太空搭載膜莢黃芪SP2代2年生群體遺傳變異分析△

陳永中，陳垣，郭鳳霞，董林林，劉蘭蘭，孫亞鵬，許宏亮，李紅玲

1.甘肅農業大學 農學院/生命科學技術學院/甘肅省中藥材規范化生產技術創新重點實驗室/甘肅省藥用植物栽培育種工程研究中心/甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；2.中國中醫科學院 中藥研究所，北京 100700；3.天津市現代中藥資源研究企業重點實驗室/天津天士力現代中藥資源有限公司，天津 300410

膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.是豆科（Leguminosae）黃芪屬（Astragalus）多年生草本植物，主產于黑龍江、吉林、內蒙古、甘肅、山西等地，以根入藥，味甘，性溫，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養血等功效，用于氣虛乏力、食少便溏、中氣下陷、表虛自汗、內熱消渴等[1]。黃芪種類較多，栽培中存在品種混雜、種質退化等問題，有必要選育膜莢黃芪新品種以提高其質量和產量。

然而，隨著黃芪用量增大，野生資源減少，生產中嚴重缺乏矮稈、根型優異、豐產優質的品種。航天育種指利用返回式飛行器搭載種子，使其經歷太空環境，促進其誘變，培育新種質和選育新品種的現代育種技術[2-3]，具有種質變異幅度大、優良變異多和育種周期短等優點[4]，在基因型復雜的中藥材育種方面應用潛力巨大[5-7]。例如，曹麗等[8]研究發現空間環境誘導植株中控制株高相關基因的改變，致矮稈突變株的莖稈由上至下發生不同程度節間長度縮短，育成矮稈突變株系DMR88-1。簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）是由1～6 個核苷酸組成的串聯重復基元，分布于真核生物基因組，具有多態性豐富、分辨率高、遺傳信息量大、標記顯性、穩定性高、檢測成本低廉等優點，是一種重要的輔助育種手段，被廣泛用于構建植物遺傳圖譜、基因組比較作圖和遺傳多樣性研究等[9]。張利民等[10]在分析蒙古黃芪轉錄組序列中的SSR 位點時發現，引物CL609 在10 份膜莢黃芪樣品中均能擴增出約700 bp的特異條帶，而蒙古黃芪無此條帶，說明該引物可區分蒙古黃芪和膜莢黃芪。SSR 分子標記技術已被應用到多種作物遺傳多樣性研究[11-14]，但對利用太空誘變獲得的膜莢黃芪變異世代遺傳多樣性研究尚無報道。隨著大健康中藥產業的發展，中藥材生態有機栽培將全面推行，有必要選育適宜生態有機栽培的膜莢黃芪優良新品種。因此，本研究在有機栽培條件下，從形態學和分子生物學角度對不同太空搭載方式種子建立的膜莢黃芪SP2代2 年生群體的變異性進行深入分析，以期揭示太空搭載方式對膜莢黃芪遺傳多樣性的誘導效應。

1 材料

1.1 樣品

膜莢黃芪種子由天津天士力現代中藥資源有限公司聯系國家航天管理局搭載，經甘肅農業大學陳垣教授鑒定為膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.種子。根據搭載要求，將種子分成3份，一份留作地面對照（CK），一份（100 g）搭載“神舟十一號”太空運行33 d，編號為航芪33 d（以下簡稱33 d），一份（20 g）搭載“長征七號”，太空運行22 h，編號為航芪22 h（以下簡稱22 h）。種子返回地面后封裝于牛皮紙袋，4 ℃冰箱干燥保存，在相同時間播種育苗。

1.2 儀器

YM-48 型多樣品組織研磨機（上海豫明儀器有限公司）；ND2000 型紫外-可見分光光度計（美國Thermo Scientific公司）；Applied Biosystems?2720型熱循環儀（賽默飛世爾科技有限公司）；DYY-8C 型電泳儀（北京市六一儀器廠）；JY04S 型凝膠成像系統（北京君意東方電泳設備有限公司）。

1.3 試藥

三氯甲烷（批號：20191111）、無水乙醇（批號：20210118）均購于國藥集團化學試劑有限公司；植物基因組DNA 提取試劑盒（批號：2101#07，北京華越洋生物科技有限公司）；DL 1000 DNA Marker（批號：AJF1737A，北京依托華茂生物科技有限公司）；金牌Mix（green）聚合酶（批號：OBH21702）、綠色熒光核酸染料（批號：20201109）、西班牙瓊脂糖（Biowest Agarose）G-10（批號：111860）均購于北京擎科新業生物技術有限公司。

2 方法

2.1 試驗地概況

試驗地位于甘肅省隴西縣鞏昌鎮園藝村，坐標為E104°37′31.07″、N35°1′3.28″，海拔1767 m，年降水量約為415 mm，平均溫度8.1 ℃，日照時數為2210 h，無霜期160 d。該地為黃芪道地產區，屬黃土高原地區，土壤為黃綿土，土質肥沃疏松，氣候為溫帶大陸性季風氣候。

2.2 SP2代種子來源及2年生群體的建立

誘變種子于2017 年4 月22 日條播育苗，在2018年成藥期采種獲得SP2代種子。2019 年4 月20 日，用SP2代種子育苗，于11 月5 日移栽，2020 年春季返青后得到SP2代2年生群體。

2.3 表型性狀的遺傳多樣性分析

按照《植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南 黃芪》NY/T 2592—2014 規定[15]進行表型性狀調查。在CK 群體、誘變33 d 群體和誘變22 h 群體的選種圃中各隨機選取具有明顯表型性狀的植株50 株，測量表型性狀指標。數量性狀包括株高、株幅、莖粗、一級分枝數、二級分枝數、復葉數、小葉數、葉長、葉寬；質量性狀包括茸毛、葉毛、莖色、葉色、花色、葉尖、莢色、莢形。剪取植株上部健康葉片，硅膠干燥后，保存于-20 ℃備用。

2.4 SSR分子標記的遺傳多樣性分析

2.4.1基因組DNA 提取與檢測 精確稱取葉片30 mg，多樣品組織研磨機研磨后，采用植物基因組DNA 提取試劑盒提取，通過紫外-可見分光光度計檢測提取所得DNA濃度，保存-20 ℃冰箱中備用。

2.4.2引物篩選與聚合酶鏈式反應（PCR）擴增 查閱文獻，收集可用于黃芪遺傳分析的SSR 引物15 對[16-18]，由睿博興科生物技術有限公司合成。依據表型性狀測量結果，從3 個群體中各選取株高、株幅、莖粗、一級分枝數、二級分枝數、復葉數、茸毛、莖色、葉色、花色差異較大的10 份樣品，進行引物篩選，最終確定穩定性、多態性、重復性好且帶型清晰的8 對引物用于本研究（表1）。采用熱循環儀對黃芪基因組進行擴增，擴增程序：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s；43～58 ℃（溫度隨引物而定），退火15 s；72 ℃延伸15 s，共35～45 個循環（隨引物退火溫度不同而定），72 ℃后延伸5 min，4 ℃保存。反應體系：20 μL 體系1.1× Golden T6 Super PCR Mix 10 μL、100 μmol·L-1的上、下游引物各1 μL、DNA 模板1 μL、去離子水7 μL。擴增產物用2.5%瓊脂糖凝膠，210 V 電壓下電泳分離35 min，凝膠成像系統觀察拍照。

表1 黃芪8對引物的擴增結果及多態性信息

2.5 數據統計

對3 個群體各50 份表型描述資料數據進行數值轉化處理（表2），遺傳多樣性指數（H′）采用Shannon-Weaver 多樣性指數。采用Excel 2003 以參考文獻[19]所列公式計算H′，使用SPSS 21.0 將表型數據標準正態轉換，采用組間連接法聚類，以歐式距離繪制樹狀聚類圖。根據SSR-PCR 擴增產物的電泳圖，人工選取長度為100～1000 bp、清晰可辨的擴增條帶統計，對于同一引物的擴增產物，按同一DNA 條帶的有無統計，電泳結果讀帶采取0/1方式，構建分子標記結果的數據矩陣，按參考文獻[17]計算引物PIC，用PopGen32 軟件計算有帶、無帶所占的頻率，利用NTSYS-pc2.10e軟件計算參試樣品的遺傳距離（GD）和遺傳相似系數（GS），基于GS，用非加權配對算術平均法（UPGMA）構建親緣關系聚類樹狀圖[17]。

表2 膜莢黃芪質量性狀及其賦值

3 結果

3.1 基于表型性狀的遺傳多樣性分析

3.1.1變異分析與H′分析 33 d、22 h 和CK 3 個群體各50份膜莢黃芪材料的17個表型性狀的變異系數（CV）和H′見表3。33 d、22 h 和CK 群體的平均CV 分別為29.37%、26.17%和26.10%；平均H′分別 為1.27、1.22 和1.24。從CV 和H′結果可知，33 d群體的平均CV和平均H′均高于22 h 和CK 群體，除復葉數外，CV 和H′的最大值與最小值在3 個群體中對應的表型性狀不一致。

表3 膜莢黃芪三群體試驗材料不同表型性狀變異分析

3.1.2表型聚類分析 由圖1 可知，在歐氏距離為5 處，33 d、22 h 和CK 群體各50 份黃芪樣品分別聚為五大類群、六大類群和三大類群。33 d 群體的第Ⅰ類群包含14 份材料，該類群葉色以綠色為主，淺綠色次之，葉片較細長，上表面有茸毛，花瓣前端多披紫色，株型緊湊，株高適中，株幅較小，分枝較多，復葉數較濃密；第Ⅱ類群包含15 份材料，該類群葉色以綠色為主，葉片細長，上表面有茸毛，花瓣前部披紫色為主，花瓣黃白色次之，株型松散，植株高，株幅較寬，分枝較多，莖稈較大；第Ⅲ類群包含13 份材料，該類群莖色全為半紫色，葉片較細長，花瓣黃白色為主，株型緊湊，株高適中，株幅適中，分枝多，復葉濃密，莖稈粗大；第Ⅳ類群包含7 份材料，該類群莖色以半紫色為主，植株高而緊湊，分枝少，復葉稀疏，小葉多而細長，莖稈較細；第Ⅴ類群僅包含1 份材料，植株矮小，分枝少，復葉稀疏，小葉多而細長，莖稈綠而細。22 h 群體的第Ⅰ類群包含13 份材料，該類群葉色以綠色為主，深綠色次之，葉片細長，上表面有茸毛，頂端圓，花瓣前端披紫色為主，植株高而緊湊，分枝多，復葉濃密，莖稈粗大；第Ⅱ類群包含20 份材料，該類群葉色以綠色為主，深綠色次之，葉片細長，上表面有茸毛，花瓣前端披紫色為主，花瓣黃白色次之，植株高而緊湊，分枝較多，復葉較濃密，莖稈較大；第Ⅲ類群包含4 份材料，該類群花瓣黃白色，葉片細長，上表面有茸毛頂端圓，植株高而松散，分枝較多，復葉稀疏；第Ⅳ類群包含10 份材料，該類群葉色以綠色為主，花瓣尖部披紫色為主，植株高而緊湊，分枝較少，復葉稀疏，莖稈較粗；第Ⅴ類群僅包含1 份材料，植株高大而松散，葉色淺綠，花瓣前部披紫色，分枝較少，復葉稀疏，莖稈較粗；第Ⅵ類群僅包含2 份材料，植株矮而松散，葉色綠，葉片細長，分枝較少，復葉稀疏，莖稈較細。CK 群體的第Ⅰ類群包含22份材料，該類群葉色以綠色為主，淺綠色次之，葉片較寬長，上表面有茸毛，花瓣前部多披紫色，株型緊湊，分枝較多，復葉濃密，莖稈粗大；第Ⅱ類群包含19 份材料，該類群葉色以綠色為主，葉片短小上表面有茸毛，花瓣前部披紫色為主，花瓣黃白色次之，株型松散，植株較高大，分枝較多，莖稈較大；第Ⅲ類群包含9 份材料，該類群葉色以綠色為主，葉片較細長，花瓣黃白色為主，株型高大，分枝較少，復葉稀疏，莖稈較細。可見，在歐氏距離為5處，誘變后群體聚集的類群比CK 群體多，且33 d 群體聚集的類群較22 h 群體少，各類群表型性狀不一致，說明誘變后群體具有較為豐富的遺傳多樣性，但22 h 群體遺傳多樣性高于33 d群體。

圖1 膜莢黃芪33 d、22 h和CK群體表型性狀聚類結果

3.2 基于SSR分子標記的遺傳多樣性分析

3.2.1多態性分析 采用8 對引物對三群體的各50份材料進行PCR 擴增，產物分布在100～1000 bp，三群體均擴增出21 個清晰度較高、重復性較好的電泳條帶（表1、圖2），平均每對引物可擴增出2.63個條帶。其中，多態性條帶共擴增出38 個，有5 對引物的擴增條帶多態性比率為100%，平均每對引物的PIC 在33 d、22 h 和CK群體中分別為0.320、0.427 和0.333，多態信息含量可以較好地衡量SSR分子標記位點多態性的高低，當PIC＜0.25 時，具有低度多態性，當0.25≤PIC＜0.50 時，具有中度多態性，當PIC≥0.50 時，具有高度多態性[20]，擴增結果表明，22 h群體多態性高于33 d和CK群體，供試材料遺傳多樣性較為豐富。

圖2 引物Y11在膜莢黃芪樣品中的擴增結果

3.2.2GD和GS分析 對33 d、22 h 和CK 群體的GD和GS進行統計。結果顯示，GD分別為0～0.895 9、0.027 0～0.943 5和0～0.895 9，GS分別為0.400 0～1.000 0、0.384 6～0.973 0 和0.400 0～1.000 0。33 d 群體GS最小的是2 號與25 號植株、2 號和32 號植株，GS均為0.400 0；GS最大是23號與24號植株，GS為1.000 0。22 h群體GS最小的是6號與44號植株，GS為0.384 6，GS最大的是11 號與14 號植株，GS為0.973 0。CK群體GS最小的是1號與24號植株，GS為0.400 0，GS最大的是41號與46號植株，GS為1.000 0。可見，33 d和CK群體的GD和GS一樣，但對應植株材料不一致，2 個群體的GD和GS稍大于22 h 群體，說明33 d和CK群體中有的植株與群體其他植株間差異較大，且三群體的SSR位點均具有較高遺傳多樣性。

3.2.3SSR 分子標記聚類分析 由圖3 可知，在GS為0.68 處，可把33 d、22 h 和CK 群體材料分成4、5 和4 個類群。33 d 群體的第Ⅰ類群包含10 份材料，該類群葉色以綠色為主，葉片較細長，上表面有茸毛，花瓣前端多披紫色，株高適中，株幅較大，分枝較多，復葉稀疏，莖稈較細小；第Ⅱ類群包含22份材料，該類群葉色以綠色為主，淺綠色次之，葉片細長，花瓣前端披紫色為主，花瓣黃白色次之，株型緊湊，株高最高，株幅較窄，分枝較少，莖稈較細小；第Ⅲ類群包含8 份材料，該類群葉色以綠色為主，葉片細長，上表面有茸毛，莖色多為半紫色，花瓣黃白色與花瓣前端多披紫色植株各占1/2，植株高而寬大，多分枝，復葉濃密，莖稈粗大；第Ⅳ類群包含10 份材料，該類群葉色以淺綠色為主，葉片細長，上表面多有茸毛頂端圓，莖色全為半紫色，植株高而緊湊，分枝較多，復葉稀疏，小葉細長；22 h 群體的第Ⅰ類群包含8 份材料，該類群葉色綠和深綠色植株各占1/2，葉片細長，上表面有茸毛頂端圓，花瓣前端披紫色為主，植株高而寬大，分枝較多，復葉濃密，莖稈粗大；第Ⅱ類群僅包含2 份材料，該類群葉片較細長，上表面有茸毛頂端圓，花瓣黃白色，植株高度適中而寬大，分枝較少，復葉濃密，莖稈較細；第Ⅲ類群包含30 份材料，該類群葉色以綠色為主，葉片細長，上表面有茸毛，莖色多為半紫色，植株高而寬大，分枝較多，復葉稀疏，莖稈較大；第Ⅳ類群包含9 份材料，該類群葉色以綠色為主，葉片較細長，上表面有茸毛，花瓣前端披紫色為主，植株高而較窄，多分枝，復葉較稀疏，莖稈較粗；第Ⅴ類群僅包含1 份材料，植株高而松散，葉色綠而細長，花瓣前端披紫色，多分枝，復葉稀疏，莖稈較粗，半紫莖。CK群體的第Ⅰ類群僅包含2 份材料，該類群葉片較細長，上表面有茸毛頂端尖，植株高大，多分枝，復葉濃密，莖稈粗大；第Ⅱ類群包含4 份材料，該類群葉色綠，葉片細長，上表面有茸毛頂端尖，植株高大，多分枝，復葉稀疏，莖稈粗大；第Ⅲ類群包含30 份材料，該類群葉色以綠色為主，淺綠色次之，葉片細長，上表面有茸毛頂端尖，莖色多為半紫色，植株高而較窄，多分枝，復葉較稀疏，莖稈較細；第Ⅳ類群包含14 份材料，該類群葉色以綠色為主，淺綠色次之，葉片較細長，上表面、頂端尖為主，花瓣前端披紫色為主，披黃白色次之，莖色多為半紫色，植株較低矮而寬大，分枝較少，復葉較濃密，莖稈粗大。綜上所述，在GS為0.68 處，33 d 和CK 群體較22 h 群體少一類群，三群體之間各類群表型性狀區別較為明顯，說明各群體都具有較為豐富的遺傳多樣性，但22 h群體遺傳多樣性仍高于另2個群體。

圖3 膜莢黃芪群體SSR分子標記的UPGMA聚類圖

4 討論

4.1 基于表型性狀分析航天搭載誘變的膜莢黃芪SP2代群體遺傳多樣性

膜莢黃芪人工栽培第1年育苗，第2年成藥。種質資源遺傳多樣性主要指群體內個體間基因組成的差異，是多基因組合表達的結果，在同一植物不同品種甚至不同個體間表型性狀也會出現不同程度的差異，其高低直接影響品種改良的效果，新品種選育有賴于優良基因的發現和利用[21]。本研究通過對航天搭載誘變33 d和22 h的膜莢黃芪種子建立的SP2代2年生群體及CK 表型性狀的變異度和遺傳多樣性分析，發現誘變后的2個群體表型性狀的CV 和H′高低次序不完全一致。33 d群體復葉數、一級分枝數、花色、莢形多樣性較豐富，22 h 群體多樣性較豐富的指標是二級分枝數、莖粗和葉長，而CK 的莖粗、葉長和一級分枝數較豐富；這與謝向譽等[22]對48 份廣西地方核心食用木薯種質資源的41 個表型性狀CV和多樣性指數分析的結果一致。本研究聚類分析在歐氏距離為5 處把33 d、22 h 和CK 群體分別聚為5 個、6 個和3 個類群，33 d 較22 h 少1 個類群，說明誘變后的33 d 和22 h 群體較CK 具有更為豐富的遺傳多樣性，22 h 群體遺傳多樣性高于33 d 群體，田間試驗也觀察到22 h 群體在返青期個體間形態差異性更大。

4.2 基于分子標記分析航天搭載誘變的膜莢黃芪SP2代群體遺傳多樣性

SSR 分子標記具有多態性豐富、遺傳信息量大等優點[8]，已應用到黃芪鑒定中。孫會改等[23]采用流式細胞術和K-mer 分析估測黃芪基因組大小，為其全基因組測序研究提供了參考數據。常越等[24]利用MISA 工具篩選膜莢黃芪轉錄組測序獲得的9893 條unigenes，對其SSR 位點信息分析搜索到1729 個SSR 位點，SSR 的發生頻率為9.24%，SSR 在黃芪整個轉錄組中出現的頻率為13.42%，平均距離為7.97 kb。對甘肅6 個主栽區57 份黃芪樣本利用SSR標記遺傳多樣性分析發現，PCR 產物長度為100～1000 bp，多態性位點82個，多態性比率為97.56%，平均每條引物的多態信息含量為0.438[17]；SSR 還可用于黃芪與紅芪鑒定的核心引物篩選和驗證[25]。劉亞令等[16]利用10 對SSR 引物對來自17 個產地共380個樣本分析，發現蒙古黃芪遺傳多樣性水平要高于膜莢黃芪，其遺傳變異主要發生在居群內。賀潤麗等[18]利用MISA 對蒙古黃芪轉錄組序列長度在1 kb以上的18 040條unigene進行SSR 位點信息搜索，在其轉錄組共搜索到5640 個SSR，分布于4462 條unigene，SSR 位點出現頻率為31.26%，平均每6514 bp 含1 個SSR 位點，說明黃芪群體間及群體內存在大量的SSR位點，可用于黃芪種質資源的鑒定。本研究基于文獻挖掘，選用15 對引物擴增，其中有8 對引物有效，產物分布在100～1000 bp，33 d、22 h 和CK 群體均擴增出21 個較為清晰的條帶，平均每對引物可擴增出2.63 個條帶，平均每對引物的PIC 分別為0.320、0.427 和0.333，具有中度多態性。由于多態性含量越高的引物品種識別率越高[26]，22 h 群體平均每對引物的PIC 高于33 d 和CK 群體，同時，在GS為0.68處，UPGMA法聚類結果把33 d、22 h 和CK 群體材料分成4 個、5 個和4 個類群，說明22 h 群體遺傳多樣性高于33 d 和CK 群體，這也進一步印證了形態變異的結果。但本研究所用引物擴增出的條帶數少，一是可能采用2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR 擴增產物，雖然可以有效分離微衛星DNA 差異條帶[27]，但由于SSR 主要表現為2～5 個核苷酸重復次數的變化，多態性片段長度的差異可以小到2～4 bp[28-29]，故需要進一步提高其濃度范圍使分離范圍變小，分辨率提高；二是前人研究的樣本存在地域復雜性和種質來源的差異，而本研究僅采用同一來源的膜莢黃芪種子通過對航天搭載建立的SP2代分析，更能揭示航天搭載方式對2 年生群體的誘變作用，“長征七號”搭載誘變22 h創造變異的效率更大。選擇更高濃度的瓊脂糖凝膠電泳對藥材根及其品質和產量性能的SSR 分析將是下一步研究的重點，以提高膜莢黃芪優良新品種選育的效率。

4.3 表型性狀和分子標記聚類結果不一致的可能原因

本研究中2 種聚類方法結果不一致，這與鄭道君等[30]通過表型性狀結合區間SSR 標記和相關序列擴增多態性標記技術對中國南瓜海南農家品種進行分析得到的聚類結果相一致，也與Ferriol 等[31]對南瓜的分析結果一致。此外，石勝友等[32]對56 份杧果種質資源進行遺傳多樣性分析發現，基于表型性狀和擴增片段長度多態性聚類結果并不完全一致。推測其原因一方面是植物表型性狀由多個不同基因型決定；另一方面受引物數量限制，SSR 標記得到的基因位點數較少。由多個基因決定的表型性狀，SSR 標記檢測到的基因位點可能只是多個基因中的一部分，并不能全面反映植物DNA 信息，且某些檢測到的多態位點不一定在表型性狀中表現出來。此外，本研究用于分析的表型性狀也僅是膜莢黃芪表型的一部分。以上原因可能導致表型聚類和分子標記聚類結果不一致。

5 結論

優異種質資源是育種的物質基礎，創造遺傳豐富多樣的優異種質是新品種選育的保障。基于表型性狀和SSR 分子標記分析，揭示航天搭載的膜莢黃芪SP2代2 年生群體存在豐富的遺傳多樣性，33 d 和22 h群體的平均CV分別為29.37%和26.17%，平均H′分別為1.27 和1.22，平均每對引物的PIC 分別為0.320 和0.427，聚類結果能明顯區分出不同類別的植株，且22 h 群體遺傳多樣性高于33 d 群體，表觀性狀間的差異性較大，說明航天搭載創造了較豐富的遺傳多樣性選擇群體，下一步研究將對地上矮稈植株進行根部性狀篩選，以期選育符合育種目標的優良膜莢黃芪新品種。