易引起樣品失活。

紀麗娜[14]對金槍魚頭蛋白酶解液進行超濾分離得到了10～5 kDa的酶解液(TIP)，然后又經葡聚糖凝膠Sephadex G-25進行進一步分離，選擇柱規格2.6 cm×60 cm，流速0.5 mL/min，上樣量質量濃度20 mg/mL，上樣量5 mL，此條件下TIP可以分為5個組分。何小慶[32]利用Sephadex G-25凝膠層析對波紋巴非蛤的酶解物進行二次分離，得到P2(757～2 856 Da)和P3(634～1 229 Da)組分，可以顯著提高淋巴細胞的增殖活性。

3.3 離子交換層析

離子交換色譜的分離是根據分離組分帶電荷離子與可交換離子發生可逆轉化，達到交換平衡，最終實現分離。根據交換粒子電負性不同，分為陽、陰離子交換色譜柱兩種。對于極性多肽分子有較好分離效果，且可反復使用。但是被分離物容易受到酸、堿以及離子強度等環境的影響。

離子交換色譜法多與膜技術、凝膠色譜法、反相液相色譜法結合使用。鄧志程等[24]利用凝膠柱層析和強陰離子交換色譜從馬氏珠母貝酶解產物中篩選出2個具有免疫活性的肽段。馮曉梅等[33]聯合使用Sephadex G-25凝膠色譜、離子交換色譜對酶解產物進行分離，再由C18反相高效液相色譜(reversed-phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)純化，得到高純度活性肽。XU等[34]將超濾分離的得到活性最高的組分(<1 kDa)經DEAE-Sepharose Fast Flow進一步分離，獲得5個主峰。

3.4 高效液相色譜

高效液相色譜根據混合物的組分在流動相和固定相之間分配系數的不同達到分離目的。當流動相攜帶組分與固定相中發生相互移動時,混合物中組分逐漸分離。高效液相色譜法主要應用于分子質量<5 000 Da，尤其是低于1 000 Da的多肽的分離與純化。

NGUYEN等[35]采用Superdex Peptide10/300 GL GFC柱，結合反向高效液相色譜技術對黃鰭金槍魚酶解產物進行了有效的分離純化。高效液相色譜還可與其他分析技術手段聯用以鑒定多肽結構，左愛華等[36]使用高效液相色譜-串聯質譜技術對海參低聚肽進行了結構分析。

3.5 RP-HPLC

RP-HPLC是以非極性載體作為固定相，以極性強的溶劑為流動相的一種液相色譜分離技術。它的分辨率比其他分離方法更高效，應用范圍廣。常用于分離純化分子質量<5 000 Da的多肽組分。

ZHENG等[37]采用凝膠色譜和RP-HPLC技術對馬尾藻蛋白酶解物進行分離純化，得到了12個主要成分。LEE等[38]利用RP-HPLC純化菲律賓蛤仔肽，獲得了一個10肽。牛瑞等[39]利用RP-HPLC對經過超濾、凝膠過濾層析、陰離子交換層析分離后得到的鱈魚蛋白水解物進行純化，得到高純度的鱈魚多肽。RP-HPLC也用于多肽結構鑒定。任嬌艷等[40]酶解制備柴魚蛋白肽，用基質輔助激光解吸電離飛行時間串聯質譜法(matrix-associated laser dissociation/ionization time of flight massspectrometry，MALDI-TOF-MS)和RP-HPLC對分離組分進行結構鑒定。

4 結構鑒定技術

目前，質譜分析技術(MS)是生物活性肽的氨基酸序列測定的主要手段。它通過測定樣品粒子的質荷比來進行成分分析和結構鑒定。可用于蛋白質的表征和測序。在整個電離過程中，軟電離使待分析多肽分子的內部能量保持在較低狀態，確保了分子骨架結構的完整性。分析多肽結構常用的質譜方法主要有3種，分別是快速原子轟擊質譜(continuous flow-fast atom bombardment，FAB-MS)、電噴霧質譜(electrospray ionization massspectrometry，ESI-MS)以及MALDI-TOF-MS。

4.1 快速原子轟擊質譜技術

快原子轟擊利用一束惰性原子快速射擊存在于液態基質中樣品而使樣品電離，得到的樣品離子濺出進入質譜分析器，通過分析分子質量信息的準分子離子峰和化合物結構信息的碎片峰，可獲知待測目標物的分子質量和結構信息。該技術可測定N端有封閉基團的多肽氨基酸序列[41]。

4.2 電噴霧質譜技術

電噴霧質譜采用的是電噴霧源的離子源，通過測定樣品組分的質量電荷比，檢測樣品組分的分子質量。由于它采用的是電噴霧源離子源，一定電壓條件下不會導致樣品分子產生碎片。在測定過程中樣品以溶液的形式導入，因此ESI-MS可以與具有高分離效能的RP-HPLC聯用，可以在線檢測出HPLC上分離出的每一個肽段的分子質量，擴大了質譜在蛋白質和肽領域中的應用[42]。CHI等[43]采用蛋白/多肽測序儀和ESI-MS分析鑒定了從血蚶中得到的兩個免疫調節肽的氨基酸序列，分別為Trp-Pro-Pro和Gln-Pro。XU等[34]使用ESI-MS測定最終純化肽的分子質量，用N-末端氨基酸測序法確定中華小公魚免疫調節肽的氨基酸序列為Tyr-Val-Met-Arg-Phe，分子質量為715.4 Da。

4.3 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術

MALDI-TOF-MS是最常用的多肽質譜鑒定方法。其工作原理是利用激光作用于樣品與一種化學基質(含在特定波長下吸光的發光基團)形成的混合物，混合物吸收光子而被激活，變成氣態，由于多肽吸收單一光子，故而攜帶單一電荷，然后形成的離子直接進入質量分析儀，基于質量/電荷與飛行時間形成質譜圖。在準確測定樣品分子質量的同時還可測定其序列結構[44]。AHN等[45]利用飛行時間液相色譜/串聯質譜對鮭魚胸鰭副產物胃蛋白酶水解的抗炎肽進行了鑒定，鑒定結果為一個三肽。為便于理解及參考應用，將分離純化技術與質譜鑒定技術進行整理歸納，如圖1所示。

5 構效關系

多肽的生物活性與其分子質量，氨基酸組成及構象有著密切聯系。小分子質量組分比大分子質量組分往往表現出更高的活性。根據已有海洋生物免疫活性肽的結構研究總結見表2。分析發現免疫調節肽多為含2～5氨基酸的短肽，分子大小通常<1 000 Da，可能是由于小分子的肽更利于機體吸收利用。據報道Val、Leu、Pro、Phe和其他疏水性氨基酸，以及Glu和Tyr負電荷氨基酸是免疫調節肽的常見殘基，對其免疫調節活性非常重要。此外有研究表明，免疫調節肽通過與靶細胞表面上的特異性受體結合來調節先天性和適應性免疫應答，帶有正電荷的較長疏水性肽具有更大的刺激小鼠脾細胞增殖的潛力。

6 展望

隨著地球人口的增多與遷移、氣候的變化，陸地資源日益匱乏，人類迫切需要開發海洋資源。目前，人們已從很多海洋生物的機體中，如海洋藻類、海洋甲殼類、海洋無脊椎動物，提取到多種具有增強免疫功能的多糖類物質(孔石莼多糖、甲殼多糖、海參多糖等)。此外，來自海洋魚類(鱈魚、鮭魚、沙丁魚等)、貝類(青蛤、牡蠣、扇貝及貽貝等)、節肢動物(南極磷蝦、蟹等)以及海洋藻類(如螺旋藻、馬尾藻)等的一些活性肽也是機體重要的免疫活性物質。雖然海洋生物資源眾多，但如何對其進行更高效率的提取和分離純化，是研究活性肽潛在價值的關鍵。海洋多肽的免疫作用有待更多的發掘。相信隨著酶工程、基因工程、分離純化技術的不斷提改進和提升，海洋源活性物質及其衍生產品作為天然免疫調節劑的研究將更加完善，并且應用于新藥物和保健食品的研發。

圖1 免疫調節活性肽研究中常用分離純化及結構鑒定技術Fig.1 Isolation, purification and structural identification of immunoregulatory peptides

表2 海洋生物免疫活性肽Table 2 Marine biological Immunomodulating peptide