基于“藥輔合一”的艾葉油乳膏的研制及藥效研究

許蕊蕊，陳金素，李越，王秀麗*

1.北京中醫藥大學，北京 102488；2.云南省中醫醫院，云南 昆明 650021

艾葉為菊科植物艾Artemisia argyiLevl.Et Vant.的干燥葉，入藥始載于《名醫別錄》，其提取物艾葉油具有抗炎、止癢、抑菌、增強機體免疫力等作用[1]。通過檢索相關文獻發現，以艾葉油為主要藥用物質的制劑主要有艾葉油乳-水凝膠貼膏劑、艾葉油微乳劑、艾葉油微膠囊和艾葉油驅蚊乳液等，其常用于抑菌織物制造和驅蚊[2-5]。由此可見，在艾葉油乳膏的處方優化及藥效評價研究領域存在一定的空白。

鑒于揮發油的促透特性及艾葉油的抑菌作用，本研究在“藥輔合一”理論指導下，嘗試制備艾葉油乳膏。艾葉油在乳膏中既發揮了抗炎、止癢的藥效作用，也充當了油相、抑菌劑、促透劑等輔料角色，替代或減少了化學輔料的應用，實現了加工與應用的經濟性與安全性，實現了艾葉油“藥之為輔，輔之為藥”的藥輔價值，拓展了艾葉油的應用范圍，也為臨床新型制劑的開發提供了參考。

1 材料

1.1 儀器

FA1204B 型分析天平（上海精密儀器儀表有限公司）；3-18N 型臺式高速離心機（湖南恒諾儀器設備有限公司）；BDS260 型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；BCD-182KZ50 型電冰箱（TCL 家用電器有限公司）；Captair Bio 321 Smart 型超凈臺（法國Erlab公司）；HDM-型電子調溫電熱套（常州榮華儀器制造有限公司）；101-1AB 型電熱鼓風干燥箱（天津賽得利斯實驗儀器分析制造廠）；揮發油提取器（河南九和共創儀器有限公司）；打孔器（上海遠卓文教用品有限公司）；SP60 型X-rite 色差儀（愛色麗色彩儀器商貿有限公司）。

1.2 試藥

艾葉飲片購于安國中藥材市場，經北京中醫藥大學廖艷副教授鑒定為正品，符合《中華人民共和國藥典》2020年版相關項下的要求。

硬脂酸（上海麥克林生化科技有限公司，批號：CG10070082）；單硬脂酸甘油酯（北京華威銳科化工有限公司，批號：C10286479）；甘油（北京化學試劑公司，批號：000619）；十二烷基硫酸鈉（廣東省精細化學品工程技術研究開發中心，批號：1202021）；二甲苯（重慶川東化工集團有限公司，批號：20091020）；中鏈甘油三酸酯、月桂氮?酮、右旋糖酐（上海源葉生物科技有限公司，批號分別為Y19J12C137892、Z13J10Y93008、S14098）；復方醋酸地塞米松乳膏、糠酸莫米松乳膏（廣州白云山醫藥集團股份有限公司白云山何濟公制藥廠）；冰片（上海邁瑞爾化學技術有限公司，批號：76747220）；金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌（北京北納創聯生物技術研究院，批號分別為17121207、19089037）；肉湯培養基（北京奧博星生物技術有限責任公司，批號：20190612）；無水乙醇（分析純）；去離子水實驗室自制。

1.3 實驗動物

SPF 級昆明種小鼠100 只，雌雄各半，體質量18～22 g，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0002，購于北京斯貝福實驗動物科技有限公司，經過北京中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（BUCM-4-2019091004-3105），飼養于北京中醫藥大學動物房。

2 方法

2.1 艾葉油乳膏的制備方法

2.1.1艾葉油的提取 采用水蒸氣蒸餾法提取艾葉油[6]：取干艾葉一定量，置于硬質圓底燒瓶中，加蒸餾水10倍量，用玻璃棒將其混合均勻，浸泡2 h。安裝揮發油提取器和冷凝管，回流提取6 h，收集艾葉油。

2.1.2Box-Behnken響應面法優選艾葉油乳膏基質處方

2.1.2.1 試驗設計 根據參考文獻[7]和預試驗確定用量范圍，利用Design-Expert V8.0.6.1軟件進行星點設計[8]，選擇艾葉油用量（A）、單硬脂酸用量（B）、十二烷基硫酸鈉用量（C）為考察因素，每個因素選取高、中、低3個水平，設計因素水平見表1。

表1 艾葉油乳膏基質處方篩選星點試驗因素水平

2.1.2.2 考察指標及評價方法 根據參考文獻[9]和預試驗情況反饋，確定評價方法和標準：1）光澤度。取樣品適量，目檢外觀顏色是否一致、是否有光澤。2）均勻度。取樣品適量，目檢外觀是否有明顯顆粒，膏體是否均勻細膩。3）涂布延展性。取樣品適量，在濾紙上小心涂布，觀察其均勻涂布過程中是否產生顆粒，記錄結果并評分。4）離心穩定性。取艾葉油乳膏適量，于2 mL的離心管中，4000 r·min-1離心15 min（離心半徑為5 cm），觀察是否發生分層、變色等油水分離現象，記錄結果并評分。5）耐寒性。取艾葉油乳膏適量于2 mL的離心管中于-20 ℃放置24 h，取出放至室溫，觀察實驗樣品是否發生分層、變色等油水分離現象，記錄結果并評分。6）耐熱性。取艾葉油乳膏適量于2 mL的離心管中，密封，于50 ℃電熱鼓風干燥箱中，恒溫保持6 h，觀察上述實驗樣品是否發生分層、變色等油水分離現象，記錄結果并評分。

評分處理[10]：光澤度、均勻度、涂布延展性、離心穩定性、耐熱穩定性、耐寒穩定性各占16.67%，共100分，具體評分標準見表2～3。

表2 艾葉油乳膏基質表觀評價標準

表3 艾葉油乳膏基質穩定性評價標準

2.1.2.3 驗證實驗 根據最佳處方平行制備3 份樣品，得到基質為黃色、表面光澤、均勻、細膩的半固體。采用X-rite 色差儀測量3批艾葉油乳膏的視感明度（L*）、色相（a*）、彩度（b*）值，差異無統計學意義。L*值為0～100，L*值大者接近白色，小者接近黑色。

2.2 藥效學實驗

2.2.1二甲苯致小鼠耳腫脹實驗 取小鼠50只，雌雄各半，隨機分為低、中、高劑量藥物組，陽性對照組及空白乳膏組5組，每組10只。低、中、高劑量藥物組分別在小鼠右耳耳廓均勻涂抹艾葉油乳膏0.5、1.0、2.0 g·kg-1，陽性對照組在小鼠右耳耳廓均勻涂抹復方醋酸地塞米松乳膏1.0 g·kg-1，空白乳膏組在小鼠右耳耳廓均勻涂抹空白乳膏（將無藥效作用的中鏈甘油三酸酯代替處方中的艾葉油，按同樣方法即可制得空白乳膏）1.0 g·kg-1，每天3次，連續3 d，每次給藥前，先用0.9%氯化鈉溶液清洗給藥處，待皮膚干燥后給藥。第4 天涂藥1 h 后，對各組小鼠右耳給予二甲苯0.05 mL 致炎，1 h 后將小鼠頸椎脫臼處死，剪下雙耳，用直徑為8 mm打孔器將雙耳相同部位打下圓耳片，稱質量，以左耳為對照，左右耳片質量差為腫脹度，計算各組腫脹度，按公式（1）計算腫脹抑制率。

2.2.2右旋糖酐致小鼠瘙癢實驗 取小鼠50 只，雌雄各半，隨機分為低、中、高劑量藥物組，陽性對照組及空白乳膏組5 組，每組10 只。低、中、高劑量藥物組分別在小鼠左后足均勻涂抹艾葉油乳膏0.50、0.75、1.00 g·cm-2，保持30 min；陽性對照組在小鼠左后足均勻涂抹糠酸莫米松乳膏0.50 g·cm-2；空白乳膏組在小鼠左后足均勻涂抹空白乳膏0.50 g·cm-2。30 min 后用0.9%氯化鈉溶液將藥物洗凈，在小鼠左后足腳墊內注射右旋糖酐0.2 mL，自小鼠開始舔后足作為瘙癢指征，觀察并記錄10、15 min 內小鼠舔后足次數[11-12]。

2.3 統計學處理

采用SPSS 16.0軟件對數據進行統計分析。實驗數據均以（）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果與討論

3.1 處方優化實驗結果

3.1.1Box-Behnken 響應面法優選處方試驗設計及其結果 Box-Behnken響應面法優選處方試驗設計結果見表4。

表4 艾葉油乳膏基質處方星點試驗設計與評分結果

3.1.2模型擬合 采用Design-Expert V8.0.6.1 對數據進行分析，以綜合評分對各因素進行模型擬合，并通過相關系數（r）等對擬合模型進行評價，得到二次多項式回歸方程Y=97.60-1.12A-2.87B-0.50C+5.25AB-1.50AC-16.68A2-18.18B2-21.92C2，方差分析見表5。由此可知，r=0.996 4，P＜0.01，F值為19.90，表明模型具有極顯著差異性；失擬項P=0.007 0＜0.001，失擬項極顯著，說明該模型擬合度和可信度均有效，實驗誤差小，可以用此模型對該處方進行分析和預測。

表5 艾葉油乳膏多元回歸模型方差分析

3.1.3響應面優化分析 根據擬合方程，通過Design-Expert V8.0.6.1 軟件繪制評價指標隨因素變化的等高線圖和響應面圖（圖1～3）。

由圖1～3可以看出，艾葉油、單硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸鈉的用量對綜合評分均成拋物線形，即隨著因素的增大，綜合評分呈先增大后降低的趨勢，因此，在提取工藝中適當提高三者比例可以提高綜合評分。根據回歸模型分析且考慮實際操作的可行性，艾葉油乳膏最優處方為艾葉油2.00 g，單硬脂酸甘油酯0.75 g，十二烷基硫酸鈉0.30 g。

圖1 艾葉油用量和單硬脂酸甘油酯用量對綜合評分的影響

3.2 艾葉油乳膏的制備方法

將硬脂酸1.65 g、單硬脂酸甘油酯0.75 g、艾葉油2.00 g、月桂氮?酮0.13 g和適量冰片放置于容器內，水浴加熱至熔化，繼續加熱至70～80 ℃；另取處方量十二烷基硫酸鈉、甘油和適量蒸餾水（加至乳膏總量10 g），加熱至70～80 ℃，緩緩倒入硬脂酸等油相中，邊加邊攪拌，至乳化完全，放冷即得。

3.3 色差儀檢測結果

制得的3批艾葉油乳膏色差儀檢測結果見表6。由表6可知，利用色差儀測得的3批艾葉油乳膏的L*、a*、b*值差異無統計學意義，表明3批艾葉油乳膏色澤均勻。

表6 3批艾葉油乳膏的色差儀檢測結果

圖2 艾葉油用量和十二烷基硫酸鈉用量對綜合評分的影響

圖3 單硬脂酸甘油酯用量和十二烷基硫酸鈉用量對綜合評分的影響

3.4 艾葉油乳膏對二甲苯致炎反應的影響

結果表明，空白乳膏組小鼠耳廓腫脹度為11.62 mg，低、中、高劑量藥物組小鼠耳廓腫脹度分別為9.35、7.79、6.80 mg，與空白乳膏組比較，低、中、高劑量藥物組及陽性對照組小鼠耳廓腫脹度均明顯減輕，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），且艾葉油乳膏高劑量抗小鼠耳廓腫脹的效果優于陽性對照組，各給藥組抑制二甲苯致小鼠耳廓腫脹的能力為高劑量組＞陽性對照組＞中劑量組＞低劑量組，表明艾葉油乳膏能明顯抑制二甲苯所致的小鼠耳廓炎癥，提示艾葉油乳膏具有抗炎的作用，結果見表7。

表7 艾葉油乳膏對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響（,n=10）

表7 艾葉油乳膏對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響（,n=10）

注：與空白乳膏組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；表8同。

3.5 艾葉油乳膏對右旋糖酐致小鼠瘙癢反應的影響

由表8 可知，右旋糖酐致小鼠瘙癢后，空白乳膏組小鼠10、15 min 時瘙癢次數分別可達12、14次，而各給藥組小鼠的瘙癢次數明顯減少，與空白乳膏組相比差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。說明艾葉油乳膏可顯著改善右旋糖酐導致的小鼠瘙癢，且隨給藥劑量的增大，抗瘙癢效果更趨明顯，提示艾葉油乳膏具有止癢的作用，具體結果見表8。

表8 艾葉油乳膏對右旋糖酐所致小鼠瘙癢次數的影響（,n=10）

表8 艾葉油乳膏對右旋糖酐所致小鼠瘙癢次數的影響（,n=10）

4 討論

4.1 艾葉油乳膏的抗炎作用

現有研究表明，艾葉油可以有效降低白細胞介素-6（IL-6）、IL-1β和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）炎癥因子的表達和分泌[13]。因此，艾葉油可以作為治療炎癥疾病的有效藥物。本研究選取了二甲苯致炎作為急性炎癥模型，其容易復制、重現性好、操作簡便，是一種常見的科學可靠的實驗動物模型。實驗結果顯示，與空白乳膏組相比，艾葉油乳膏低、中、高劑量,對二甲苯所致耳腫脹急性炎癥模型小鼠的耳腫脹均有顯著的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01）。相較于李波[14]的實驗結果，本實驗中高劑量艾葉油乳膏組的抗炎作用強于其艾葉油稀釋液高劑量組。相較于熊瑩[2]的實驗結果，本實驗中高劑量艾葉油乳膏組的抗炎作用略弱于其艾葉油高劑量組，可能是由于乳膏基質阻擋了艾葉油與小鼠皮膚的接觸。

4.2 艾葉油乳膏的止癢作用

瘙癢是一種僅有皮膚瘙癢而無原發性皮膚損害的皮膚病癥狀。目前，瘙癢模型的制備方法主要有直接使用特定種系動物法、炎癥介質刺激法、化學物質刺激法等，其中較為常用的主要是炎癥介質刺激法和化學物質刺激法[15]。本研究選取的是右旋糖酐致小鼠瘙癢模型，該模型重現方法簡便易行，不會引起其他繼發反應，且癥狀與臨床接近。瘙癢次數可直觀反映瘙癢情況，也可直接證明艾葉油乳膏的藥效作用。實驗結果顯示，艾葉油乳膏低、中、高劑量均可顯著減少右旋糖酐致小鼠的瘙癢次數（P＜0.05，P＜0.01），且高劑量組與陽性對照組差別不大，說明艾葉油乳膏外用治療瘙癢有較明顯的作用。

4.3 艾葉油乳膏“藥輔合一”特性的體現

本研究每組實驗均設置了空白乳膏組，通過觀察含/不含艾葉油的乳膏對小鼠的消炎止癢作用，從而初步判斷該乳膏中艾葉油除輔助制劑成型外，是否具有一定的藥效作用。結果表明，和空白乳膏組相比，各給藥組均能顯著發揮抗炎、止癢的藥效作用，表明艾葉油不僅可以作為艾葉油乳膏的主要成型輔料，自身也具有較強的藥效作用。除此之外，外用制劑的透皮作用也是制備乳膏時的難點、要點，大多數外用乳膏制備時會加入一定量的化學促透劑來提高其促透性能，其實中藥中的揮發油或芳香類成分就可以促進藥物的吸收與跨膜轉運，兼有促進滲透與治療疾病的雙重特點[16]。已有研究表明，一些萜烯類的中藥揮發油可以直接破壞角質層細胞脂質屏障，影響細胞膜流動性及膜電位，通過增加皮膚活性表皮流動性來降低皮膚角質層的屏障作用，發揮促滲透效果[17]。而艾葉油的主要化學成分為單萜、倍半萜、烯類和黃酮類等，因此推測其促透作用機制同上[18]。不僅如此，活血化瘀和芳香開竅類的中藥也能提高皮膚細胞的通透性、刺激皮膚腺體開口增大、改善微循環及機體血流動力學[19]，而艾葉作為此類中藥的代表藥，理論上也可通過該途徑促進藥物滲透吸收。

5 結論

綜上所述，艾葉油乳膏的成型工藝及藥效評價證實了本課題組所構思的輔料不僅起成型促透作用，同時也起到一定藥效作用，證明了“藥輔合一”思路的可行性及開發新型輔料的重要性。