堿性成纖維細胞生長因子對高膽紅素血癥新生SD大鼠腦組織Bcl-2、Bax表達的影響

程 皓，陰懷清，王 娟，史瑞玲

高膽紅素血癥是新生兒期常見的疾病，主要是由于膽紅素合成與清除生理不平衡所致。某些情況下，循環(huán)膽紅素水平升高導致急性膽紅素腦病、慢性膽紅素腦病及大腦皮層下結構的永久性神經損傷，早期通過合理喂養(yǎng)、藍光照射或換血等治療可降低血清膽紅素水平，但仍缺乏有效的干預挽救膽紅素所致腦病的神經細胞損傷，從而導致神經發(fā)育異常，遺留智力低下、聽力障礙、癲癇、腦性癱瘓或自閉等后遺癥，嚴重者出現(xiàn)死亡[1-2]。本研究通過對7 d齡新生SD(Sprague Dawley)大鼠腹腔注射膽紅素溶液建立高膽紅素血癥模型，探討外源性堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)能否促進高膽紅素血癥所致腦組織神經細胞損傷的修復，觀察其對神經細胞Bcl-2、Bax表達的影響，從而闡明bFGF可能的腦保護機制，為臨床防治膽紅素腦病提供理論依據(jù)[3]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 膽紅素購自美國MCE公司，注射用bFGF、脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(Tunnel)試劑盒-POD(MK10235)、一抗(Rabbit Anti-Bcl-2、Rabbit Anti-Bax)、二抗(SA1022-兔IgG SABC免疫組化染色試劑盒)購自武漢博士德生物技術公司。檸檬酸緩沖液、乙二胺四乙酸(EDTA)的抗原修復液、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、二氨基聯(lián)苯胺法(DAB)顯色試劑盒等由山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院病理科提供。

1.2 動物模型建立

1.2.1 實驗動物 新生7 d齡的健康清潔級SD大鼠120只(由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供)，體質量10.8～16.2 g，雌雄不限，隨機按窩系、體質量分為3組：正?？瞻讓φ战M(CG組)、高膽紅素血癥組(EG1組)和bFGF干預組(EG2組)，每組40只大鼠。

1.2.2 膽紅素溶液制備 電子天平避光情況下稱取膽紅素晶體50 mg，取1 mL 0.5 mol/L NaOH溶液溶解，量取9 mL雙蒸水倒入，使用0.5 mol/L的稀鹽酸溶液調節(jié)pH值至8.5，得到濃度為5 mg/mL膽紅素溶液，遮光存放，于1 h內使用。

1.2.3 動物模型制作 參照文獻[4]將膽紅素溶液按照100 μg/g注入EG1組、EG2組SD大鼠腹腔中，CG組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水，余條件相同(溫度、濕度適宜的環(huán)境中母鼠哺育)。

1.2.4 動物模型鑒定 肉眼觀察大鼠是否出現(xiàn)異常神經行為，包括活動減少、煩躁、翻滾、俯伏、肢體陣發(fā)性痙攣、對外界刺激的逃避反應減弱等。

1.3 bFGF治療方法 高膽紅素血癥動物模型建立后30 min，EG2組大鼠腹腔注射bFGF溶液，CG組、EG1組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。

1.4 實驗方法

1.4.1 標本采集 將各組新生SD大鼠于6 h、12 h、24 h、48 h、72 h麻醉(5%水合氯醛0.02 mL腹腔注射)，固定于手術臺上，灌洗(暴露心臟、肝臟，肝右葉剪一4 mm左右切口，使用皮試針由心臟搏動明顯處注入無菌生理鹽水和10%甲醛溶液，直至肝右葉流出的液體清亮，可見大鼠口唇、頸部、面色蒼白)，斷頭后使用鑷子等鈍性分離取腦組織，置于10%甲醛溶液中固定約24 h，送至病理科，選取視交叉及其后5 mm處石蠟包埋。

1.4.2 觀察指標 冠狀切片行蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察海馬區(qū)神經細胞形態(tài)結構；免疫組化檢測與HE染色相鄰的切片Bcl-2及Bax表達，Tunnel法檢測細胞凋亡率。實驗流程按試劑盒說明書進行操作。

1.4.3 數(shù)據(jù)采集 應用美國Aperio公司病理切片掃描成像系統(tǒng)，測定所選海馬區(qū)域內所有Bcl-2/Bax免疫陽性細胞灰度值，每張切片標本隨機選取4個視野(×400)，經病理切片掃描成像系統(tǒng)處理(掃描、取圖和分析)，得到選定視野單位面積灰度值的平均值及標準差，其中免疫細胞陽性表達與平均灰度值呈負相關(即logA/B，A=240，B=灰度值)。海馬區(qū)域內神經細胞凋亡數(shù)量應用Tunnel法檢測，計算凋亡率，取平均值。

2 結 果

2.1 大鼠一般行為觀察 模型建立后，CG組大鼠幾乎未見異常神經行為，EG1、EG2組建模6 h后部分大鼠出現(xiàn)神經異常改變，24 h后有煩躁、活動減少、呼吸急促，規(guī)避外界刺激反應減弱，可見翻滾、抽搐、震顫、俯伏，其中俯伏現(xiàn)象多見。隨著時間延長癥狀逐漸加重，EG2組大鼠各時間點均較EG1組神經行為異常改變輕微，EG1組大鼠死亡1只(死亡樣本由同批次建立的預備模型大鼠補充)。

2.2 腦標本大體觀察 EG1組、EG2組新生SD大鼠海馬區(qū)、小腦可見散在黃染程度不同的區(qū)域。

2.3 HE染色結果 CG組海馬區(qū)可見神經元排列整齊，細胞結構清楚，形態(tài)正常，小泡密集。EG1組神經細胞胞體及胞核固縮，部分細胞核破裂、溶解、消失，小膠質細胞及少突膠質細胞增多。EG2組神經細胞細胞核形態(tài)欠規(guī)則，膜結構皺縮、破裂較EG1組減少，小膠質細胞及少突膠質細胞未見減少。詳見圖1。

圖1 各組不同時間新生SD大鼠海馬區(qū)病理圖(HE，×400)

2.4 bFGF對神經細胞Bcl-2/Bax表達的影響 免疫組化檢測神經細胞免疫陽性表達，鏡下可見棕黃色顆粒。

2.4.1 Bcl-2 CG組Bcl-2陽性表達極少；EG1組于6 h可見增加，24 h、48 h漸增，72 h達高峰；EG2組同時間點Bcl-2陽性表達較EG1組明顯增多，且均多于CG組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1、圖2。

表1 各組不同時間Bcl-2表達灰度值比較(±s)

圖2 各組不同時間新生SD大鼠海馬區(qū)Bcl-2表達免疫組化圖(DAB，×400)

2.4.2 Bax CG組Bax陽性表達極少；EG1組于6 h增加，之后逐漸增多，72 h達高峰；EG2組同時間Bax陽性表達較EG1組減少，但多于CG組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2、圖3。

表2 各組不同時間Bax表達灰度值比較(±s)

圖3 各組不同時間新生SD大鼠海馬區(qū)Bax表達免疫組化圖(DAB，×400)

2.5 各組不同時間神經細胞凋亡情況比較 CG組凋亡細胞極少，EG1組6 h可見凋亡細胞，之后凋亡細胞逐漸增多，同時間EG1組凋亡細胞多，EG2組凋亡細胞少，但均多于CG組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表3、圖4。

表3 各組不同時間神經細胞凋亡情況比較(±s) 單位：%

圖4 各組不同時間SD新生大鼠海馬區(qū)細胞凋亡顯微鏡圖(DAB，×400)

3 討 論

黃疸是新生兒時期普遍存在的一種良性疾病，是新生兒正常生長發(fā)育過程中出現(xiàn)的癥狀，主要臨床表現(xiàn)為鞏膜黃染及皮膚黏膜黃染，也是某些疾病的表現(xiàn)，是新生兒出生1周后住院的主要原因。膽紅素產生多(新生兒脫離宮內低氧環(huán)境適應外界，體內相對較多的紅細胞被破壞及新生兒紅細胞壽命本身較短)、代謝不平衡(新生兒時期肝細胞功能不成熟，結合、攝取及排泄膽紅素能力低下)引起血清非結合膽紅素(UCB)水平增加[5]，臨床表現(xiàn)為黃疸。相關研究顯示，腦組織中UCB作用具有雙面性，適合濃度的UCB是一種有效的抗氧化劑，其能提供共軛雙鍵和活性氫原子清除活性氧和活性氮等細胞毒性自由基，然而發(fā)生高膽紅素血癥時血清UCB達到神經毒性濃度，形成穩(wěn)定的膽紅素自由基，導致脂質過氧化損傷，破壞的生物膜主要是細胞膜及線粒體膜，引起細胞吞噬、細胞間信號識別障礙甚至出現(xiàn)細胞凋亡；UCB可刺激促炎因子釋放；UCB引起髓鞘堿性蛋白丟失，導致髓鞘形成不足；由神經營養(yǎng)因子及神經生長因子誘導的促生存信號激活可被UCB抑制；UCB可激活Caspase-3、Bcl-2、Bax凋亡蛋白，導致神經細胞凋亡，造成中樞神經系統(tǒng)不可逆損傷，即膽紅素腦病[6-7]。有研究顯示，7 d齡SD大鼠腦發(fā)育組織學與人類妊娠32～34周早產兒相似[8]。

本研究將bFGF溶液經腹腔注射于7 d齡SD大鼠建立高膽紅素血癥模型。高膽紅素血癥腦損傷后神經細胞凋亡由Bcl-2基因家族控制，根據(jù)結構同源性分為3類：抗凋亡蛋白(包括Bcl-2)、促凋亡蛋白(包括Bax和Bak)及bh3蛋白。Bcl-2蛋白通過阻止線粒體破壞及之后釋放的細胞色素C和Caspase激活抑制細胞凋亡；細胞死亡信號引起促凋亡蛋白Bax發(fā)生構象改變，進入并聚集于線粒體外膜，導致線粒體外膜通透性增加，致使其喪失正常功能并釋放凋亡因子，最終發(fā)生細胞凋亡[9-10]，造成不可逆損傷。本研究結果顯示，與CG組比較，各組間Bcl-2和Bax表達均升高，其中EG1組6 h即出現(xiàn)神經細胞Bcl-2陽性表達增多，之后表達持續(xù)增多，于72 h穩(wěn)定高值；神經細胞Bax陽性表達呈升高趨勢，72 h達高峰；Tunnel法測定的凋亡指數(shù)與Bcl-2、Bax增加趨勢一致，證實了Bcl-2的抗凋亡作用及Bax的促細胞凋亡作用。

bFGF在中樞神經系統(tǒng)高表達，對不同中樞神經系統(tǒng)疾病具有神經細胞的保護和促修復作用。黃俊杰等[11]研究顯示，bFGF可促進血管內皮細胞有絲分裂及血管增生，擴張血管，增加腦損傷部位血流量，改善缺血缺氧，氧自由基生成量減少；缺血缺氧導致腦損傷，增加該區(qū)域血腦屏障通透性，bFGF能穿透血腦屏障進入腦組織與神經細胞膜上bFGF受體結合，降低Bax/Bcl-2轉錄比值，神經細胞凋亡被抑制，使凋亡相關基因的表達受到影響，從而保護神經細胞。有研究顯示，在全腦缺血/再灌注損傷中，bFGF通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑抑制過度自噬，并通過阻止線粒體p53易位抑制細胞凋亡，在海馬CA1區(qū)域保護神經細胞，改善大腦功能[12-13]。bFGF是一種分泌蛋白，屬于成纖維細胞生長因子(FGF)家族，幾乎在每個組織均有表達，在生理和病理條件下參與細胞增殖、分化、遷移，血管生成和細胞存活[14]。

目前已鑒別出22種FGF配體，按照結構和功能相似性分為幾個亞科，與4個FGF膜結合受體之一結合，信號機制與RAS/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酶y(PLCy)通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)相近[15]。本研究觀察bFGF抗神經細胞凋亡的作用，與CG組相比，EG1組和EG2組Bcl-2表達增加，Bax表達減少，海馬區(qū)神經細胞凋亡指數(shù)減少。提示bFGF對血清高濃度膽紅素造成的神經細胞損傷有一定的保護作用，為膽紅素腦病的靶向治療提供了新方向。

綜上所述，bFGF對高膽紅素血癥所致的腦損傷具有保護作用，可抑制神經細胞凋亡，修復損傷的神經細胞，為新生兒高膽紅素血癥的臨床防治提供新思路。