基于網絡藥理學與GEO生信統計的瘀血痹抗類風濕性關節炎的活性成分及作用機制研究△

孫彩虹，楊志城，房慶偉，吳若銘，李坤，葉冠

上海醫藥集團股份有限公司 中央研究院，上海 201203

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以侵蝕性關節炎為主要臨床表現的慢性進行性自身免疫病，高發年齡為30～50 歲，女性患者約占75%[1]。RA 病因不明，研究顯示可能與環境、外傷、感染、遺傳、雌激素、精神狀態等相關；臨床癥狀以關節滑膜炎和關節損傷為主，表現為關節疼痛、腫脹等；病情發展亦伴隨骨與軟骨組織進行性破壞，導致關節畸形嚴重，影響患者生活質量[2]。

目前，RA尚無根治性治療手段，常用化學藥物為非甾體類解熱鎮痛抗炎藥、糖皮質激素等，不良反應較多，而抗體類藥物應用范圍受限于其給藥方式及價格。中醫學者辨證分析認為RA 屬“痹癥”，內因為正氣不足，外因為外邪侵襲[3]，并在長期醫療實踐中積累了豐富的臨床經驗。瘀血痹膠囊是臨床常用抗RA 中成藥，由當歸、丹參、乳香（炙）、沒藥（炙）、威靈仙、紅花、川牛膝、川芎、姜黃、香附（炙）、黃芪（炙）11 味中藥組成，具有活血化瘀、通絡止痛的功效，主治瘀血阻絡所致的痹證，可有效改善患者關節炎癥及疼痛癥狀。截至目前，該藥物抗RA 的研究主要集中于實驗動物或臨床藥效學觀察[4-5]，作用機制也僅有臨床抗炎報道[6]。近年來通過網絡藥理學研究RA 的報道較多，以網絡理論和系統生物學原理為基礎，從整體上探討藥物與RA的相關性，與中藥復方“多成分、多靶點”特點吻合，是探究中藥復方治療疾病作用機制的有效途徑。本研究通過網絡藥理學研究手段獲得瘀血痹膠囊潛在的抗RA 活性化學成分及作用靶點信息，結合藥動學篩選、蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）、生物作用和信號通路富集分析方法，構建藥物-成分-靶點-疾病網絡，探究瘀血痹膠囊抗RA 的機制，并通過生物信息學分析及分子對接技術進行虛擬驗證，為其科學合理應用和后續研究提供參考[7-8]。

1 材料與方法

1.1 化學成分的收集與篩選

采用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以瘀血痹膠囊組方單味藥中文名進行檢索，收集整理中藥成分數據。以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為篩選條件，將活性成分納入后續研究。

1.2 靶點收集和網絡構建

通過TCMSP收集活性成分的作用靶點，靶點名稱輸入UniProt數據庫（https://www.uniprot.org）進行標準化。以“rheumatoid arthritis”為檢索關鍵詞在GeneCards 數據庫（http://www.genecards.org）檢索，獲得與RA 相關的靶點。將藥物靶點與疾病靶點整合繪制韋恩圖，得到交集靶點和藥物-活性成分-靶點網絡。

1.3 PPI分析

在STRING 11.0 數據庫（https://string-db.org）中選擇“multiple proteins”模式，導入上述獲得的交集靶點，設置物種為“homo sapiens”進行檢索，分析靶點蛋白之間的相互作用（combined_score）；將交互作用的最小閾值設置為“medium confidence=0.4”，網絡類型選擇“full string network”，隱藏無相互作用的點后繪制PPI圖。

將STRING 11.0 數據庫中得到的靶點PPI 網絡文件導入Cytoscape 3.7.2 軟件，根據度（degree）值篩選得到藥物作用排名前30的關鍵靶點。

1.4 基因本體（GO）分析

將得到的潛在靶點導入Bioconductor 數據庫（http://www.bioconductor.org）進行GO 分析，包括分子功能（MF）、生物過程（BP）和細胞組成（CC）3 個部分，得到瘀血痹膠囊潛在抗RA 靶點與其對應的GO條目之間的相互關系。

1.5 京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析

將得到的潛在靶點導入Bioconductor數據庫進行KEGG分析，對潛在靶點進行通路富集，獲取瘀血痹膠囊作用的相關信號通路和可能的抗RA機制。

1.6 RA樣本數據下載

登錄美國國立生物技術信息中心（NCBI）的GEO（Gene Expression Omnibus，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）數據庫檢索“rheumatoid arthritis”樣本。納入標準：樣本應包含RA 樣本與常規滑膜炎樣本（Normal）；樣本為人組織來源（homo sapiens）且芯片數據類型為基因表達譜。

1.7 差異基因分析及驗證靶點篩選

采用GSEA 4.1.0 對注釋后的表達矩陣進行分析，設置Number of permutations=1000；Phenotype Labels 為 RA VS Normal；Permutation type 為Phenotype，取前2000為RA與常規滑膜炎差異基因。差異基因與疾病-藥物交集靶點取交集，即得驗證靶點。

1.8 分子對接

于RCSB PDB 數據庫（https://www.rcsb.org/）中下載上述篩選出的擬驗證靶點蛋白晶體結構，于PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載化合物-靶點網絡圖中度值排名前10 的化合物結構，分別對蛋白和小分子進行去水、加氫、能量最小化等前處理后，采用LibDock 進行分子對接。

2 結果

2.1 瘀血痹膠囊潛在活性成分篩選

共檢索瘀血痹膠囊有效成分1449個，以OB≥30%及DL≥0.18 為篩選標準，去除無相關作用靶點化合物及重復化合物，最終獲得潛在活性成分128個。

2.2 瘀血痹膠囊抗RA靶點預測

共檢索瘀血痹膠囊潛在作用靶點11 504 個，與潛在活性化合物進行交集檢索、去重，獲得124 個靶點。共檢索得到RA 靶點4465 個。將瘀血痹膠囊124 個成分作用靶點與RA 靶點進行交集分析，得到85 個化合物靶點與疾病靶點的交集靶點，這些交集靶點預測為瘀血痹膠囊抗RA的靶點（圖1）。

圖1 瘀血痹膠囊活性成分靶點與RA靶點韋恩圖

2.3 瘀血痹膠囊活性成分-RA 靶點網絡構建及PPI核心靶點篩選

采用Cytospase 3.7.2 軟件構建瘀血痹膠囊活性成分-RA 靶點調控網絡（圖2），節點為靶標或化合物，連線表示成分與靶標之間互作關系，由圖2 可知，瘀血痹膠囊復方通過多成分、多靶點發揮協調作用。

圖2 瘀血痹膠囊治療RA的藥物-成分-疾病-靶點網絡

基于STRING 11.0 數據庫，獲得瘀血痹膠囊治療RA 的85 個靶點PPI網絡，該網絡包括85 個節點，910 條相互作用線，平均節點度值為21.4，局部聚類系數為0.635。同時，根據PPI 網絡分析得到度值排名靠前的28 個靶點（核心靶點），利用R 腳本進行繪圖分析，結果見圖3。通過network analyzer 對PPI 網絡進行分析，以成分作用靶點個數為指標排序，結果見表1，共有成分可能為瘀血痹膠囊復方藥物抗RA的主要活性成分。

表1 瘀血痹活性成分對應靶點數及歸屬藥味（前10位）

圖3 瘀血痹治療RA交集靶點PPI網絡

靶點PPI 網絡中度值較大的靶點，如白細胞介素-6（IL-6）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、白蛋白（ALB）、表皮生長因子受體（EGFR）僅與少數（1～4 個）中藥活性分子相互作用，且這些成分為多個中藥的共有成分。提示瘀血痹膠囊中的少數、共有或主要活性成分可以通過核心靶點起到相對強的藥理作用。此外，雌激素受體α（ESR1，度值為47）、雄激素受體（AR，度值為39）、過氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG，度值為35）、孕酮受體（PGR，度值為28）和核受體亞家族3C 組成員1（NR3C1，度值為29）可以與10 個以上的不同藥材歸屬的化合物相互作用，這些靶點均為細胞核受體。核受體作為核心靶點通過調控多個基因表達從而對多個蛋白靶點發揮調節作用。因而，核受體在RA的發病和治療機制上的作用值得關注和研究。

2.4 GO分析

采用ClusterProfiler軟件包將前28 個共同作用靶點進行GO 功能分析，結果見圖4，GO 有向無環分析結果顯示，瘀血痹抗RA 作用主要分為調節受體活性、核酸轉錄因子活性與DNA 結合區活性、核心啟動子近端區DNA 結合，進一步調節蛋白質異二聚化、轉錄激活因子活性、核受體活性、類固醇激素受體活性、激活轉錄因子結合、類固醇結合等生物過程（圖5）。前5 條GO 條目主要與VEGFA、EGFR、原癌基因蛋白FOS（FOS），酪氨酸激酶受體2（ERBB2），轉錄因子p65（RELA），孕激素受體（PGR）、連環蛋白β-1（CTNNB1）、NR3C1、雄激素受體（AR）、ESR1等靶點相關（圖6）。

圖4 瘀血痹膠囊治療RA交集靶點GO富集分析氣泡圖

圖5 瘀血痹膠囊抗RA靶點GO富集分析有向無環圖

圖6 瘀血痹膠囊抗RA靶點GO富集分析弦圖（前5）

2.5 瘀血痹膠囊抗RA核心通路篩選

以FDR＞0.01 為依據挑選前20 條路徑，結果見圖7，結果顯示，瘀血痹膠囊發揮抗RA 作用主要通過調節心血管、炎癥反應、病毒感染、癌癥、激素分泌、免疫、中樞神經系統等相關信號通路。靶點-通路相互作用（圖8）分析結果顯示，多個靶點對應一條通路，體現出多靶點的協同作用，或者同一個靶點對應多條通路，同時調節多種酶蛋白和信號轉導，起到多通路共同參與疾病治療作用。其中FOS、NFKB 抑制劑α（NFKBIA）、核轉錄因子-κB激酶亞基β抑制劑（IKBKB）、RELA、關聯死亡啟動子重組蛋白（BCL2）、半胱氨酸蛋白酶-3（CASP3）、G1/S-特異性周期蛋白-D1（CCND1）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAF1）、CASP9 等靶點對前5條通路貢獻最大。

圖7 瘀血痹膠囊治療RA交集靶點KEGG通路氣泡圖

圖8 瘀血痹膠囊抗RA靶點KEGG通路分析弦圖

2.6 差異基因選取及分子對接驗證

為展示2 組基因的差異表達情況，繪制GSE55457 數據集火山圖（圖9），RA 組與常規滑膜炎組表達差異前50 基因熱圖（圖10）所示，將排名靠前的差異基因與上述交集靶點取交集（圖11），篩選出IL-6、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、NR3C1、多不飽和脂肪酸5-脂氧合酶（ALOX5）、IKBKB、EGFR、AR、Myc 原癌基因蛋白（MYC）、CASP3、淀粉樣β前體蛋白（APP）、桿狀病毒IAP重復蛋白5（BIRC5）、CTNNB1、DNA 修復酶1（PARP1）、NAD（P）H脫氫酶[醌]1（NQO1）、內皮素轉化酶1（ECE1）、G2/有絲分裂特異性細胞周期蛋白-B1（CCNB1）為差異表達的核心基因。采用分子對接對靶點及核心化合物進行驗證。

圖9 RA組與正常組基因差異表達火山圖

圖10 RA組與正常組基因差異表達熱圖（前50）

圖11 差異表達基因與RA-瘀血痹交集靶點韋恩圖

將瘀血痹膠囊活性成分-RA 靶標調控網絡圖中與RA 靶點相關性排名前10 的活性成分作為分子對接配體，將基因表達差異篩選到的核心基因蛋白作為分子對接受體，采用LibDock 進行分子對接，對接得分值見表2。由表2可知核心化合物與IL-6對接活性最好，其次為PARP1、IKBKB、AR、CASP3、EGFR、MAPK8、ALOX5 等靶點；β-谷甾醇、鞣花酸、7-O-甲基異鼠李糖醇、木犀草素、槲皮素、異鼠李素、山柰酚、β-胡蘿卜素等核心化合物與各差異基因對接分數較高。部分化合物與靶點對接模式見圖12。

圖12 瘀血痹膠囊治療RA的部分核心化合物與靶點對接模式圖

表2 瘀血痹膠囊治療RA靶點與核心化合物對接得分值

3 討論

本研究通過網絡藥理學對瘀血痹膠囊進行活性成分篩選、靶點預測和網絡分析；結合GEO 數據庫基因芯片數據，明確瘀血痹膠囊治療RA 的核心靶點，并通過分子對接初步驗證了其合理性。結果共得到活性化合物128 個，其中丹參所含活性化合物最多，其次為沒藥、紅花、黃芪；瘀血痹膠囊治療RA 潛在靶點85 個，篩選出核心靶點16 個，分子對接結果表明β-谷甾醇、鞣花酸、7-O-甲基異鼠李糖醇、木犀草素、槲皮素、異鼠李素、山柰酚、β-胡蘿卜素等核心化合物可能與IL-6、PARP1、IKBKB、AR、CASP3、EGFR、MAPK8、ALOX5 等靶點相互作用來治療RA，說明瘀血痹膠囊治療RA 具有多成分-多靶點-多通路的特點。

槲皮素、木犀草素、山柰酚作用的RA 靶點數最多，分別為53、23、21 個，分子對接結果也顯示其與核心靶點對接活性較高。槲皮素為瘀血痹膠囊復方中沒藥、紅花、川牛膝、香附、黃芪的共有活性成分，為黃酮類化合物，現有研究證明其藥理作用廣泛，包括抗關節炎、抗糖尿病、抗高血壓病、抗病毒、抗感染、抗衰老及心血管保護作用等[9]。現有研究表明，槲皮素可通過降低腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β、IL-17 和單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）水平從而對C57BL/6 小鼠膠原誘導性關節炎起重要作用[10]，并有學者指出包括IL-6、TNF-α、IL-1β、前列腺素E2（PGE2）、環氧合酶2（COX-2）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）在內的炎癥介質的含量被槲皮素顯著下調[11]。木犀草素為瘀血痹膠囊中紅花、香附、丹參的共有活性成分，是一種天然黃酮類化合物，動物實驗證明其具有抗炎、抗過敏和抗癌等作用[12]，可以通過影響多種炎性信號通路[核轉錄因子-κB 信號通路、MAPK 信號通路、酪氨酸蛋白激酶家族-信號轉導子和轉錄激活子（JAKSTAT）信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號通路]抑制炎性細胞因子和炎癥介質的表達等緩解炎癥成纖維細胞樣滑膜細胞的侵襲性遷移，顯著影響類風濕性關節炎病理過程[13]，現有研究表明木犀草素可抑制膠原誘導的關節炎大鼠滑膜成纖維細胞的增殖及降低IL-6、IL-8、IL-15 和轉化生長因子-β（TGF-β）的表達從而發揮治療RA的作用[14]。山柰酚為瘀血痹膠囊中紅花、香附、黃芪的共有活性成分，亦為黃酮類化合物，具有抗氧化、抗菌和抗炎作用[15-16]，為有效的免疫抑制劑，可減少有害的免疫反應，包括自身免疫和慢性炎癥[17]。Pan等[18]研究結果表明，山柰酚通過阻斷MAPK通路激活而不影響TNF-α受體的表達來抑制RA 中成纖維細胞樣滑膜細胞的遷移和侵襲。在本研究中，槲皮素、山柰酚和木犀草素與大量RA 靶點相互作用，表現出抗炎、鎮痛等作用。此外，槲皮素、木犀草素、山柰酚具有較高的OB，可能為瘀血痹膠囊主要發揮藥效的潛在物質基礎。其余瘀血痹膠囊活性成分如黃芩苷[19]、丹參酮ⅡA[20]及共存于5 種中藥中的β-谷甾醇[21]和豆甾醇[22]，均有研究表明其可減輕RA等炎癥反應。

此外，分子對接活性較好的還有PARP1、EGFR、MAPK8 等核心靶點。PARP1 是一種核酶，主要是通過減少炎癥介質表達、減少炎癥細胞與炎癥區域壞死細胞以及炎癥部位的募集受損從而顯示出抗炎作用。PARP1還通過調節PARP-1酶活性從而調節促炎基因的激活過程，如NF-κB、激活蛋白1（AP-1）、AP-2、轉錄阻遏物蛋白YY1（YY1）、轉錄因子Oct-1（Oct-1）、信號轉導因子和轉錄激活因子1（Stat-1）、Myb 相關蛋白B（B-MYB）、缺氧誘導因子-α（HIF-α）、轉錄因子SP-1（SP-1）[23]。對稱性腫脹的滑膜關節是RA 的一個特征，由白細胞浸潤、抑制滑液白細胞凋亡和部位滑膜增生引起[24]。EGFR 在侵襲性腫瘤生長中起著至關重要的作用[25]。最近的研究表明，RA 患者的血清和滑液EGFR 水平均顯著高于健康對照組[26]，EGFR 是治療RA 患者關節炎癥的關鍵靶點[27]。RA 是一種骨代謝紊亂疾病，成骨細胞的骨形成與破骨細胞的骨吸收之間的不平衡已被證明對該疾病的發生有直接影響，線粒體的選擇性自噬可能在調節成骨細胞和破骨細胞的增殖、分化和功能方面發揮重要作用，而MAPK8/叉頭框蛋白O3（FOXO3）通路，已被揭示在線粒體自噬過程中發揮調節作用[28]。Gómez-Puerto 等[29]研究了人骨髓間充質干細胞（MSCs）的成骨分化，發現FOXO3 被ROS 激活過程主要依賴于MAPK8 誘導FOXO3 的Ser294 磷酸化，并且FOXO3 激活在通過自噬激活調控ROS水平方面作用顯著。

綜上，本研究基于網絡藥理學手段系統分析并總結出瘀血痹膠囊活性成分通過靶點蛋白發揮抗RA的藥理學作用機制，通過GEO 數據庫挖掘出常規滑膜炎患者與RA 患者差異表達基因并取交集基因，并通過分子對接手段驗證了上述研究結果的合理性。網絡藥理學的研究結果顯示，瘀血痹膠囊中的多個活性成分通過作用于多個靶點、多條通路共同實現對RA 的治療作用。這些靶點和通路主要涉及細胞炎性因子、細胞生長因子及影響線粒體自噬過程等，提示瘀血痹膠囊治療RA 的作用機制與調節炎性信號通路、促進血管新生及調控線粒體自噬相關。該結果對瘀血痹膠囊的臨床合理使用及二次開發具有重要理論價值。