新型GSH熒光傳感材料的合成與性能研究*

王 聰, 沈思平，光善儀，徐洪耀

(1. 東華大學 化學化工與生物工程學院，生態紡織教育部重點實驗室,上海 201620;2. 東華大學 分析測試中心與材料學院，纖維改性重點實驗室,上海 201620)

0 引 言

谷胱甘肽(GSH)是細胞內一種必需的硫醇，在生理功能、維持細胞內氧化還原活性、異生物質代謝、細胞內信號轉導和基因調控中起主要作用[1-2]。細胞內GSH含量異常與多種疾病有關，如癌癥、心血管、阿爾茨海默病、衰老、心臟病等疾病[3-5]，特別是癌細胞中GSH的含量明顯高于正常細胞[6-7]。因此，開發快速、簡單和高選擇性的方法來檢測 GSH是非常必要的。目前檢測GSH的方法主要包括利用高效液相色譜 (HPLC)[8]、伏安法[9-10]、電化學分析[11-12]、傅里葉變換紅外光譜 (FTIR)、毛細管電泳 (CE)、質譜和熒光光譜等[13-15]。其中，小分子熒光探針因其靈敏度高，操作簡單，穩定性強，重現性好，成像好等特點被廣泛應用[16-17]。羅丹明B及其衍生物是以氧雜蒽為母體的堿性呫噸類熒光染料，當它的衍生物螺環打開時會引起熒光“開關”現象，同時伴隨熒光顏色變化[18-20]，所以實現對GSH的特異性檢測一直是羅丹明類探針研究的熱點。

本文以羅丹明B酰肼與3,3′-二硫代二丙酸為原料設計并合成了一種新型的對谷胱甘肽(GSH)具有特異性識別功能的二硫熒光分子RNSS。通過對RNSS進行熒光光譜性能研究，發現當RNSS的乙腈溶液中加入GSH后，在561 nm光激發下其在585 nm處出現很強的粉色熒光，并且其對GSH的熒光響應具有高選擇性以及高靈敏性同時還具備較強的抗干擾能力，該研究可為之后對GSH的檢測提供新思路。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

儀器：DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；Nicolet8700型傅里葉變換紅外光譜儀；Bruker AMX-600型核磁共振測定儀； LS55型熒光光度儀。

試劑：二氯亞砜，無水乙腈，二氯甲烷，谷胱甘肽均為分析純；所用原料3,3′-二硫代二丙酸，羅丹明 B和水合肼均為分析純；羅丹明酰肼為實驗室自制；實驗室用水均為去離子水。

1.2 探針RNSS的合成

在250 mL三口燒瓶中加入3,3′-二硫代二丙酸(40.0 g, 190.0 mmol,)，在常溫下氮氣氛圍下，緩慢滴加亞硫酰氯(85.0 mL, 1.1 mol)。加熱回流反應16 h，最終反應溶液為淡黃色。[21]真空旋轉蒸發除去過量的亞硫酰氯，產率98%。1H NMR (600 MHz, 303 K, DMSO): δ 2.62 (t, 7.0 Hz, 4H)，2.87 (t,J=7.0 Hz, 4H) ppm。

準確稱取羅丹明酰肼(0.0459 g, 0.1 mmol)和無水K2CO3(0.0138 g, 0.1 mmol)并將其溶解在二氯甲烷(10.0 mL)中，逐滴加入3,3′-二硫代丙酰氯(0.0219 g, 0.1 mmol)的二氯甲烷溶液(5.0 mL),30 ℃在氮氣氣氛下反應24 h。過濾，將濾液用二氯甲烷與飽和食鹽水萃取，并用無水硫酸鈉干燥過夜。過濾后減壓旋蒸濃縮得到紫色固體。利用柱層析(CH2Cl2∶CH3OH=100∶1)進行純化，最終得到淺紫色固體(RNSS)，產率為51%。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 9.59 (s, 2H), 7.82 (s, 2H), 7.57 (td,J=7.5, 1.4 Hz, 3H), 7.53 (td,J=7.4, 1.2 Hz, 2H), 7.05～6.98 (m, 2H), 6.46 (d,J=8.5 Hz, 4H), 6.30 (s, 4H), 6.29 (s, 4H), 3.29 (dd,J=7.0, 2.1 Hz, 16H), 2.55 (t,J=7.3 Hz, 4H), 2.31 (t,J=7.4 Hz, 4H), 1.06 (t,J=7.0 Hz, 24H)。

圖1 合成路線Fig 1 Synthetic route

2 結果與討論

2.1 傳感材料RNSS的光學性能

圖2為RNSS的紫外-可見光譜圖。RNSS本身在500 nm之后沒有任何吸收，在加入GSH后，在557 nm處呈現一個明顯的吸收峰。另外，通過手持紫外燈照射，我們發現加入GSH后，探針RNSS的乙腈/水(1∶1)溶液中有明顯的粉色熒光產生，而RNSS本身并無熒光。因此，實驗測試了在乙腈/水(1∶1)溶液中，RNSS+GSH的激發和發射光譜。如圖3所示，在561 nm處激發時，加入GSH后的RNSS溶液的最大吸收波長為585 nm。因此化合物RNSS可以用作識別GSH的熒光傳感材料。

圖2 在CH3CN/H2O(v/v=1/1)溶液中，RNSS和RNSS+GSH的紫外-可見吸收光譜Fig 2 UV-vis absorption spectra of RNSS and RNSS+GSH in CH3CN/H2O (v/v=1/1) solution

圖3 在CH3CN/H2O(v/v=1/1)溶液中，RNSS+GSH的激發和發射光譜Fig 3 Excitation and emission spectra of complex [RNSS+GSH] in CH3CN/H2O (v/v=1/1) solution

2.2 RNSS熒光傳感材料的靈敏性

在CH3CN/H2O(v/v=1∶1)溶液中，激發波長為561 nm的條件下，進行了GSH對探針RNSS的熒光滴定實驗。如圖4所示，探針RNSS(濃度為1×10-3mol/L)隨著GSH(濃度為1×10-3mol/L)的逐漸加入在585 nm處出現熒光發射峰，并且熒光強度逐漸增強。當GSH的加入量達到1.0當量時，增加趨勢減緩，之后不再隨GSH的加入增加而增加，這表明該探針與GSH是以1∶1進行反應的。

圖4 在CH3CN/H2O(v/v=1/1)溶液中加入(0～100 μmol/L)GSH后，探針RNSS的熒光發射光譜圖。(內插圖為585 nm處體系對應的不同熒光強度點)Fig 4 The fluorescence emission spectrum of the probe RNSS after adding (0-100 μmol/L) GSH to the CH3CN/H2O (v/v=1/1) solution (the inset is the different fluorescence intensity points corresponding to the system at 585 nm)

在滴定曲線實驗的基礎上，可得到在585 nm處的F/F0與GSH濃度之間的線性回歸方程，如圖5其線性回歸方程為y=0.508x-1.914，線性相關系數R2=0.988，根據DL=3σ/K，其中σ為探針平行測試20次的標準偏差，K為線性回歸方程的斜率，可計算出檢出限為6.063×10-6mol/L。圖6表示相對熒光強度的倒數1/[F-F0]與GSH濃度倒數1/[GSH ]的線性關系曲線,根據 Benesi-Hildebrand[18]方程，通過圖中斜率和截距計算得到配位常數為Ka=1.341×104,由此表明探針RNSS與GSH體系可以穩定存在。

圖5 相對熒光強度F/F0和GSH濃度的線性關系曲線Fig 5 Linear relationship curve between relative fluorescence intensity F/F0 and concentration of GSH

圖6 相對熒光強度的倒數1/[F-F0]和1/[GSH]的線性關系曲線Fig 6 The linear relationship curve between 1/[F-F0]and [1/GSH]

2.3 RNSS熒光傳感器對氨基酸選擇性和競爭性

之后，在CH3CN/H2O(v/v=1∶1)溶液中，探針濃度保持100μmol/L，分別加入21種常見的氨基酸(100μmol/L)(L-Arg、L-His、L-Ala、L-Gly、Cys、L-Val、L-Pro、L-Leu、L-Phe、L-Ser、L-Met、L-Glu、L-Asp、L-Lys、L-Thr、L-Tyr、GSH、L-Asn、L-Trp、L-lle、L-Gln)，對其熒光光譜性能進行測試。如圖7所示，在CH3CN/H2O(v/v=1∶1)溶液中，激發波長為561 nm的條件下，與其他氨基酸相比探針在加入GSH后，其在585 nm處有顯著的熒光增強。該熒光光譜實驗結果表明探針RNSS是對GSH具有高度選擇性的熒光探針。

圖7 CH3CN/H2O(v/v=1/1)溶液中加入不同氨基酸(100 μmol/L)時，探針RNSS(100 μmol/L)的熒光發射光譜圖Fig 7 Fluorescence emission spectra of probe RNSS (100 μmol/L) with different amino acids (100 μmol/L) added to CH3CN/H2O (v/v=1/1) solution

此外，為了進一步研究其他氨基酸是否對RNSS與GSH配合物的穩定性產生影響，分別在RNSS+GSH配合物溶液中加入其他氨基酸，結果如圖8所示。經實驗研究發現，當加入其他氨基酸之后，溶液在585 nm處的熒光強度幾乎沒有變化。因此，配體對GSH的選擇性識別具有良好的抗干擾能力，從而可以作為一種選擇性識別GSH的熒光探針。

圖8 在CH3CN/H2O(v/v=1∶1)溶液中，分別向探針RNSS(100 μmol/L)和探針RNSS(100 μmol/L)+GSH(1 mmol/L)體系中加入不同氨基酸(100 μmol/L)時585 nm處的熒光強度Fig 8 In the CH3CN/H2O (v/v=1∶1) solution, when different amino acids (100 μmol/L) are added to the probe RNSS (100 μmol/L) and probe RNSS (100 μmol/L) + GSH (1 mmol/L) system respectively, at 585 nm Fluorescence intensity

2.4 探針RNSS對GSH的檢測機理

為進一步探究探針RNSS與GSH的檢測機理，采用Job-plot曲線實驗的方法進行研究。固定探針RNSS與GSH的總濃度為200 μmol/L，改變兩者之間的比值測定體系的熒光強度。如圖9所示，兩者之間比例為1∶1時，熒光強度達到最大值。因此可以確定探針RNSS與GSH以1∶1的形式進行反應的。進一步支持了滴定曲線分析的結果。綜上所述，可以推斷出GSH是以1∶1的方式與探針RNSS發生取代反應，促進螺旋體內酯開環，釋放出羅丹明發色團，使熒光顏色由無色變為粉色。開環過程預計是由于先前發現的螺環內酰胺羰基和谷胱甘肽部分的游離氨基之間的氫鍵作用，如圖10所示[22]。

圖9 探針RNSS與GSH的Job-plot曲線Fig 9 Job-plot curve of probe RNSS and GSH

3 結 論

設計合成了一種新型的帶有二硫鍵的羅丹明類化合物RNSS，該分子在乙腈溶液中可以作為熒光探針對GSH進行檢測。實驗結果表明，在探針中加入等量GSH后，在585 nm處出現明顯的粉色熒光，并且不會受到其他氨基酸離子的干擾，說明該探針具有較好的靈敏性和高選擇性，其檢出限可以達到6.063×10-6mol/L。配位常數為Ka=1.341×104，表明探針RNSS與GSH體系可以穩定存在。綜上所述，RNSS可作為有效檢測GSH的一種光學探針材料。本研究為今后 GSH新型探針分子的研究及其未來生物應用研究提供了重要思路。