銀杏內酯B對糖尿病大鼠心肌纖維化的抑制作用

高振華，侯書鵬

糖尿病心肌病是糖尿病病人常見的慢性并發癥，也是導致糖尿病病人死亡的主要原因之一。心肌纖維化是糖尿病心肌病早期組織病理學改變，且呈進行性加重，是導致心臟功能惡化的重要因素，表現為心室舒張和收縮功能障礙，泵血功能降低，逐漸發展為充血性心力衰竭[1]。因此，抑制心肌纖維化是糖尿病心肌病防治的重要靶點。銀杏內酯B(ginkgolide B)是銀杏葉的主要活性成分之一，具有拮抗血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)的作用[2]。相關研究顯示，銀杏內酯B對肝纖維化及高血壓所致心肌纖維化具有明顯的抑制作用[3-4]，銀杏內酯B通過調節轉化生長因子-β1(TGF-β1)通路抑制腎小球系膜細胞外基質的分泌[5]。本研究探討銀杏內酯B對糖尿病大鼠心肌纖維化的抑制作用及其機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 50只無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠，6周齡，體重180～220 g，購自河北省實驗動物中心[許可證號：SYXK(冀)2018-004]，清潔環境分籠飼養，室溫23～25℃，相對濕度50%～60%，明暗照射各12 h，適應飼養7 d后開展實驗。

1.2 實驗藥物與試劑 銀杏內酯B(純度>95%)購自上海詩丹德生物技術有限公司；鏈尿佐菌素(streptozotocin，STZ)購自美國Sigma公司；天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)試劑盒和蘇木精-伊紅(HE)、天狼猩紅染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7、β-actin抗體和IgG二抗購自北京博奧森生物科技有限公司；2，2-聯喹啉-4，4-二甲酸二鈉(BCA)蛋白定量試劑盒，二氨基聯苯胺法(DAB)顯色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 實驗儀器 OneTouch Ⅱ型血糖儀(美國強生公司)；Vevo2100型小動物超聲儀(加拿大Visual Sonics公司)；LX-20型全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)；TB718型石蠟包埋機(湖北泰維醫療科技有限公司)；RM2245型石蠟切片機(德國Leica公司)；DYCZ-40D型電泳槽、DYCZ-24DN型電泳槽(北京六一儀器廠)；DS-5M-L1型光學顯微鏡(日本尼康儀器有限公司)。高糖高脂飼料配制：基礎飼料67.5%，蔗糖20%，豬油10%，膽固醇2.5%。

1.4 實驗方法

1.4.1 糖尿病大鼠模型制備、分組與給藥 將50只大鼠按照隨機數字表法分為正常對照組、模型組、銀杏內脂B(GB)低劑量組、GB中劑量組和GB高劑量組，每組10只。正常對照組大鼠給予常規飼料喂養。其余各組大鼠參照沈豪等[6]報道方法，采用高糖高脂飼料喂養4周后，以35 mg/kg劑量腹腔注射1%的STZ制備糖尿病大鼠模型。造模成功判斷標準：注射STZ后24 h、72 h，空腹血糖≥16.7 mmol/L。給藥：正常對照組和模型組每日1次腹腔注射生理鹽水5 mL/kg，GB低劑量組、GB中劑量組、GB高劑量組每日1次腹腔注射6 mg/mL、12 mg/mL、24 mg/mL銀杏內酯B溶液5 mL/kg，療程均為12周。

1.4.2 心功能指標測定 末次給藥24 h后，3 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液實施麻醉后，采用小動物超聲系統取左心室長軸切面，測量左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室收縮末期內徑(LVESD)、左室射血分數(LVEF)，并計算左室短軸縮短率(LVFS)，LVFS(%)=[(LVEDD-LVESD)/LVEDD]×100%，連續測量5個心動周期，取平均值。

1.4.3 血清AST、LDH、CK-MB含量測定 由腹主動脈取血，2 500 r/min離心，離心半徑10 cm，5 min后取血清，采用生化分析儀測定AST、LDH、CK-MB含量。

1.4.4 HE染色觀察心肌組織病理學改變 脊椎脫臼處死大鼠后開胸取心臟，取部分左心室心肌組織置于4%多聚甲醛溶液固定，經石蠟包埋后行4 μm連續切片，取部分石蠟切片按照試劑盒操作說明行常規HE染色，中性樹脂封片后采用顯微鏡觀察心肌組織病理學改變。

1.4.5 天狼猩紅染色法觀察心肌組織病理學改變 取其余心肌組織石蠟切片，按照試劑盒操作說明行天狼猩紅染色，中性樹脂封片后采用顯微鏡觀察各組大鼠心肌間質區和血管壁周圍纖維化狀況。每張切片取5個不重疊的視野，通過Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算膠原容積分數(CVF)，CVF(%)=(膠原面積/視野總面積)×100%。

1.4.6 蛋白免疫印跡法(Western Blotting)檢測心肌組織TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白表達 每只大鼠取50 g左心室心肌組織，加入1 mL裂解液于冰上研磨勻漿，靜置30 min使其充分裂解，取裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心，離心半徑10 cm，20 min后取上清液，BCA法檢測總蛋白濃度，取30 μg蛋白行十二烷基硫酸鈉丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、濕法轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，滴加TGF-β1(1∶800稀釋)、p-Smad2/3(1∶1 000稀釋)、Smad7(1∶1 000稀釋)、GAPDH(1∶1 500稀釋)抗體4 ℃孵育過夜，洗膜后加IgG(1∶3 000稀釋)二抗室溫孵育1 h，洗膜后滴加DAB顯色，應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算條帶灰度值，根據條帶灰度值以GAPDH為內參計算蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 各組大鼠心功能指標比較 與正常對照組比較，模型組大鼠LVEDD、LVESD升高，LVEF、LVFS降低(P<0.01)；與模型組比較，GB中劑量組、GB高劑量組LVEDD、LVESD降低，LVEF、LVFS升高(P<0.05或P<0.01)；與GB低劑量組比較，GB高劑量組LVEDD、LVESD降低，LVFS明顯升高(P<0.05或P<0.01)；GB低劑量組、GB中劑量組、GB高劑量組LVEF比較差異無統計學意義(P>0.05)；GB中劑量組與GB低劑量組、GB高劑量組LVEDD、LVESD、LVFS比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心功能指標比較(±s)

2.2 各組大鼠血清AST、LDH、CK-MB含量比較 與正常對照組比較，模型組大鼠血清AST、LDH、CK-MB含量升高(P<0.01)；與模型組比較，GB中劑量組、GB高劑量組AST、LDH、CK-MB含量降低(P<0.05或P<0.01)；與GB低劑量組比較，GB高劑量組AST、LDH、CK-MB含量降低(P<0.01)；GB中劑量組與GB低劑量組、GB高劑量組AST、LDH、CK-MB含量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠血清AST、LDH、CK-MB含量比較(±s) 單位：U/L

2.3 銀杏內酯B對糖尿病大鼠心肌組織病理學改變的影響 正常對照組大鼠心肌纖維排列有序，心肌細胞結構完整、排列整齊；模型組大鼠可見心肌纖維斷裂，排列紊亂，心肌細胞核固縮深染，大量炎性細胞浸潤等病理學改變；與模型組比較，GB低劑量組、GB中劑量組、GB高劑量組大鼠心肌組織病理學改變呈劑量依賴性減輕，其中GB高劑量組心肌纖維排列整齊，心肌細胞形態基本正常，可見少量炎性細胞浸潤。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色圖(×200)

2.4 銀杏內酯B對糖尿病大鼠心肌間質和血管壁周圍纖維化的影響 正常對照組大鼠心肌間質和血管壁周圍膠原沉積較少，呈細紋狀、均勻分布；模型組大鼠心肌間質區和血管壁周圍膠原沉積明顯增多，膠原條紋增粗、分布不均勻；與模型組比較，GB低劑量組、GB中劑量組、GB高劑量組大鼠心肌間質和血管壁周圍膠原沉積呈現劑量依賴性減少。與正常對照組比較，模型組大鼠心肌間質和血管壁周圍CVF均升高(P<0.01)；與模型組比較，GB低劑量組、GB中劑量組、GB高劑量組大鼠心肌間質區和血管壁周圍CVF均降低(P<0.01)；與GB低劑量組比較，GB中劑量組、GB高劑量組心肌間質和血管壁周圍CVF均降低(P<0.01)；與GB中劑量組比較，GB高劑量組心肌間質和血管壁周圍CVF均降低(P<0.01)。詳見圖2、圖3、表3。

圖2 各組大鼠心肌間質纖維化天狼猩紅染色圖(×200)

圖3 各組大鼠血管壁周圍纖維化天狼猩紅染色圖(×200)

表3 各組大鼠心肌間質和血管壁周圍CVF比較(±s) 單位：%

2.5 各組大鼠心肌組織TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白表達比較 與正常對照組比較，模型組大鼠心肌組織TGF-β1、p-Smad2/3表達上調，Smad7表達下調(P<0.01)；與模型組比較，GB中劑量組、GB高劑量組TGF-β1、p-Smad2/3表達下調，Smad7表達上調(P<0.01)；與GB低劑量組比較，GB中劑量組、GB高劑量組TGF-β1表達下調，Smad7表達上調(P<0.01)，GB高劑量組p-Smad2/3表達下調(P<0.01)；GB中劑量組與GB低劑量組p-Smad2/3表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與GB中劑量組比較，GB高劑量組TGF-β1、p-Smad2/3表達下調，Smad7表達上調(P<0.01)。詳見圖4、表4。

圖4 各組大鼠心肌組織TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白表達條帶圖(A為正常對照組；B為模型組；C為GB低劑量組；D為GB中劑量組；E為GB高劑量組)

表4 各組大鼠心肌組織TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白相對表達量比較(±s)

3 討 論

高血糖所致心肌纖維化為糖尿病心肌病的主要病理機制，也是導致心臟功能降低、心臟器質性病變和糖尿病病人死亡的重要因素之一[7-8]。因此，以抑制心肌纖維化為靶點進行治療對延緩糖尿病心肌病進展至關重要。

糖尿病屬中醫學“消渴”范疇，病機為氣陰兩虛，病程持久致陰損及陽、脾腎陽虛、水濕潴留、瘀血濁毒內停[9]。董麗等[10-11]研究顯示，益氣活血方能降糖調脂，對心功能具有保護作用。銀杏是我國獨有的一種中生代孑遺植物，銀杏果和銀杏葉為傳統中藥品種。其中銀杏葉性平、味苦澀，歸心、肺經，具有活血化瘀、通絡止痛、化濁降脂之功效。銀杏葉主要活性成分銀杏內酯B屬萜類內酯化合物，具有抑制血小板活化、抗氧化、抗炎、抗凋亡等多種生物學活性[12]，近年來其抗纖維化作用逐漸受到關注。本研究結果顯示，銀杏內酯B治療12周能改善糖尿病大鼠心臟功能(降低LVEDD、LVESD，提高LVEF、LVFS)，降低血清AST、LDH、CK-MB含量，減輕心肌組織病理學改變及心肌間質和血管壁周圍纖維化，且呈一定的劑量依賴性。

組織纖維化過程有多種細胞因子、生長因子等參與調控，其中，在哺乳動物細胞中廣泛表達的TGF-β1促進了細胞外基質(extracellular matrix，ECM)表達與沉積，在心肌組織纖維化中發揮著重要的作用[13]。TGF-β1/Smads信號通路在組織纖維化過程中具有重要的調控作用[14]，Smads家族蛋白是TGF-β1的下游靶分子，其中Smad2、Smad3可被TGF-β1誘導磷酸化后結合生成二聚體p-Smad2/3，p-Smad2/3核轉位后與相關基因結合促進ECM轉錄和表達；Smad7與TGF-β1受體結合，發揮抑制纖維化的作用[15]。本研究結果顯示，給予銀杏內酯B治療12周，能下調糖尿病大鼠心肌組織TGF-β1、p-Smad2/3表達并上調Smad7表達，且銀杏內酯B呈一定的劑量依賴性，提示銀杏內酯B對糖尿病大鼠心肌組織TGF-β1/Smads信號通路具有調控作用。

綜上所述，銀杏內酯B對糖尿病大鼠心臟具有保護作用，可能與調控TGF-β1/Smads信號通路，抑制心肌纖維化有關，可為銀杏內酯B作為糖尿病所致心肌纖維化防治候選藥物提供實驗依據，但其作用機制有待進一步研究明確。