基于GC-MS的低鹽蝦醬低溫發酵過程中代謝組學分析

李文亞，班雨函，于宏偉，馬愛進，桑亞新，孫紀錄,*

（1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071001；2.北京工商大學食品與健康學院，北京 100048）

傳統蝦醬是由毛蝦、蜢子蝦等小型蝦或低值蝦添加食鹽發酵制成的調味品。傳統蝦醬含鹽量高，約為25%～30%。攝入食鹽過多可能會導致血壓升高等一系列健康問題，所以傳統高鹽蝦醬并不符合現代人群健康的理念。與之相比，低鹽豆醬[1]、低鹽魚醬[2]和低鹽腌魚[3]等低鹽產品更加受到消費者的歡迎。近年來，低鹽蝦醬已在滄州黃驊等一些傳統蝦醬產區悄然興起。低鹽蝦醬同樣是以低值蝦類經過加鹽發酵而成，但是，其含鹽量顯著降低，約為10%～12%。目前，國內已有學者對低鹽蝦醬的發酵工藝進行研究，包括添加酶制劑發酵[4]、低溫發酵[5]和人工接種發酵[6]等。由于含鹽量的降低，一些腐敗微生物可能得不到抑制而大量增長，從而對低鹽蝦醬的風味、形態及營養價值產生一定的影響。因此，目前許多低鹽蝦醬生產企業采用低溫發酵的方式控制腐敗微生物的生長。

代謝組學是一種系統確定生物樣品中低分子質量代謝物的方法，在發酵水產品中，已被用于監測從原材料到終端產品這一過程中的質量、安全性和微生物的變化過程，確保產品的品質[7]。發酵水產品的代謝組學分析也已用于記錄發酵過程中的代謝物變化，以期達到預測終端產品的感官特性和營養質量的目的[8]。目前，代謝組學的研究手段主要為液相色譜-質譜、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、核磁共振和高效液相色譜等[9]。水產品的發酵過程可以看作一個復雜的生態系統，含有多種微生物菌群，對營養成分進行水解，從而釋放出大量的代謝物，如氨基酸、有機酸和苷元化合物等。由于代謝組學能夠同時檢測多種代謝物的變化，因此被廣泛用于發酵食品的代謝物組變化中，如灰樹花的發酵[10]、沙棘油[11]、發酵乳[12]和高度黑糯米酒[13]。在發酵水產品中，代謝組學應用還不夠廣泛，在低鹽蝦醬中更是研究匱乏。Chen Daian等[14]研究了發酵過程中蟹醬代謝組學的演變，發現蟹醬的質量明顯受到發酵的影響，質量變化表現為乳酸、甜菜堿、牛磺酸、三甲胺-N-氧化物、三角堿、肌苷、二磷酸腺苷、2-吡啶醇的下降，一系列氨基酸的波動，以及蔗糖、甲酸、乙酸鹽、三甲胺、次黃嘌呤的積累。Lee等[15]對在不同環境中發酵的高鹽蝦醬進行代謝組學分析，發現在高鹽環境下酶的作用受到抑制，導致在發酵后期氨基酸和葡萄糖含量仍然沒有顯著性差異，同時推測在蝦醬樣品發酵過程中，原料蝦體內的內源性蛋白酶和脂肪酶發揮著重要作用，尤其是對感官特性有十分重要的影響。

蝦醬發酵過程中的代謝物直接影響蝦醬的品質和風味，而低鹽蝦醬作為一種近年出現的新型產品，其代謝物組的研究十分匱乏。因此，本實驗擬使用GC-MS技術對低溫發酵的低鹽蝦醬中代謝物組進行分析，并通過t檢驗和變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值分析等多元統計分析方法對差異代謝物進行篩選，以期揭示低溫發酵工藝生產的低鹽蝦醬中代謝物組變化規律。研究結果將為低鹽蝦醬的質量評估和進一步完善低鹽蝦醬生產工藝提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜢子蝦購自河北農業大學科技市場，產地為黃驊。

氯仿（色譜級） 上海沃凱生物技術有限公司；超純水、甲醇、乙腈 美國Fisher Chemical公司；吡啶（色譜級） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲氧胺鹽酸鹽、L-2-氯苯丙氨酸 上海阿達瑪斯科技有限公司；N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（含1%三甲基氯硅烷） 美國Regis公司。

1.2 儀器與設備

Wonbio-96c多樣品冷凍研磨儀 上海萬柏生物科技有限公司；Centrifuge 5424 R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；JXDC-20氮吹儀 上海凈信實業發展有限公司；8890B-5977B GC-MS聯用儀 美國Agilent公司；TH2-D恒溫振蕩器 蘇州培英實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 低鹽蝦醬的制作

挑選新鮮蜢子蝦，清洗、瀝水、稱質量，搗碎后添加蜢子蝦質量10%的食鹽[6]，分裝于玻璃發酵容器中，用兩層紗布封口，置于培養箱中進行恒溫發酵。一批放于10 ℃恒溫培養，另一批放于20 ℃恒溫培養，當氨基酸態氮含量趨于穩定時視為發酵結束。發酵0 d的低鹽蝦醬被標識為S0，10 ℃發酵的低鹽蝦醬為低溫組（L組），被標識為LX；20 ℃發酵的低鹽蝦醬為對照組（H組），被標識為HX；其中X表示蝦醬發酵周數。

1.3.2 樣品前處理

精確稱取50 mg樣本到2 mL離心管里，加入0.5 mL甲醇-水溶液（4∶1，V/V，含0.02 mg/mL的內標L-2-氯-苯丙氨酸）。加入一顆鋼珠，放入-20 ℃研磨機中研磨（50 Hz，3 min）。加入200 μL氯仿，研磨機中研磨（50 Hz，3 min），超聲提取30 min。-20 ℃靜置30 min。4 ℃、15 000 r/min離心15 min，取上清液裝入玻璃衍生瓶中，氮氣吹干。向玻璃衍生小瓶中加入80 μL的甲氧胺鹽酸吡啶溶液（15 mg/mL），渦旋振蕩2 min后，于振蕩培養箱中37 ℃肟化反應90 min。取出后再加入80 μL的N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（含1%三甲基氯硅烷）衍生試劑，渦旋振蕩2 min后，于70 ℃反應60 min。取出樣本，室溫放置30 min，進行GC-MS代謝組學分析。

1.3.3 GC條件

衍生化后樣本用分流模式注入GC-MS系統進行分析，進樣量1 μL，分流比10∶1。樣品經DB-5MS毛細管柱（40 mh0.25 mm，0.25 μm）分離后進入質譜檢測。進樣口溫度260 ℃，載氣為高純氦氣，載氣流速1 mL/min，隔墊吹掃流速3 mL/min，溶劑延遲5 min。升溫程序：初始溫度60 ℃，平衡0.5 min，然后以8 ℃/min升至310 ℃，并維持6 min。

1.3.4 MS條件

電子電離源；傳輸線溫度310 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV。掃描方式為全掃描模式，質量掃描范圍m/z50～500，掃描頻率3.2 scan/s。

1.4 統計學分析

采用MassHunter workstation Quantitative Analysis（v10.0.707.0）軟件進行峰提取、對齊等數據預處理操作，最終得到代謝物鑒定結果及數據矩陣，結合t檢驗和VIP值篩選出差異代謝物。

2 結果與分析

2.1 低鹽蝦醬中代謝物的多元統計分析

2.1.1 不同溫度發酵低鹽蝦醬的OPLS-DA

為了分析2種溫度下低鹽蝦醬中的代謝物是否會產生明顯的差異，使用正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）法分析2種處理下低鹽蝦醬樣品之間的差異性，從而更好區分組間差異，結果如圖1所示。

圖1 不同溫度下發酵低鹽蝦醬的OPLS-DA圖（A）和置換檢驗圖（B）Fig.1 OPLS-DA (A) and permutation test (B) plots of low-salt shrimp paste fermented at different temperatures

由圖1A所示，2種不同溫度下發酵的低鹽蝦醬能夠被明顯區分，證明溫度能夠明顯影響微生物的代謝，使2 組樣品間菌體代謝物種類和含量存在明顯的差異[10]。對于OPLS-DA模型圖，往往需要使用置換檢驗對模型的有效性進行驗證，以防發生過度擬合現象導致模型出現偏差，在圖1B中，和分別表示所建模型對X和Y矩陣的解釋率，Q2標示模型的預測能力。、和Q2越接近1表示模型越穩定可靠，Q2＞0.5表示模型的預測能力較好。在本次檢驗結果中，、和Q2值分別為0.709、0.992和0.989，證明該OPLS-DA模型有效，不存在過擬合現象。因此，對于分析不同溫度下發酵的低鹽蝦醬之間代謝物的差異性準確。

2.1.2 不同溫度發酵低鹽蝦醬代謝物PLS-DA

由圖2可以看出，隨著發酵時間的延長，2種溫度下發酵的低鹽蝦醬代謝物大部分可以明顯分開。由圖2A所示，H組樣品中原料S0中的代謝物能夠明顯與其他5個時間段的樣品區分開；發酵4 周和8 周的樣品與其他樣品能夠明顯區分；在發酵中后期，第12、16周和第20周的蝦醬樣品并沒有明顯區分。這可能是因為剛開始發酵后菌種活力較高，微生物生物量增加導致代謝物變化較大，導致第4周和第8周的樣品能夠明顯區分，而進入發酵中后期后，代謝物的變化速度降低，使發酵中后期樣本區分不明顯。由圖2B所示，原料S0與5個取樣點樣品都能明顯區分，第4、8周和第12周樣品能夠明顯區分，這可能是因為在發酵前期，由于低溫環境的影響，微生物菌種活力相對較低，但由于前期碳源較為充足，代謝物之間相互作用產生一些酯類和酚類等化合物，使代謝物能夠明顯區分[13]。在發酵后期第16周和第20周，由于能源物質基本被消耗，微生物發酵作用受到抑制，造成代謝物變化不明顯，所以不能被很好區分。

圖2 不同溫度發酵低鹽蝦醬代謝物的PLS-DA圖Fig.2 Partial least squares discriminant (PLS-DA) plots of metabolites in low-salt shrimp paste fermented at different temperatures

2.1.3 不同發酵階段低鹽蝦醬代謝物PLS-DA

為更加全面地了解不同溫度下發酵的低鹽蝦醬代謝物的變化，對同一發酵階段不同處理的蝦醬中的代謝物進行PLS-DA，結果如圖3所示。在發酵第0周時，2種低鹽蝦醬的代謝物并無差異。隨著發酵的不斷進行，2種低鹽蝦醬中的代謝物都能夠被明顯區分，這可能是因為發酵溫度對于微生物活力有很大影響，導致微生物在發酵過程中能夠產生不同的代謝物，從而能夠很好地被區分開。

圖3 不同發酵階段的低鹽蝦醬代謝物的PLS-DAFig.3 PLS-DA plots of metabolites in low-salt shrimp paste at different fermentation stages

2.2 低鹽蝦醬中的主要代謝物分析

基于GC-MS的檢測結果，對不同溫度下發酵的兩組蝦醬中主要代謝物（組內不同發酵周數的總量）進行分析。2 組低鹽蝦醬中共有44種主要代謝物，包括氨基酸類16種、脂肪酸類6種、胺類2種、有機酸類8種、醇類3種、核苷酸類3種、其他類6種，表1列出部分主要代謝物。

表1 不同溫度下發酵蝦醬中主要代謝物相對含量Table 1 Relative contents of major metabolites in shrimp paste fermented at different temperatures

氨基酸類物質是低鹽蝦醬中含量最豐富的代謝物，在蝦醬發酵后有助于各種口味的形成，包括鮮味、甜味、苦味、酸味和咸味特征，而且還是低鹽蝦醬中重要的營養和風味前體物質，為發酵過程中的微生物生長提供氮源。實驗檢測到的主要氨基酸中，呈現甜味的氨基酸主要為甘氨酸、L-蘇氨酸和L-絲氨酸。呈現苦味的氨基酸為L-苯丙氨酸和L-脯氨酸，呈現鮮味的氨基酸為天冬氨酸、L-谷氨酸和L-谷氨酰胺。這些氨基酸在低鹽蝦醬發酵過程中共同作用帶給蝦醬獨特的風味[16]。

脂肪酸，尤其是長鏈多不飽和脂肪酸已被視為飲食中必需營養物質，對生物的生長、發育和繁殖至關重要。蝦醬和其他類型的海洋來源食物是不飽和脂肪酸的良好來源。在2 組低鹽蝦醬中主要檢測到6種脂肪酸，分別為棕櫚酸、油酸、棕櫚油酸、肉豆蔻酸、反-13-十八烯酸和十七烷酸。棕櫚酸和肉豆蔻酸屬于飽和脂肪酸，而油酸屬于n-9不飽和脂肪酸。油酸有降血壓和膽固醇的功效，同時也能降低心血管疾病的發病率，是人體良好的營養物質來源，食用富含油酸的食品有助于改善健康狀況[17]。

有機酸是低鹽蝦醬中重要的組成部分，在原料蝦中（S0）含有較少部分有機酸，在發酵過程中有機酸的含量有所升高。在低鹽蝦醬L-乳酸相對含量較高。L-乳酸在食品、制藥、化妝品和其他化學工業中具有廣泛的用途，其具有爽口的酸味，是發酵水產品中主要的有機酸類。但有機酸含量過高會導致低鹽蝦醬產品的酸化，對產品的品質造成不利影響，所以在發酵過程中更應該控制有機酸的過量產生。

2.3 低鹽蝦醬中的差異代謝物的篩選和分析

對2種溫度下發酵的低鹽蝦醬中差異代謝物進行研究，通過聚類熱圖和VIP條形圖，展示各差異組中代謝物在各樣本中的表達模式和代謝物在多元統計分析的VIP值，以及單維統計中的P值，從而直觀顯示出差異代謝物的重要性和含量趨勢變化，結果如圖4所示。圖4A中，顏色表示該代謝物在該組樣本中相對表達量大小，紅色越深表示該代謝物相對表達量越大，藍色越深表示代謝物相對表達量越小。圖4B中，條形長度表示該代謝物對2 組差異的貢獻值，默認不小于1，值越大表示該代謝物在2 組間差異越大。

在本次差異代謝物篩選中，共篩選出40種差異代謝物，篩選出VIP值大于1且P值小于0.05的差異代謝物共30種（圖4），VIP值從大到小排序為乙醇胺（VIP=3.11）、L-絲氨酸（VIP=2.91）、硫氰酸芐酯（VIP=2.86）、甘油酸（VIP=2.76）、2-乙基己酸（VIP=2.73）、乙酸橙花酯（VIP=2.62）、L-蘇氨酸（VIP=2.56）、肌氨酸（VIP=2.53）等。在2種不同溫度下發酵的低鹽蝦醬中，主要篩選出的差異代謝物為酯類、嘌呤類、酚類、胺類、有機酸類、酮類、醇類、氨基酸等。大多數被檢測到的差異代謝物早已在發酵水產品中被鑒定出來，例如魚醬和魚露[18]。具有揮發性化合物在發酵過程中表現出動態變化，有些增加，而另一些出現下降趨勢，這表示總體風味特征在整個發酵過程中也發生變化。

圖4 不同溫度下發酵低鹽蝦醬中差異代謝物的層級聚類分析熱圖Fig.4 Heatmap obtained by hierarchical clustering analysis of differential metabolites in low-salt shrimp paste fermented at different temperatures

酸類物質在低鹽蝦醬發酵過程中不僅有呈味作用，同時也能在發酵過程中對雜菌起到抑制作用，有的有機酸類還可以通過磷酸化參與糖酵解為細胞提供能量，蝦醬中的酸類物質一部分來源于原料蜢子蝦，另一部分來源于發酵過程中微生物代謝產生。本研究在差異代謝物檢測中檢測到的酸類物質有壬酸、哌啶羧酸、4-羥基苯乙酸和吲哚-3-丙酸。壬酸主要存在于H組蝦醬中，其常作為精油的呈味物質，在食用香料方面有很高的利用價值。尿刊酸和甘油酸主要在L組中產生，甘油酸作為一種化學中間體，在日常生活中有很高的需求量，在食品中主要用于食品添加劑用于改善風味[19]，同時能夠進一步磷酸化后形成甘油酸3-磷酸，參與糖酵解提供細胞生長產生所需能量。尿酸在2種處理組蝦醬中均被檢測到，在L組發酵過程中均存在，但在H組蝦醬樣品只在第4周和第8周被檢測到。尿酸是嘌呤代謝的終產物，同時也是痛風的主要原因。在L組含量高的原因可能是在發酵過程中黃嘌呤和次黃嘌呤含量較高，導致其代謝終產物中尿酸含量也有所增加。在對錦州蝦醬揮發性成分進行檢測時，發現主要酸類差異代謝物為乙酸和丁酸[20]，乙酸的產生起源于乳酸菌的作用，丁酸在蝦制品中提供奶酪香氣，這與本研究結果不同，可能是因為原料來源和發酵條件不同導致。

酮類物質是通過微生物對脂質或氨基酸的酶促反應產生，主要為低鹽蝦醬提供甜的花香風味，其產生機理是由多不飽和脂肪酸經過氧化產生，同時也能通過降解氨基酸產生，對低鹽蝦醬的風味有十分重要的影響。研究發現其存在于魚露中，有類似干酪的香氣[21]。在低鹽蝦醬發酵過程中，主要存在于H組蝦醬樣品中的2-哌啶酮作為主要差異酮類代謝物被篩選出來。

糖類物質作為主要的碳源，在糖酵解過程中被消耗，通過碳水化合物代謝途徑為微生物的生長提供必需的能量[22]，本次在代謝物差異中所檢測到的糖類物質的衍生物分別為1,4-二脫氧-1,4-亞氨基-D-阿拉伯糖醇和肌醇半乳糖苷。在L組蝦醬中1,4-二脫氧-1,4-亞氨基-D-阿拉伯糖醇含量較H組更多，在L組發酵初期（第4周），1,4-二脫氧-1,4-亞氨基-D-阿拉伯糖醇含量很少，隨著發酵時間的延長1,4-二脫氧-1,4-亞氨基-D-阿拉伯糖醇含量增加，在之后整個發酵過程中都能被檢測到，在H組蝦醬中只在第20周檢測到了1,4-二脫氧-1,4-亞氨基-D-阿拉伯糖醇。

嘌呤類化合物是細胞中最為豐富的代謝物，對于提供細胞能量和細胞內信號傳導起十分重要的作用[12]。本次檢測到的嘌呤類差異化合物有黃嘌呤和次黃嘌呤，黃嘌呤是嘌呤降解途徑的產物，并且能夠在黃嘌呤氧化酶的作用下生成尿酸，這是L組中尿酸含量大于H組的原因。次黃嘌呤別名為6-羥基嘌呤，可通過進一步分解得到黃嘌呤，黃嘌呤形成后經過參與代謝轉化得到終產物甘氨酸[23]。

氨基酸不僅是代謝過程中必需的，而且還是有益的前體物質。氨基酸主要來自發酵過程中細菌中的蛋白酶對原料中蛋白質的酶促降解以及酵母和其他微生物的自溶作用。蝦醬中氨基酸含量十分豐富。氨基酸不僅可以為微生物的生長提供氮源，還可以為蝦醬增加鮮味。氨基酸是蝦醬發酵過程中不可缺少的成分之一，具有多種味感，例如鮮味、甜味、苦味、酸味和咸味。在發酵過程中，一些氨基酸被酵母用作營養素，一些被轉化為高級醇，對于蝦醬的風味及感官品質的形成具有十分重要的作用。對2 組蝦醬差異代謝物的篩選中，發現肌氨酸、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、N-乙酰-L-苯丙氨酸、N-乙酰-L-亮氨酸、N-甲基丙氨酸和L-谷氨酰胺。其中亮氨酸、蘇氨酸和苯丙氨酸是3種人體必需氨基酸，苯丙氨酸也是鮮味氨基酸的一種。在低鹽蝦醬發酵過程中，肌氨酸、L-蘇氨酸、L-絲氨酸只在L組被檢測到，在H組中并沒有表達量。L-蘇氨酸作為人體生長必需的氨基酸，具有十分重要的作用，如促進生長，提高免疫機能等，在L組低鹽蝦醬發酵前期（第4、8周）含量達到了最大值，隨著發酵時間的不斷延長含量逐漸降低，到第20周時，L-蘇氨酸含量幾乎減少為0，但在H組中從始至終未表達。肌氨酸在人體中的存在形式是磷酸肌酸，可作為能量來源。在L組整個發酵過程中，肌氨酸一直被檢測到，但在H組中，只在發酵早期（第4周）檢測到肌氨酸。L-絲氨酸不僅是構成天然蛋白質的底物而且是生物體內重要的能源構成部分[24]。在整個發酵過程中，L組樣品均檢測到了L-絲氨酸，而H組樣品在整個過程中并未檢測到。N-乙酰-L-苯丙氨酸、N-乙酰-L-亮氨酸和N-甲基丙氨酸在H組發酵過程中均被檢測到，但在L組樣品中，只在發酵末期（第20周）有較低的含量。

櫻黃素、褪黑素和辛弗林也被鑒定2 組低鹽蝦醬樣品中差異代謝物。櫻黃素是從幾種植物中提取的異黃酮類中的一種代表性O-甲基化類黃酮[25]。該化合物已顯示出許多有益的活性，如抗炎、抗肥胖、應激反應以及調節蛋白水解活性[26]。同時也發現櫻黃素具有抗肥胖的潛力，并參與人類肝臟中醛脫氫酶的抑制[27]。在整個發酵過程中，櫻黃素只在H組中被檢測到，在L組樣品中并未表達。褪黑素是一種親脂性和親水性的吲哚類化合物，由于其代謝物具有抗氧化性，故認為褪黑素具有級聯抗氧化效應，在人體和動物體內具有增強人體免疫力和抗氧化能力[28]。褪黑素在2 組低鹽蝦醬樣品中均被檢測到，在整個發酵階段中，H組每個階段都檢測到該樣品，而在L組樣品中，褪黑素只在發酵末期（第20周）被檢測到，且表現出較低的含量。辛弗林屬于生物堿中麻黃堿類的一種，在中藥中常用作減肥促進劑，其作用機理是對腎上腺素受體進行刺激而產生熱量。在整個發酵過程中，L組樣品中各個階段均檢測到辛弗林，而在H組中并不是每個階段低鹽中都能檢測到辛弗林，而只在發酵后期（第16、20周）檢測出較低的含量。

錦州蝦醬樣品中，醛類（46.34%）和酸類（35.99%）是蝦醬樣品中的主要揮發性成分[20]，但在本研究中，醛類物質并不是主要差異代謝物，除此之外還在低鹽蝦醬樣品中發現了酯類差異代謝物，主要是硫氰酸芐酯和乙酸橙花酯，酯類物質也是發酵產品中主要的揮發性風味物質之一，H組樣品中，2種酯類化合物含量均高于L組樣品，乙酸橙花酯是一種源于橙花基焦磷酸的單萜類衍生物，廣泛存在于植物精油中[29-30]。乙酸橙花酯是橙花香和玫瑰香氣的來源，已廣泛應用于許多領域[31]。在食品工業中，乙酸橙花酯已被食品藥品監督管理局重新認可并批準為安全的食品調味劑。乙酸橙花酯具有抗菌性能，可以用作食品防腐的潛在抗菌劑[32]。此外，乙酸橙花酯也被歐洲食品安全局評估為一種安全的調味食品，可用于所有動物的飼料。在2 組不同溫度下發酵的低鹽蝦醬中，乙酸橙花酯主要在H組中被檢測到，在L組中未檢測到較高含量。

2.4 低鹽蝦醬中的差異氨基酸分析

如圖5所示，在低鹽蝦醬發酵過程中，涉及到許多微生物產生各種蛋白酶進行蛋白質分解，從而釋放出不同種氨基酸，對提高發酵食品的感官特性有十分重要的作用。眾所周知，許多氨基酸和小肽可以起到增味劑的作用，使食物中的鮮味、甜味、咸味和濃香味得以體現。大部分氨基酸有D型和L型2種對映體，其中L型氨基酸是構成天然蛋白質底物和生物體內重要的能源供給部分[24]，主要的4種氨基酸類差異代謝物中，L組蝦醬中L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-谷氨酰胺和肌氨酸含量高于H組蝦醬，這說明L組蝦醬中氨基酸營養成分高于H組。L-絲氨酸和L-蘇氨酸是人體細胞重要的能源之一，L-絲氨酸是人體非必需氨基酸，僅在膠質細胞（主要是星形膠質細胞）中通過糖酵解中間體3-磷酸甘油酸的代謝途徑而形成。這種代謝途徑被稱為磷酸化途徑，通過3種酶促反應將3-磷酸甘油酸轉化為L-絲氨酸[32]。具有抑制大鼠神經細胞凋亡的作用[33]。L-蘇氨酸是人體必需氨基酸，主要存在于血紅蛋白，胰島素和乳球蛋白中[34]，在畜牧營養研究中具有增強機體免疫力等作用[35]。L-谷氨酰胺是人體中最豐富的氨基酸之一，是由內源性酶對蛋白質進行分解而產生的小分子化合物，除了在蛋白質合成中發揮重要作用外，L-谷氨酰胺還能參與合成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，從而減少鐮狀紅細胞與內皮細胞的黏附，是血管閉塞性疼痛危機的標志[34]。同時L-谷氨酰胺能夠增加雞腸道黏膜免疫機能[36]和緩解人體急性酒精肝損傷[37]。

圖5 低鹽蝦醬中差異氨基酸分析Fig.5 Analysis of differential amino acids in low-salt shrimp paste

綜上所述，在10 ℃發酵的低鹽蝦醬中氨基酸含量大于常溫發酵的低鹽蝦醬，與傳統蝦醬相比，低鹽蝦醬中含鹽量降低，氨基酸態氮含量升高，提高了蝦醬的品質[38]。結合其他指標看，本研究的低鹽蝦醬產品不僅是一個健康產品同時也符合人類綠色健康生活理念。

3 結 論

利用GC-MS技術對低鹽蝦醬發酵過程中的代謝物進行監測分析。結果表明，溫度對低鹽蝦醬中的代謝物有明顯影響。通過PLS-DA結果發現，10 ℃和20 ℃發酵的低鹽蝦醬中代謝物均能在第4、8周明顯分開，說明這些代謝物有顯著差異。2種溫度下發酵的低鹽蝦醬中代謝物主要為氨基酸類和脂肪酸類物質。基于VIP值大于1且P值小于0.05共篩選出30種差異代謝物，主要為氨基酸類、有機酸類、酯類、嘌呤類和醇類物質。與20 ℃發酵的低鹽蝦醬相比，10 ℃發酵低鹽蝦醬中L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-谷氨酰胺、肌氨酸和嘌呤類化合物含量較高，而酯類物質含量較少。與傳統蝦醬相比，10 ℃發酵的低鹽蝦醬不僅含鹽量降低，而且營養特性較高。本研究有助于低鹽蝦醬發酵過程中代謝物的變化和差異，為低鹽蝦醬的生產提供一定的理論依據。