慢性心力衰竭病人血清miR-199a、ANP表達與心功能及預后的關系探討

詹 洮，顏 治，吳佳莉

慢性心力衰竭是一種持續的心力衰竭狀態，臨床癥狀為呼吸困難、乏力及體液潴留等，是多種心血管疾病嚴重階段或終末期的臨床表現。流行病學研究顯示，慢性心力衰竭發病率為1.3%～5.6%，且隨著年齡增長發病率呈升高趨勢[1]。心鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)又稱為心鈉素，主要是由心肌細胞合成、貯存及釋放的，可發揮抑制血管升壓素和血管緊張素的作用，具有利尿排鈉、擴張血管、降低血壓等功能。有研究顯示，ANP水平可反映血漿容量及心房壓力，可能參與慢性心力衰竭病人的病情發展[2]。微小RNA(mircoRNA，miRNA)在誘導心肌細胞增殖及再生過程中發揮著重要的作用。有研究顯示，miR-199a-3p異位表達可誘導新生大鼠心肌細胞生長、增殖，其過表達可促進成年小鼠心肌細胞增殖，刺激小鼠急性心肌梗死后心肌細胞再生[3]，目前關于miR-199a在慢性心力衰竭病人中表達情況及其與預后的關系報道較少。本研究分析慢性心力衰竭病人血清miR-199a、ANP表達水平與心室重構及病人預后的關系，以期為臨床診斷慢性心力衰竭提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年3月—2019年6月于我院收治的慢性心力衰竭病人87例為研究組，所有病人均符合《中國心力衰竭診斷和治療指南2014》[4]中慢性心力衰竭的診斷標準，其中男56例，女31例；年齡45～76(61.27±6.89)歲。入組病人均經臨床病理檢查或多普勒超聲心動圖確診。納入標準：心力衰竭癥狀持續時間>6個月；年齡<80歲；臨床資料完整。排除標準：合并惡性腫瘤或血液系統疾病；合并感染性疾病；合并精神障礙、意識不清，不能配合完成檢查。根據美國紐約心臟病協會(NYHA)分級標準[5]將慢性心力衰竭病人分為心功能Ⅱ級28例，Ⅲ級34例，Ⅳ級25例。同期選取與研究組年齡、性別匹配的健康體檢者40名為對照組，其中男26名，女14名；年齡43～74(60.62±7.13)歲，經多普勒超聲心動圖檢查明確心肌結構完整、心功能無異常。兩組年齡、性別比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集 收集并比較所有研究對象一般資料，包括年齡、性別、身高、體重，計算體質指數(body mass index，BMI)，實驗室檢查指標，高血壓史、糖尿病史、高脂血癥史、吸煙史、飲酒史、入院時美國國立衛生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)評分以及血管緊張素轉換酶抑制劑、免疫制劑等藥物服用史等。

1.2.2 血液樣本采集 抽取所有研究對象晨起空腹靜脈血4 mL，以3 000 r/min離心10 min后取上清液于干凈EP管中，寫好編號，置于-20 ℃保存，待測。采用化學發光法檢測血清ANP水平，采用酶聯免疫吸附法檢測血清腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)水平。試劑盒均購自上海聯邁生物工程有限公司，檢測方法嚴格按照試劑盒說明書步驟執行。

1.2.3 熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測血清miR-199a水平 首先使用Trizol試劑盒(購自Invitrogen公司)提取總RNA，利用紫外分光光度計(購自賽默飛公司)檢測RNA濃度和純度。利用反轉錄試劑盒(購自TAKARA公司)進行cDNA合成，實時熒光定量PCR試劑盒(購自TAKARA公司)進行PCR擴增，以U6為內參，由生工生物工程有限公司合成。引物序列：miR-199a正向引物5′-ACAGTAGTCTGCACATTGTTTA-3′，反向引物5′-GTGCGTGTCGTGGAGTC-3′；U6正向引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，反向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′。PCR反應循環條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸35 s，共40個循環。利用2-△△Ct法計算miR-199a相對表達量。

1.2.4 超聲心動圖檢查 采用PHILIPS iU Elite彩色多普勒超聲診斷儀對研究組病人進行超聲心動圖檢查，心功能指標主要包括左室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)、左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)。

1.2.5 隨訪 觀察所有慢性心力衰竭病人入院后12個月內不良心血管事件發生情況，以發生不良心血管事件再次入院或全因死亡為終點事件，將所有病人分為發生組和未發生組。其中不良心血管事件包括納入時未發生但在隨訪過程中發生或隨訪過程中出現的各種心臟疾病；全因死亡是指在隨訪過程中出現的任何原因的死亡事件。比較兩組血清指標和心功能指標。

2 結 果

2.1 兩組臨床資料比較 研究組入院時NIHSS評分高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 研究組和對照組血清miR-199a、ANP、BNP及心功能指標比較 與對照組比較，研究組血清miR-199a、ANP、BNP水平及LVEDD均升高(P<0.05)，LVEF降低(P<0.05)；Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級慢性心力衰竭病人血清miR-199a、ANP、BNP水平及LVEDD逐漸升高，LVEF逐漸降低，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 研究組和對照組血清miR-199a、ANP、BNP及心功能指標比較(±s)

2.3 終點事件發生組和未發生組血清miR-199a、ANP、BNP及心功能指標比較 隨訪12個月后，發生終點事件36例，未發生51例。終點事件發生組血清miR-199a、ANP、BNP水平及LVEDD均高于未發生組(P<0.01)，LVEF低于未發生組(P<0.001)，差異有統計學意義。詳見表3。

表3 終點事件發生組和未發生組血清miR-199a、ANP、BNP及心功能指標比較(±s)

2.4 慢性心力衰竭病人血清miR-199a、ANP水平與BNP、心功能指標的相關性分析 慢性心力衰竭病人血清miR-199a、ANP水平與BNP、LVEDD均呈正相關(P<0.05)，與LVEF均呈負相關(P<0.05)。詳見表4。

表4 慢性心力衰竭病人血清miR-199a、ANP水平與心功能指標的相關性分析

2.5 血清miR-199a、ANP、BNP水平預測慢性心力衰竭病人預后不良的臨床價值 ROC分析結果顯示，血清miR-199a、ANP、BNP水平預測慢性心力衰竭病人預后不良的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.802[95%CI(0.703，0.880)]，0.870[95%CI(0.781，0.933)]，0.807[95%CI(0.709，0.884)]，截斷值分別為1.78，464.78 pg/mL，683.26 pg/mL，靈敏度分別為75.00%、83.33%、69.44%，特異度分別為80.39%、76.47%、89.00%。詳見圖1。

圖1 血清miR-199a、ANP、BNP水平預測慢性心力衰竭病人預后不良的ROC曲線圖

2.6 慢性心力衰竭病人預后不良的影響因素分析 以慢性心力衰竭病人是否發生終點事件為因變量(發生=1，未發生=0)，以miR-199a>1.78(是=1，否=0)、ANP水平>464.78 pg/mL(是=1，否=0)、BNP水平>683.26 pg/mL(是=1，否=0)、心功能分級(Ⅱ級或Ⅲ級=1，Ⅳ級=0)為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，miR-199a>1.78、ANP>464.78 pg/mL、BNP>683.26 pg/mL、心功能分級加重是影響慢性心力衰竭病人預后不良的獨立危險因素。詳見表5。

表5 慢性心力衰竭病人預后不良的影響因素分析

3 討 論

慢性心力衰竭主要是由心肌梗死、心肌病、炎癥等引起的心肌損傷，慢性心力衰竭發生時，左心室負荷加重，心功能惡化，左心室排出的動脈血不能滿足身體需要，引起其他系統代償性增加，加重心力衰竭癥狀[6]。因此，心力衰竭的早期診斷及治療已成為心血管疾病臨床工作的重要內容。

有研究顯示，miRNAs是一類由18～22個氨基酸組成的非編碼小基因片段，通過與靶基因3′-非翻譯區結合，阻止信使RNA(mRNA)翻譯或通過促進mRNA降解調控蛋白表達。多項研究顯示，miR-199a與多種癌癥如胃癌、卵巢癌等有關[7-8]。有研究顯示，miR-199a是心肌細胞自噬的負調控因子[9]。本研究結果顯示，慢性心力衰竭病人血清miR-199a水平高于對照組，且隨心功能分級加重，miR-199a水平呈上升趨勢，提示miR-199a可能參與慢性心力衰竭的發生發展過程，但具體機制尚未明確。郝丹等[10]研究顯示，在自發性高血壓大鼠(SHR)心肌損傷模型中，SHR組大鼠miR-199a mRNA水平高于正常對照組和miR-199a抑制劑組，左室質量(LVM)、左室質量指數(LVMI)增加，提示miR-199a可能參與高血壓誘導的左心室心肌肥厚；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是miR-199a的靶基因之一，進一步轉染實驗發現，miR-199a可能通過負調控mTOR表達參與SHR左心室肥厚、心肌纖維化的發生發展進程。本研究結果顯示，血清miR-199a與心功能指標LVEDD呈正相關，與LVEF呈負相關，終點事件發生組病人血清miR-199a水平高于未發生組，提示miR-199a可能與慢性心力衰竭病人預后有關，心肌受損越嚴重提示病人預后越差。

有研究顯示，ANP作為心血管功能的主要調節因子，在慢性心力衰竭中發揮著重要的作用[11]。ANP主要在心房中合成分泌，可抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)，舒張血管，降低血壓，改善心功能[12]。慢性心力衰竭發生時，ANP分泌增加，屬于機體代償反應，可減輕心臟負荷。郭永正等[13]研究顯示，心力衰竭時線粒體形態功能改變，造成大量活性氧聚集，心肌細胞正常功能受損，進一步研究顯示，ANP通過上調線粒體融合相關蛋白OPA1表達，抑制線粒體分裂，從而改善后負荷引起的心肌重構及心功能不全。近年來，已有心力衰竭相關指南推薦將BNP作為評估急慢性心力衰竭病人心功能障礙的有效生物學指標[14-15]。本研究結果顯示，慢性心力衰竭病人ANP、BNP水平高于對照組，提示ANP水平高表達可能與慢性心力衰竭發生有關。與未發生組比較，終點事件發生組血清ANP、BNP水平呈高表達，LVEDD升高，LVEF降低，且ANP水平與BNP、LVEDD呈正相關，與LVEF呈負相關，提示ANP水平變化與慢性心力衰竭病人不良預后有關。進一步ROC結果顯示，血清miR-199a、ANP、BNP水平預測慢性心力衰竭病人預后不良的AUC分別為0.802，0.870，0.807，提示血清miR-199a、ANP、BNP對慢性心力衰竭病人預后不良有一定的預測價值。Logistic回歸分析結果顯示，miR-199a>1.78、ANP>464.78 pg/mL、BNP>683.26 pg/mL、心功能分級是影響慢性心力衰竭病人預后不良的獨立危險因素。監測慢性心力衰竭病人血清miR-199a、ANP、BNP水平變化可判斷病情發展，對及早制定干預措施和改善病人預后具有一定的臨床意義。

綜上所述，慢性心力衰竭病人血清miR-199a、ANP均高于健康人群，其水平隨著心功能加重呈升高趨勢，且與病人不良預后有關，血清miR-199a、ANP水平升高是慢性心力衰竭病人預后不良的獨立危險因素，提示miR-199a、ANP可能參與慢性心力衰竭的發生發展過程，可作為提示慢性心力衰竭病人預后不良的潛在血清學指標。慢性心力衰竭受多因素、多信號途徑共同影響，今后仍需開展大樣本量多中心研究對本研究結果進行驗證。