基于ITS2條形碼的市售延胡索鑒別△

范曉玉，王亞丹，邵平，韓凌，呂重寧*，路金才*

1.沈陽藥科大學 中藥學院，遼寧 沈陽 110016；2.國家中成藥工程技術研究中心，遼寧 本溪 117004

延胡索藥材為罌粟科（Papaveraceae）植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang 的干燥根莖，其味辛、苦，性溫，具有活血、行氣、止痛的功效，用于胸脅、脘腹疼痛等證[1-2]。研究表明，延胡索通過其主要活性成分生物堿（如原阿片堿、延胡索乙素等）發揮鎮痛、抗炎、抗腫瘤等作用，臨床上應用廣泛[3-5]。

延胡索與余零子、水半夏、夏天無、齒瓣延胡索等多種藥材外形極為相似，很容易混淆[6]。以傳統鑒別方法區分延胡索與其混偽品有一定難度，因此，建立一種快速有效的延胡索鑒別方法對其臨床用藥安全至關重要。DNA 分子鑒定技術是利用基因組中一段公認標準的、相對較短的DNA 片段來進行物種鑒定的分子診斷技術[7]。內轉錄間隔區2（ITS2）最早被應用于系統發育和物種的分類研究，在藥用植物及其混偽品的鑒別中具有顯著的優勢[8-9]。已有研究將DNA 條形碼技術用于延胡索及其混偽品的鑒別，許燦新[10]對延胡索及其同屬的4種混偽品進行鑒別，以藥材新鮮塊莖為研究對象，對比了ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK4 個條形碼的鑒別能力，結果發現ITS2 序列可以較好完成延胡索及其混偽品的鑒別；王丹依等[11]也利用ITS2 序列成功鑒別了紫堇屬包括延胡索在內的6種植物。

現有研究均以延胡索的植物葉片或者新鮮塊莖為對象，而市售延胡索飲片都是經過高溫蒸煮、醋炙或醋煮等的炮制加工品，其DNA 降解嚴重，聚合酶鏈式反應（PCR）擴增困難，鑒別難度較大[12]。因此，本研究以延胡索加工品為研究對象，在文獻研究的基礎上，采用改良后的試劑盒法提取樣品DNA，選取ITS2 條形碼對市售延胡索進行真偽鑒別，以評價ITS2序列對延胡索加工品的鑒別能力。

1 材料

1.1 試藥

60 份市售延胡索飲片來自安徽中藥材市場或延胡索的主要產地浙江、陜西，樣品經沈陽藥科大學中藥學院路金才教授鑒定均為延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang 的干燥根莖，具體信息見表1。同時，從GenBank 的Nucleotide 數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）下載23 份延胡索及其混偽品序列信息，見表2。

表1 市售延胡索樣品信息

表2 從GenBank數據庫下載的延胡索及其混偽品序列信息

離心柱型植物基因組DNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]；ITS2 擴增引物、DNAMarker-D[生工生物工程（上海）股份有限公司]；EB 終結者Green 凝膠核酸染料（南京凱基生物科技發展有限公司）；2×TaqPCR Mix酶（TaKaRa公司）。

1.2 儀器

MM400型混合球磨儀（Resch公司）；Centrifuge 5810/5810 R 型高速離心機（Eppendorf 公司）；MXRL-E 標準型旋轉混勻儀[大龍興創實驗儀器（北京）有限公司]；Veriti?型梯度PCR 儀（Life Technoligies公司）；DYY-6C 型電泳儀（北京市六一儀器廠）；TOCAN-360 型全自動凝膠成像系統（上海領成生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 樣品DNA提取和PCR擴增

取75%乙醇擦洗過的干凈飲片70 mg，平均放入2 個滅菌后的2 mL 離心管中，加入滅菌鋼珠，磨碎后采用植物基因組DNA 提取試劑盒提取樣品DNA，方法參照說明書。由于藥材經過高溫炮制后DNA 降解嚴重，難以擴增出目的片段。為獲得高質量的DNA，本實驗對試劑盒法提取DNA 進行改良，除將樣品質量增加至70 mg 外，在加入提取液之前加入核分離液，以除去蛋白質及酚類物質，加速細胞膜的裂解。同時適當增加水浴時間（56 ℃，過夜），使細胞充分裂解。PCR 反應體系為25 μL，包括2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上游引物ITS2F（5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′）和下游引物ITS3R（5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′）[13]各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR擴增程序為94 ℃，5 min；94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、45 s，40 個循環；72 ℃，10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產物，將具有單一明亮目的條帶的產物送往美吉生物醫藥科技有限公司進行雙向測序。

2.2 數據處理

應用CodonCode Aligner 軟件對測序峰圖進行拼接、校對，去除引物及低質量區?；陔[馬爾可夫模型的HMMer注釋方法，去除兩端5.8S和28S區段后獲得ITS2 間隔區序列。對所得序列進行美國國家生物技術信息中心（NCBI）網站的BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）相似性捜索，找出最相似序列進行物種鑒別。利用MEGA 7.0軟件進行序列多重比對，查找變異位點，計算鳥嘌呤+胞嘧啶（G+C）占比，比對后的序列基于Kimura 2-parameter（K2P）模型構建鄰接（neighbor-joining，NJ）系統發育樹，同時NJ 系統發育樹各分支的置信度用靴帶法做1000次可信度分析。

3 結果與分析

3.1 PCR擴增結果

市售延胡索飲片共60份利用ITS2引物進行PCR擴增，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產物，結果顯示約80%（47 份）的樣品能夠擴增出明顯單一、完整的條帶（部分凝膠電泳結果見圖1）。其中擴增失敗的13 份樣品可能與其炮制加工方法有關，《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版中規定延胡索的加工過程為“置沸水中煮至恰無白心時，取出，曬干”[2]，藥材經高溫處理后往往會導致DNA嚴重降解，難以擴增出目的片段。

圖1 市售延胡索樣品ITS2序列電泳圖（1～14號樣品）

3.2 基于ITS2序列的物種鑒定

將注釋得到的47 條ITS2 序列在中藥材DNA 條形碼鑒別系統（http://www.tcmbarcode.cn/china/）和GenBank 數據庫中進行相似性搜索，完成結果鑒定。以主要單倍型C1（YH8）為例，鑒定結果顯示（圖2），數據庫中與之最匹配的物種為C.yanhusuo，序列描述顯示鑒別覆蓋率為99%，使用MEGA 6.0軟件將其與參考序列KX896711 進行比對分析，結果發現219位A-G變異，延胡索主要單倍型219位為A，數據庫中單倍型219 位為G。該結果表明，ITS2序列能夠準確鑒定市售延胡索飲片。本次實驗所得序列完全符合要求，全部鑒定為正品延胡索。

圖2 市售延胡索樣品ITS2單倍型C1（YH8）序列與參考序列比對結果

3.3 延胡索藥材ITS2序列特征分析

共得到延胡索加工品的ITS2序列47條，長度為238～242 bp，比對后長度為242 bp，C+G 平均占比為70.51%，種內變異較多，主要分布在序列的前半段，共存在17 個變異位點，分別為36、39、42、73位點C-G 變異，44、57 位點G-C 變異，46、70 位點A-G 變異，49 位點T-A 變異，52、55 位點T-A/G 變異，54、197 位點G-A 變異，74 位點T-C 變異。48、58、65 位點為簡并堿基。有2 處插入/缺失，分別為35-36、67-68 位點。利用MEGA 6.0 軟件進行比對分析，歸納為5 種主要的單倍型（C1～C5），并提交至GenBanK 數據庫，登錄號為MH260614-18，序列信息見圖3。

圖3 市售延胡索樣品ITS2序列主要單倍型（C1～C5）信息

3.4 NJ系統聚類分析

實驗中獲得的延胡索ITS2 序列種內變異較大，為進一步確認實驗結果的準確性，基于K2P 模型構建了延胡索的5 個單倍型與從GenBank 數據庫下載的23條ITS2序列的NJ系統發育樹。如圖4所示，實驗獲得的延胡索5 個主要單倍型與數據庫下載的延胡索的14 個ITS2 序列單聚為一大支，支持率為95%，而且不同種都能各聚為小枝，能較好地區分；東北延胡索單獨聚為一支，支持率為82%，此外，齒瓣延胡索與夏天無聚為一支，支持率為62%，與延胡索和東北延胡索分處不同的分支。NJ 系統發育樹表明，延胡索ITS2 序列和參考序列緊密聚合在一起，具有良好的單系性，能夠明顯區分其混偽品。

圖4 延胡索及其混偽品的NJ系統發育樹

4 討論

延胡索具有悠久的用藥歷史，臨床應用廣泛，由于地方用藥習慣及藥材價格的升高，市場上出現了以次充好、摻假等情況，《中國藥典》2020 年版僅以延胡索乙素作為單一的檢測指標，但目前延胡索的主要混偽品齒瓣延胡索、東北延胡索和夏天無也含有延胡索乙素，且東北延胡索和齒瓣延胡索均有一定的毒性[14]，因此有必要對市售延胡索飲片進行鑒定，避免藥材混用、誤用的情況。

傳統的中藥鑒別方法主要為性狀鑒別、顯微鑒別和理化鑒別，其中性狀鑒別容易受主觀因素的影響，顯微和理化鑒別需對樣品進行復雜的前處理，耗時耗力[15]，隨著現代分子生物學的發展，逐漸將分子生物技術應用到藥用植物的鑒別中，該方法主要是依據藥材的DNA 差異來完成對藥材的鑒別，已有研究將DNA 條形碼技術用于延胡索及其混偽品的鑒別，通常以延胡索新鮮塊莖為研究對象，但市售延胡索藥材都是經過高溫蒸煮或醋炙等的加工品，其DNA 降解嚴重，PCR 擴增困難，不利于進行分子生物鑒別。本研究以延胡索炮制加工品為研究對象，以ITS2 作為DNA 條形碼成功擴增出完整、符合要求且變異位點豐富的序列。除此之外，基于ITS2 條形碼序列構建的NJ系統發育樹顯示，延胡索加工品與其混偽品分屬于不同的分支，而同一物種緊密的聚集在一起，表明ITS2 條形碼序列能夠準確鑒別延胡索加工品及其混偽品，驗證了ITS2 條形碼的鑒別能力，可以為保障延胡索的臨床安全合理應用提供依據。