等離子體處理對生鮮魚肉殺菌效能及貯藏品質的影響

王藝月，姜竹茂，錢婧，戴俊健，章建浩*，嚴文靜*

1(南京農業大學 食品科技學院，江蘇 南京，210095)2(煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺，264005)

我國是漁業養殖大國，由于魚肉質鮮美，蛋白質含量高，因此廣受消費者喜愛。生鮮魚肉在貯藏、運輸、加工及銷售過程中，易受微生物影響，造成品質破壞進而導致腐敗變質[1]。普通市場常以整條活魚售賣，并不采用殺菌技術；但一些生鮮超市則是切片售賣，需對魚片進行包裝。盒裝生鮮魚片包裝后需結合冷鏈運輸，但仍存在產品貨架期短且容易微生物超標等問題，這些問題限制了行業的發展。因此需要對生鮮魚肉采取加工處理措施，以減少魚肉微生物污染，最終達到延長其貨架期的目的。目前，魚肉保鮮常用的技術主要包括低溫貯藏、添加防腐劑、添加動植物源保鮮劑等技術[2]，這些技術存在保鮮效果不佳、成本高和化學殘留等問題。因此，尋找一種高效安全、價格低廉的新型保鮮方式尤為重要。

低溫等離子體(atmospheric cold plasma，ACP)是一種新型的冷殺菌技術，處理過程中不會產生溫升，具有高效的抗菌特性，且作用后無殘留。ACP在放電過程中產生紫外線、帶電粒子及活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)、活性氮自由基等物質，這些活性物質可以通過蝕刻作用、細胞膜穿孔與靜電干擾和細胞大分子氧化3個途徑，氧化微生物細胞膜表面的蛋白質和脂質，造成細胞膜表面形成小孔，隨后進入細胞內，誘導遺傳物質中胸腺嘧啶二聚物的形成從而影響DNA的復制，最終導致微生物失活[3-4]。

目前利用ACP技術對生鮮魚肉的保鮮主要集中在海水魚，ALBERTOS等[5]利用ACP(70、80 kV，5 min)處理包裝后的鯡魚魚片，研究發現ACP技術可以減少鯡魚魚片中菌落總數、假單胞菌和腸桿菌，從而延長其保鮮效果；汪春玲等[6]曾對比ACP(70 kV，60 s)和臭氧(0.6 mg/L，5 min)處理對氣調羅非魚保鮮品質的影響，發現ACP抑制表面微生物繁殖效果更好，但是在一定程度上促進了脂質氧化反應。淡水魚保鮮的研究相對較少，而淡水魚在我國漁業市場占比更大。同時，組胺與魚肉其他品質指標之間存在一定關系，但針對兩者相關性的研究較少，因此需要探究組胺和多個品質指標之間的相關性，進而對魚肉新鮮度進行評價。組胺廣泛存在于動植物體內，具有某些特定的生理功能，但攝入過量會造成食物中毒，從而影響身體健康[7]。目前有關組胺的研究多集中在其產生機制及毒理特性上，關于降低組胺產生的加工方式的報道較少。

系統研究ACP對淡水魚貯藏期間的殺菌效果及安全品質影響對于該技術的產業化應用至關重要。本實驗以草魚為原料，探究不同電壓(40、50、60和70 kV)條件處理對貯藏期內生鮮魚肉菌落總數、致病菌數量及理化品質的影響，研究了組胺積累量與品質指標的相關性，為等離子體技術在草魚等淡水魚的貯藏和加工等方面的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚(鮮活，體表無傷，體重約為2 kg)，南京蘇果超市；平板計數瓊脂、伊紅美藍瓊脂、假單胞菌CFC選擇性培養基，上海海博微生物科技有限公司；NaCl、丙三醇、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸(2-thiobarbituric acid reactive substance，2-TBA)，均為分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司；亞油酸、二硫蘇糖醇，均為分析純，南京壽德生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

CPS-I型介質阻擋放電低溫等離子體設備，南京屹潤等離子科技有限公司；Beckman Allegra 64R高速冷凍離心機，美國Beckman公司；MAP-H360復合氣調保鮮包裝機，蘇州森瑞保鮮設備有限公司；UV-2600 紫外分光光度計，日本島津；數顯式pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；IKA T18 basic高速勻漿機，德國IKA公司；JA2203 N電子天平，上海民橋精密科學儀器有限公司；CR-400型全自動測色色差儀，柯尼卡美能達控股公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 低溫等離子體發生裝置

低溫等離子體發生裝置示意圖如圖1所示。包裝后的樣品置于2個鋁電極之間，上下電極分別連接到高壓電源和地線，并在電極和樣品之間插入聚乙烯介質板。處理時2個電極板之間形成的高壓電場，將包裝盒內的空氣電離產生等離子體。此操作具有殺菌操作簡單、工作效率高等優點。

圖1 等離子體發生裝置Fig.1 Dielectic barrier discharge system

1.3.2 樣品準備與處理

將新鮮草魚去除頭、鱗、尾和內臟，用無菌水清洗干凈，沿魚脊椎剖成兩半，取背部魚肉。為結合實際，在實驗中參考了超市中售賣的盒裝生鮮魚片的魚片厚度，將魚肉切成3 cm×4 cm×0.5 cm 的魚片樣品(約10 g)，分5組，每個處理組30塊魚肉，所有組別均有3盒重復。隨后放入聚丙烯包裝盒中(155 mm×105 mm×35 mm)，用包裝機進行空氣密封包裝，魚肉(g)與盒內空氣(cm3)的數值比為1.89，一些生鮮超市中包裝后的魚肉(g)與盒內空氣(cm3)的數值比為1.72，兩者比例接近。試驗組樣品分別用40、50、60和70 kV電壓處理3次(每次60 s，間隔時間30 s，處理頻率50 Hz)；對照組樣品未經等離子體處理。最后將所有的樣品存放于恒溫恒濕箱中(溫度：4 ℃，相對濕度：85%)，每隔2 d 測量1次各項指標數據，每次重復3次。

1.3.3 微生物數量的測定

參考國標GB/T 9695.19—2008《肉與肉制品取樣方法》[8]的方法并略作修改，取樣時考慮到魚片堆疊位置不同，分別對不同堆疊位置的樣品進行1∶1(g∶g)取樣混合后進行試驗。在無菌條件下，將10 g魚肉加入90 mL生理鹽水，均質器拍打2 min后，制備1∶10(g∶mL)稀釋液，然后逐步稀釋。菌落總數按照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗與菌落總數測定》[9]；假單胞菌總數按照SN/T 4044—2014《出口肉及肉制品中假單胞菌屬的計數方法》[10]；大腸桿菌總數參照孫艷等[11]的方法進行。

1.3.4 pH的測定

稱取5 g魚肉絞碎，加入45 mL去離子水，用高速均質機均質30 s，過濾后取上清液，用pH計進行測定。

1.3.5 感官評價

每組3盒魚肉，4 ℃下每隔2 d取樣1次進行感官分析。參考侯溫甫等[12]的生魚片感官評價方法，以魚肉氣味、色澤、組織形態及組織彈性為評價指標，5分為品質最優，1分為品質最差。具體評分標準見表1。

表1 生鮮魚肉感官評定標準Table 1 Fresh grass fish fillet sensory evaluation standard

1.3.6 TBA值的測定

參考國標GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的測定》進行測定[13]。以樣品空白調節零點，在532 nm處測定樣品溶液和標準系列溶液的吸光度值。在標準曲線中，橫坐標為丙二醛濃度，縱坐標為吸光度值。依據標準曲線得到樣品中的TBA值。

1.3.7 組胺含量的測定

組胺含量的測定方法參照GB/T 20768—2006《魚和蝦中有毒生物胺的測定 液相色譜-紫外檢測法》[14]進行。

1.4 數據處理

用SPSS 20.0 軟件對以上數據進行統計分析，使用鄧肯多重比較檢驗進行顯著性分析(P> 0.05)差異不顯著，(P<0.05)差異顯著。所有實驗重復3次，數據用平均值±標準差表示。采用Origin 9.0 軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 等離子體處理對生鮮魚肉表面微生物數量的影響

菌落總數是評價其水產品品質及貨架期的一個重要指標，當菌落總數超過6 lgCFU/g時，即認為水產品腐敗變質[15]，導致魚肉腐敗的微生物和酶不止存在于魚肉表面，但由于宰殺過程或暴露在空氣中造成的微生物污染主要集中在魚肉表面。由圖2-a可知，第0天時未處理組的菌落總數為5.0 lgCFU/g，等離子體處理后生鮮魚肉的菌落總數顯著降低(P<0.05)，且隨著處理電壓增大呈現菌落總數顯著下降趨勢。經40、50、60和70 kV電壓處理后，菌落總數分別減少0.3 lgCFU/g、0.4 lgCFU/g、0.8 lgCFU/g和1.0lgCFU/g。貯藏至4 d時，對照組菌落總數達到6.2 lgCFU/g，處理組均未超過限量(6 lgCFU/g)限度。第6天時，經40 kV 和50 kV電壓處理后，樣品表面菌落總數分別為6.3 lgCFU/g和6.1 lgCFU/g，其余2組未超過限量。第8天時，經60 kV和70 kV電壓處理后的樣品表面菌落總數分別為6.2 lgCFU/g和6.1 lgCFU/g，結果表明低溫等離子體處理能有效抑制生鮮魚肉中微生物的生長(P<0.05)，延長生鮮魚肉的貯藏期4 d。同時由于等離子體具有一定的穿透能力，也可作用于對魚肉品質產生影響的內源性酶[16-17]，因此ACP技術可通過殺滅微生物和鈍化酶活力的共同作用，延長生鮮魚肉貨架期。

假單胞菌是新鮮魚肉貯藏過程中的優勢腐敗菌[18]。本文研究了低溫等離子體對生鮮魚肉中假單胞菌的抗菌效果。如圖2-b所示，第0天時，等離子體處理后生鮮魚肉中假單胞菌總數顯著降低(P<0.05)，且電壓越高下降越多，其中70 kV處理組的假單胞菌總數為2.3 lgCFU/g，相比于對照組減少了1.2 lgCFU/g。由于假單胞菌是一種好氧微生物，因此貯藏4 d后其生長呈現減緩的趨勢。在第8天時，對照組假單胞菌菌落數為6.6 lgCFU/g，等離子體處理組分別為6.0 lgCFU/g、5.9 lgCFU/g、5.5 lgCFU/g和5.3lgCFU/g，說明等離子體處理能有效抑制生鮮魚肉中假單胞菌的生長。

大腸桿菌是一種致病微生物，與捕撈、加工過程中的污染有關[19]。如圖2-c所示，第0天時，對照組的大腸桿菌總數為2.7 lgCFU/g，經等離子體處理后，數量明顯減少，且數量減少程度與處理電壓高低有關，經70 kV處理后減少最多，為1.1 lgCFU/g。當貯藏至第8天時，與對照組相比，處理組中的大腸桿菌菌落數分別降低了0.8 lgCFU/g、1.0 lgCFU/g、1.3 lgCFU/g、和1.5 lgCFU/g。說明等離子體處理能有效抑制生鮮魚肉中大腸桿菌的生長，這與之前的報道結果一致[20-21]。等離子體產生的活性成分可以與細菌細胞壁中的肽聚糖和脂多糖發生碰撞，從而破壞C—O、C—N和C—C等結構鍵[22]。這些活性物質進入細胞質后，與細胞內物質發生反應，使微生物死亡[16]。

2.2 等離子體處理對生鮮魚肉pH的影響

圖2 不同電壓對貯藏期生鮮魚肉微生物數量的影響Fig.2 Effects of different voltages on microbial population values of grass carp fillets

表2 不同電壓對貯藏期生鮮魚肉pH的影響Table 2 Effects of different voltages on pH values of grass carp fillets

2.3 等離子體處理對生鮮魚肉感官品質的影響

由10名經過專門培訓的評定人員逐項進行打分，平均分數如圖3所示。在貯藏過程中，所有組別的感官品質分值隨著貯藏時間延長而有所下降，這表明在貯藏期間魚肉的新鮮度在逐漸下降。在貯藏前2 d，處理組和對照組感官品質分值無顯著差異(P> 0.05)。貯藏至第4天時，對照組感官品質分值為18.4±0.17，處理組分值分別為20.4±0.1、20.9±0.1、0.8±0.1和20.5±0.1，結果表明，與對照組相比，處理組能更好地保持魚肉的感官特性。貯藏結束時(第8天)，經ACP處理的樣品總體評分高于對照組，相較于照組存在顯著差異(P<0.05)。從魚肉整體品質的變化來看，等離子體處理在保持魚肉整體品質方面具有優勢。

圖3 不同電壓對貯藏期生鮮魚肉感官品質評分的影響Fig.3 Effects of different voltages on the sensory evaluation of grass carp fillets

2.4 等離子體處理對生鮮魚肉TBA值的影響

由于魚肉富含不飽和脂肪酸，易受到ROS的攻擊降解生成丙二醛，丙二醛和TBA會發生反應生成粉色化合物；因此，TBA值一直以來被認為是反映水產品脂肪氧化程度的重要指標[26]。如圖4所示，對照組魚肉TBA的初始值為0.24 mg/kg。與對照組相比，40 kV等離子體處理后，魚肉TBA值并無顯著性差異(P>0.05)；當處理電壓超過50 kV時，樣品的TBA值顯著升高(P< 0.05)，且隨著處理電壓的增加，TBA值呈逐漸升高的趨勢。當電壓達到70 kV時，TBA值為0.3 mg/kg，與對照組相比增加了1.3倍。在整個貯藏期間，對照組及處理組的TBA值均呈上升趨勢，且處理組TBA值始終高于對照組。在第8天時，對照組的TBA值為0.6 mg/kg，與對照組相比，與經40、50和60 kV 處理組樣品的TBA值無顯著差異(P>0.05)，而70 kV處理組的TBA值增加了0.1 mg/kg(P<0.05)。這是由于CP處理過程中產生的自由基加速了過氧化物的產生，使得處理組TBA值較大增加[19]。根據GREENE等[27]的研究，當鮮肉中TBA值大于0.6 mg/kg時，會對肉的品質產生影響。本實驗中，貯藏至第8天時，各組TBA值均超過限度。

圖4 不同電壓對貯藏期生鮮魚肉TBA值的影響Fig.4 Effects of different voltages on the TBA of grass carp fillets

2.5 等離子體處理對生鮮魚肉組胺含量的影響

草魚肌肉組織中的氨基酸易受微生物產生的脫羧酶催化，發生脫羧反應從而產生組胺[28]。國標中規定水產品中組胺含量應小于20 mg/100g[29]。經不同電壓處理后，生鮮魚肉中組胺含量隨貯藏時間變化如圖5所示。由圖5可看出，魚肉中組胺含量隨貯藏時間延長而逐漸積累。對照組組胺含量增加速率較快，在第4天時達到22.8 mg/100g，超過國標規定限量。經ACP處理后的魚肉組胺含量顯著降低(P<0.05)，處理電壓越高，組胺含量減少越多，并且在整個貯藏期中均未超過20 mg/100g。在貯藏初期，對照組和處理組組胺含量分別為(6.0±0.2)、(5.9±0.3)、(6.0±0.2)、(5.8±0.2)和(5.7±0.3) mg/100g。貯藏后期，ACP處理組的組胺含量增長速率低于對照組。貯藏至第8天時，處理組組胺含量遠低于國標規定，相比對照組分別減少了53.8%、58.1%、60.5%和66.6%，表明ACP處理能顯著降低魚肉中的組胺含量。微生物與水產品中大部分生物胺的產生與變化有很大的相關性[30]。因此經ACP處理后，魚肉中與產生組胺相關的微生物顯著降低，從而導致貯藏期間ACP處理組組胺含量增加較為緩慢。

圖5 不同電壓對貯藏期聲響魚肉組胺含量的影響Fig.5 Effects of different voltages on histamine content of grass carp fillets

2.6 組胺含量與品質指標相關性分析

為探究貯藏過程中組胺含量變化與其他新鮮度品質評價指標間的關系，根據試驗結果對其進行皮爾遜相關系數分析，結果如表3所示。在貯藏過程中，各組組胺含量與菌落總數、大腸桿菌總數、假單胞菌總數、pH、感官評價、TBA值均呈極顯著相關(P<0.01)，說明組胺積累的同時會導致其他品質指標發生變化，這說明組胺含量可作為生鮮魚肉貨架期的參考指標。同時，其他品質指標的變化情況，也會為生鮮魚肉組胺安全性評價提供依據。

表3 不同電壓處理后生鮮魚肉中組胺含量與各品質 指標的相關性Table 3 Correlation of content of histamines in grass carp fillets with each quality index with different voltages

3 結論與討論

本實驗以草魚為對象，研究了低溫等離子體處理對生鮮魚肉殺菌效果及品質的影響經等離子體處理后，貯藏期間生鮮魚肉的微生物數量、理化指標的變化，目的是探索該技術在水產品保鮮方面的可行性，得出以下結論：

(1)低溫等離子體處理可以有效抑制生鮮草魚肉中微生物的生長，并且隨著處理電壓的增大其抑菌抗菌效果增強，當電壓達到70 kV時可使菌落總數、假單胞菌總數和大腸菌群數數分別降低1.0 lgCFU/g、1.1 lgCFU/g和1.2 lgCFU/g。貯藏至第4天時，對照組菌落總數達到6.2 lgCFU/g，經40 kV和50 kV處理后的生鮮魚肉在第6天時超過閾值(6.0 lgCFU/g)，分別為6.3 lgCFU/g和6.1 lgCFU/g；第8天時，60 kV和70 kV處理組菌落總數超過限量。

(2)低溫等離子體處理可顯著降低貯藏期間生鮮魚肉中組胺含量，對照組組胺含量在第4天超過限量(20 mg/100g)；生鮮魚肉的TBA值在可接受范圍內會有所上升，在第8天時所有組別TBA值均超過限量；等離子體處理后魚肉的pH略有下降，但不會對魚肉的感官品質產生顯著影響。

(3)組胺與其他品質指標之間存在極顯著相關性(P<0.01)，由于生鮮魚肉感官品質在可接受的食用范圍內也可能存在組胺安全性風險，因此對其安全性和品質評價時可結合多個評價指標。

綜合分析，低溫等離子體處理能延長生鮮魚肉貨架期4 d，并且對生鮮魚肉品質不會產生顯著影響。由此可見，低溫等離子體冷殺菌技術不僅可應用于生鮮草魚肉殺菌保鮮，同時在其他生鮮水產品安全及品質控制方面也具有廣闊的應用前景。