基于形性與化學指標關聯分析的當歸揮發油質量評價和當歸產地鑒別△

程亞茹，石秀佳，龔燚婷，楊麗，李宇，董玲*，陳建波*

1.北京中醫藥大學 生命科學學院，北京 100029；2.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 100029

當歸是傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels 的干燥根，具有補血活血、調經止痛、潤腸通便的作用[1]。揮發油被認為是當歸的主要活性物質群組之一，《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版規定其質量分數不得低于0.4%[1]。當歸揮發油的組成復雜，文獻報道其含有苯酞類、烯烴類、酚類等多種成分，以藁本內酯、丁烯基苯酞和正丁基苯酞等成分的含量較高[2-4]。現代研究表明，當歸揮發油具有活血、解痙、抗炎鎮痛等多種藥理活性。因此，揮發油是當歸質量評價的重要指標之一。

氣味和顏色鑒別是傳統中藥鑒別的要點，與藥材的質量密切相關，對藥材的真偽鑒別、產地鑒別和臨床應用等具有一定的指導意義[5-6]。氣味和顏色也是評價當歸質量的重要形性指標，《本草綱目》中記載“色紫氣香”的當歸質量優良[7]，《中國藥典》2020 年版描述為“表面淺棕色至棕褐色……有濃郁的香氣”[1]。本課題組前期提出建立基于“形性-化學-生物”指標的綜合質量指標體系[8]，現代藥效物質基礎研究闡述了化學成分與藥效之間的關聯性[9-10]。“辨狀論質”是通過形性指標評判藥材品質的規律總結，但其中的科學內涵尚未闡釋清楚[11]，缺乏形性指標與化學指標的相關性研究。故本研究對當歸顏色指標、氣味指標和揮發油中14 個成分含量進行關聯性分析，為通過形性指標分析揮發油化學指標特點及通過綜合指標鑒定當歸產地提供參考。

1 材料

1.1 儀器

CM-5型分光測色儀（日本柯尼卡美能達公司）；α-FOX3000 型氣味指紋分析儀（法國Alpha M.O.S公司）；7890B 型氣相色譜儀（美國Agilent 公司）；CPA225D型電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

對照品藁本內酯（批號：DST200610-007，純度≥98%，成都樂美天醫藥科技有限公司）；丁烯基苯酞（批號：Y05S9W67682，純度≥98%）、正丁基苯酞（批號：S09J9D65229，純度≥98%）均購于上海源葉生物科技有限公司；蒎烯（批號：RH121566，純度≥98%，上海易恩化學技術有限公司）；甲醇（分析級，北京市通廣精細化工公司）。

收集不同產地當歸藥材38批，其中甘肅產16批、云南產10 批、青海產6 批、四川產6 批，經中國中藥協會首席科學家張世臣教授鑒定為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，具體信息見表1。

表1 當歸藥材信息

2 方法

2.1 當歸色度測定

CM-5 型分光測色儀的光源設置為D65，視場選擇10°視角，測量波長為380～780 nm，每次開機用黑板和白板對儀器進行校正、調零后進行樣品測定。當歸粉末取適量于測色皿內，高度約0.5 mm，以測色時不透過光源為準，測定并記錄顏色指標L*、a*、b*值，每個樣品平行測定3份。

2.2 電子鼻測定

各批當歸藥材樣品隨機取樣，粉碎過二號篩，稱取0.3 g裝入10 mL 頂空進樣瓶，壓蓋密封。電子鼻頂空溫度為45 ℃；頂空時間為600 s；振蕩速度為250 r·min-1；進樣針溫度為55 ℃；進樣體積為1000 μL；流速為150 mL·min-1；采集時間為120 s；采集間隔為1 s；延滯時間為600 s。每個樣品平行測定3次。

2.3 當歸揮發油氣相色譜測定

2.3.1色譜條件 色譜柱為HP-5（30 m×250 μm，0.25 μm）；載氣為N2；流速為1.0 mL·min-1，恒定流量；進樣量為2 μL，不分流進樣；初始溫度為70 ℃，以5 ℃·min-1升溫至130 ℃，保持5 min，以0.1 ℃·min-1升溫至133 ℃，保持2 min，以10 ℃·min-1升溫至230 ℃，保持5 min；后運行以230 ℃運行3 min；進樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度為280 ℃。

2.3.2供試品溶液的制備 取當歸藥材粉末約100 g，稱定質量（準確至0.01 g），置燒瓶中，加10 倍量水，振搖混合后，連接揮發油測定器與回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充滿揮發油測定器的刻度部分，并溢流入燒瓶時為止。置電熱套中緩緩加熱至沸，并保持微沸約5 h，停止加熱，靜置，計算揮發油提取率，收集提取的當歸揮發油儲存于-20 ℃冰箱中，備用。

2.3.3對照品溶液的制備 取藁本內酯、正丁基苯酞、丁烯基苯酞和蒎烯對照品適量，精密稱定，置量瓶中，加甲醇配制成一定質量濃度的溶液，即得。

2.3.4方法學考察 任意選取1 批當歸揮發油樣品，按2.3.2 項下方法制備供試品溶液進行檢測，按照2.3.1項下氣相色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖，考察儀器的精密度；分別于0、2、4、8、12、24 h 時進樣檢測，考察供試品溶液的穩定性；同時制備6 份供試品溶液，連續進樣，考察供試品溶液的重復性。計算各成分相對含量的RSD。

2.3.5樣品測定 取當歸揮發油（水蒸氣蒸餾提取）約10 mg，精密稱定，置量瓶中，加甲醇溶解制成5 mg·mL-1的溶液，搖勻，取溶液續濾液，注入氣相色譜儀進行測定。以相對峰面積與揮發油提取率的乘積表征當歸藥材中各成分的相對含量。

3 結果與討論

3.1 當歸的特征顏色指標與產地差異

各批次當歸樣品顏色指標（L*、a*、b*）測定結果如表2 所示，將其導入JMP 10 軟件進行主成分分析（PCA），得到特征顏色指標載荷圖（圖1）和PCA 圖（圖2）。主成分1（PC1）的方差貢獻率為61.1%，PC2 的方差貢獻率為36.9%，累積方差貢獻率為98.0%，表明PC1和PC2可以解釋說明98.0%的原始顏色信息，故以PC1 和PC2 進行載荷圖和PCA 得分圖分析。對載荷圖中不同指標進行相關性分析可知，L*和a*指標間具有較強的負相關，a*與b*指標間呈正相關，L*和b*指標間相關性較弱。

表2 當歸樣品色度測定結果（n=3）

圖1 當歸顏色指標載荷圖

由PCA 得分圖（圖2）可知，不同產地當歸樣品可根據顏色指標進行明顯區分。其中云南產樣品的PC1 得分值較小，說明L*值較大，表明云南當歸顏色較其他3 個產地樣品淺；甘肅產樣品與四川、青海2個產地樣品相比，PC2得分值較大，表明b*值較大，顏色偏黃；四川和青海產樣品的顏色差異體現在PC1 得分，青海樣品的a*值較大。中藥材的顏色受品種、產地、采收時間、炮制和貯藏等因素影響[12]，云南緯度較低，氣候較甘肅溫暖濕潤，沾益區種植當歸的土壤為紅壤而非甘肅和四川的灰棕壤或黃壤，并且常采用直播1 年生的方式栽培當歸以縮短生長周期[13-15]，同時當歸顏色與藁本內酯、阿魏酸、多糖等成分含量具有一定的相關性[16-17]，故推測云南當歸顏色偏淺與其氣候、土壤、種植方式、化學成分等因素有關。

圖2 當歸顏色指標主成分得分

3.2 當歸的特征氣味指標與產地差異

38批當歸樣品根據產地信息進行分組后，將12個傳感器的最大響應值繪制雷達圖（圖3）。由圖3 可知，不同產地當歸樣品的氣味在各傳感器上均有一定的差異，且以傳感器LY2/G、LY2/AA、LY2/Gh、LY2/gCTl 的檢測值差異顯著；云南產地樣品各傳感器的響應值絕對值均高于其他產地，表明其氣味強于其他產地的當歸樣品；其余3 個產地樣品氣味差異則不明顯。

圖3 當歸樣品的氣味雷達圖

將電子鼻12個傳感器的最大響應值導入JMP 10軟件進行PCA，計算得到各主成分的方差貢獻率，氣味指標載荷圖（圖4）中顯示，PC1和PC2的累積方差貢獻率為99.52%，足以反映當歸的氣味信息。12 個傳感器指標明顯被分為3 類：第1 類為LY2/G、LY2/AA、LY2/Gh、LY2/gCTl和LY2/gCT；第2類為T30/1、P10/1、P10/2、P40/1、T70/2 和PA/2；第3類為LY2/LG。第1類傳感器響應值與第2、3類傳感器響應值具有顯著的負相關；第2類和第3類傳感器響應值之間具有較強的正相關；同類型指標在載荷圖中基本重疊，表明其有顯著的正相關。第1 類傳感器（LY2 型）對氨氣/有機胺類、一氧化碳、乙醇、硫化氫和丙烷/丁烷等較為敏感；第2 類傳感器（P/T 型）對有機溶劑、烴類、甲烷、氟、乙醇、氨氣/有機胺類和芳香族化合物較為敏感；第3 類傳感器對氧化氣體敏感。氣味物質基礎相關研究表明，部分LY2 型傳感器與烯烴類、酮類成分具有相關性[18]，某些酯類化合物（乙酸丁香酚酯、癸酸乙酯等）與P/T 型傳感器的相關性強于LY2 型傳感器[19]，烯烴類、酯類和醇類等化合物是氣味的重要物質基礎[20-21]。對當歸揮發油化學指標與電子鼻結果進行關聯分析，以探究當歸氣味的物質基礎。參考文獻[22]方法，在3 類指標中分別選取傳感器LY2/gCTl、P10/1和LY2/LG為代表以簡化后續分析。

圖4 當歸樣品的氣味指標載荷圖

由氣味指標PC1 和PC2 所構成的PCA 得分圖（圖5）可明顯將云南樣品與其他產地樣品進行分離，青海、四川和甘肅的當歸樣品在氣味信息上具有一定的區分度，但是不能明顯分離。云南樣品PC1 得分值較大，表明第2 類和第3 類傳感器的響應值較大，與圖3 結果相符；青海樣品與甘肅樣品具有較好的分離度，但與部分四川樣品重合；四川與甘肅樣品在得分圖中相對聚集，表明氣味特征較為相似。

圖5 當歸樣品的氣味指標PCA得分

3.3 當歸的揮發油化學指標與產地差異

3.3.1共有化合物指認 當歸揮發油氣相色譜圖中根據tR共篩選出14 個共有化合物（圖6），通過前期研究基礎、對照品比對和查閱文獻[23]，對共有化合物進行指認，結果見表3。

表3 當歸揮發油共有化合物指認

圖6 不同產地當歸揮發油GC圖

3.3.2當歸揮發油化學指標相關性及產地差異 精密度試驗結果表明，各成分保留時間和相對峰面積的RSD 分別小于0.1%和3.5%，儀器精密度良好；穩定性試驗結果表明，在24 h 內，各成分保留時間和相對峰面積的RSD 分別小于0.2%和4.5%，供試品溶液穩定性良好；重復性試驗結果表明，各成分保留時間和相對峰面積的RSD 分別小于0.1%和5.2%，試驗重復性良好。

將當歸揮發油中各化學成分含量導入JMP 10 軟件進行分析，各成分在載荷圖（圖7）中聚集為2類，即第1 類為烯烴類成分包括C1～C8；第2 類為苯酞類成分包括C9～C14。由圖7 可知，第1 類化學成分與第2類化學成分之間相關性較弱；但是同類型指標在圖7 中聚集，表明其正相關關系顯著。參考文獻[22]方法并考慮化合物的含量，后續分析中選取C2和C11代表揮發油類化學成分指標。圖7中顯示，PC1和PC2的累積方差貢獻率為76.0%，可提取當歸揮發油化學指標的大部分有效信息。

圖7 當歸揮發油化學指標載荷圖

PC1 和PC2 得分構成的PCA 得分圖（圖8）顯示，4個產地樣品可分為3類，其中云南樣品與其他產地當歸樣品之間界限清晰，PC1 得分較高，表明云南樣品中第1 類成分的含量較高；青海樣品與甘肅、四川當歸樣品可基本分離，PC2 得分較低，表明第2 類成分的含量較低；甘肅、四川當歸樣品的PC1得分較低，PC2得分較高，表明2個產地的當歸樣品第1類成分含量較低，第2類成分含量較高。

圖8 當歸揮發油化學指標PCA得分

3.4 當歸顏色、氣味指標與揮發油化學指標關聯性分析

將篩選得到的顏色特征（L*、a*、b*）、氣味特征（LY2/gCTl、P10/1和LY2/LG）和化學指標（C2、C11）數據導入JMP 10軟件進行PCA和相關性分析，研究不同指標間的關聯性及整體指標對產地的區分效果。

由圖9可知，指標L*、LY2/LG、P10/1和C2之間有明顯的正相關，與a*、LY2/gCTl 指標具有明顯的負相關；C11與P10/1 具有正相關，與a*、b*2 個顏色指標具有負相關，與其他指標相關性較弱；b*與a*具有正相關，與C11、P10/1具有負相關，與其他指標相關性較弱。綜合指標的PCA 得分圖（圖10）中顯示，不同產地的當歸樣品明顯區分。其中甘肅樣品較分散，位于得分圖左上區域的樣品a*、b*、LY2/gCTl的檢測值較高，位于Y軸負值附近樣品的C11含量較高；云南樣品的PC1 得分值較高，表明其L*、LY2/LG、P10/1和C2等指標的檢測值較高；青海樣品PC1得分較低，表明其a*、LY2/gCTl指標的檢測值較高；四川樣品PC2得分較低，表明其C11含量較高。

圖9 當歸顏色、氣味指標與揮發油化學指標載荷圖

圖10 當歸顏色、氣味指標與揮發油化學指標PCA得分

運用JMP 10 軟件進行顏色、氣味和化學成分之間的關聯性分析，計算不同指標之間的Spearman 相關系數（ρ），見表4。結果表明，C2與LY2/LG、P10/1、L*指標呈顯著正相關，與LY2/gCTl、a*指標呈顯著負相關，與b*無顯著相關性；C11與P10/1 呈正相關，與a*指標呈負相關，與其他指標無顯著相關性；氣味特征LY2/LG、P10/1 與顏色特征L*呈正相關，與a*呈負相關；氣味特征LY2/gCTl與L*呈顯著負相關，與a*呈正相關。由于其中LY2/gCTl 傳感器的感應值為負值，其信號越強，感應值越小，所以C2與C11所代表的2 類成分與氣味特征強弱均為正相關，即揮發油類成分的含量越高，其氣味特征越強。其中C2與氣味特征的相關系數高于C11，故推測當歸藥材氣味特征的物質基礎可能主要為烯烴類成分。C11所代表的苯酞類化合物僅與氣味傳感器P10/1所代表的第2類傳感器具有顯著正相關。

表4 當歸顏色、氣味指標與揮發油化學指標之間的關聯性分析

對不同產地8 個特征指標進行分析（圖11）可知，L*、LY2/LG、P10/1、C2在不同產地之間變化趨勢相一致，呈正相關，與a*、LY2/gCTl 變化趨勢相反，呈負相關，其他指標b*、C11變化趨勢無明顯一致性，相關性較弱，與關聯性分析結果基本一致。在產地差異方面，甘肅樣品的顏色指標b*最高；云南樣品的顏色指標L*，氣味指標LY2/LG、P10/1，化學指標C2等測定值最高；青海樣品的顏色指標a*、氣味指標LY2/gCTl 的測定值最高；四川樣品C11的含量較高，與前期PCA結果基本一致。

圖11 不同產地當歸特征指標差異性分析

4 小結

傳統性狀和化學指標是評價中藥質量的重要指標，中藥的顏色與氣味是傳統性狀中的關鍵指標，與中藥化學成分具有顯著關聯性。柴沖沖等[24]研究發現，黃芩中黃芩苷與漢黃芩苷含量與L*、b*，E*呈顯著正相關，與a*呈顯著負相關；黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A則呈現相反規律；肉豆蔻中萜烯類、醇類和酯類化合物的改變導致其氣味發生顯著的變化[25]。對于當歸而言，當歸的顏色與阿魏酸、藁本內酯和多糖等具有顯著相關性[16-17]；Zheng 等[26]研究表明，當歸的成分和氣味之間具有一定的關聯性。李澤仟等[27]則認為6-十一酮、藁本內酯、丁烯基苯酞等化合物為當歸的主要氣味物質基礎。本研究通過PCA 和相關性分析，進一步研究顏色、氣味和揮發油成分指標之間的相關性。研究結果表明，當歸氣味傳感器的響應值越強，顏色越淺，當歸藥材中烯烴類和苯酞類成分的含量越高；其中烯烴類成分與氣味的相關性強于苯酞類成分，故推測當歸藥材氣味特征的物質基礎可能主要為烯烴類成分。

道地藥材作為我國優質中藥材的代表，其質量優劣與臨床藥效密切相關，因此對道地藥材和非道地藥材的鑒別至關重要[28]。現有研究表明，不同產地的當歸樣品在外觀性狀[29]、顏色[16]、氣味[30]、化學成分[31]等方面均具有一定的差異，可根據其外在性狀和內在成分區分產地。本研究PCA 結果顯示，云南樣品與其他3 個產地差異顯著；青海樣品基本可與甘肅、四川樣品分離；甘肅和四川樣品較為相似，在以顏色和綜合指標進行分析時可進行區分，建立的綜合指標鑒別產地的方法區分效果良好。

綜上所述，當歸的顏色、氣味和揮發油化學指標之間具有顯著的相關性，其顏色和氣味等形性指標可反映當歸藥材中揮發油化學指標的特點，從而判斷當歸揮發油的質量；建立的綜合指標鑒定產地的方法則可明顯區分4 個產地的當歸藥材，其區分效果優于氣味、揮發油化學成分單個指標鑒定產地的方法。本研究通過深入分析形性指標與化學指標的關聯性，將形性指標作為一種表征化學指標的簡單檢測方式，為建立簡便快捷的當歸質量評價方法提供參考。