攜載丹酚酸B的絲素蛋白支架修復大鼠顱骨缺損的研究

陸家琪，李曉林

(上海交通大學附屬第六人民醫院骨科，上海 200233)

近年來骨科技術飛速發展，但大面積骨缺損仍是骨科手術亟待解決的一大難題[1]。目前，治療的金標準仍然是自體骨移植[2]。然而，自體骨在大的骨缺損應用中受到許多限制，如繼發性創傷、疼痛、移植來源受限等[2]。同種異體骨和異種骨移植雖然克服了自體骨移植的缺點，但因排斥反應的可能性大、疾病的潛在傳播，使其在臨床應用上受到阻礙[2-3]。

近年來由于組織工程技術的發展，人工骨材料得到了廣泛的研究。三維多孔支架為種子細胞提供一個模板來刺激細胞增殖和分化，同時相互連接的孔結構，允許營養物質進入支架[1，4]。多孔絲素蛋白(silk fibroin，SF)由于具有良好的生物相容性和可降解性，在骨組織工程領域引起了越來越多的關注[5]。然而，較弱的成骨誘導活性阻礙了絲素蛋白的進一步應用[6-7]。丹酚酸B(salvianolic acid B，SB)是丹參提取物中的主要生物活性成分，顯示多種生物學效應，目前臨床已將其用于治療缺血再灌注損傷、腎損傷、肝損傷和神經系統等疾病[8-10]。最近的研究表明，SB能夠通過促進成骨和成血管作用減輕糖皮質激素誘導的大鼠骨質疏松，并通過細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)信號途徑提供成骨細胞的堿性磷酸酶活性[11]。然而，關于SF裝載SB對骨缺損的修復尚缺乏詳盡的研究。

本研究通過不同劑量的SB被均勻地滴加到絲素蛋白溶液中并通過冷凍凍干方法形成多孔支架；通過研究SB的成骨分化以及在骨缺損修復中的作用，為加載SB的SF組織工程支架修復骨缺損提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 主要試劑：基礎培養基(minimum essential medium α，MEM-α)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、1%青霉素-鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；細胞增殖及毒性檢測(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒購自日本Dojindo公司；堿性磷酸酶活性試劑盒購自南京建成生物公司；Triton X-100購自北京索萊寶公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；PrimeScriptTM RT試劑盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒均購自日本Takara公司。

主要設備：掃描電鏡(日本日立公司)、多功能酶標儀(美國美谷分子儀器公司)、倒置顯微鏡(德國萊卡公司)、Micro-CT(Skyscan 1176，美國Bruker公司)、硬組織切片機(SP1600，德國徠卡公司)。

1.2 含有不同劑量SB的多孔SF支架的制備 首先，根據文獻報道合成SF[12]。然后將0.2 mg、1 mg和5 mg的SB分別加入5 mL的二次蒸餾水(dd H2O)中，待充分溶解后將0.5 g的SF分別加入不同質量濃度的SB溶液中，4℃條件下磁力攪拌1 h，單純的SF當作對照組。然后，分別將40 μL 和200 μL混合溶液分別加入直徑為5 mm和10 mm的圓柱形模具中，-20℃過夜后在-60℃下凍干獲得含有不同質量濃度SB的SF多孔支架，即低濃度支架(SF/LSB)、中濃度支架(SF/MSB)和高濃度支架(SF/HSB)。支架在進行體外及體內實驗前通過γ-射線輻照滅菌。

1.3 SB在SF多孔支架中的釋放 為了多孔SF支架中SB的釋放，將一個直徑為10 mm的樣品浸入2 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中，并在37℃條件下以100 rpm的轉速在搖床上搖動。在指定的時間點(1 d、3 d、7 d、10 d、14 d、20 d、30 d)，從離心管中獲得1 mL PBS，并添加1 mL新鮮的PBS[13]。在酶標儀286 nm的波長下評估SB的釋放。根據SB的標準濃度曲線，計算SB釋放百分比。每組實驗重復3次。

1.4 條件培養基對rBMSCs細胞增殖的影響 據文獻報道提取SD大鼠骨髓間充質干細胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells，rBMSCs)，P3～4代用于細胞實驗[13]。

將一個直徑為10 mm的支架放入37℃條件下的標準MEM-α培養基中浸泡10 d，10 d后收集四組不同質量濃度支架組的條件培養基并用于后續的細胞培養，收集的條件培養基放置在4 ℃冰箱保存7 d。

將含有2×103細胞的細胞懸液(200 μL)添加到96孔板中，次日更換條件培養基在37℃細胞培養箱中繼續培養1 d、3 d和7 d，每3天換液1次。采用CCK-8試劑來評估體外不同濃度SB的條件培養基對細胞增殖的影響[14]。

1.5 rBMSCs細胞堿性磷酸酶活性 為了評估含有不同濃度SB的條件培養基對rBMSC早期成骨分化的影響，8×103細胞接種于24孔板上并分別培養7d和14d，每3天換液1次。在預定的時間，使用200 uL 0.2% Triton X-100裂解細胞并在4℃條件下14 000 rmp離心15 min，根據堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性試劑盒操作指南將50 μL上清液加入150 μL的工作液中，用酶標儀在450 nm處測量吸光度，測定ALP存在時對硝基苯磷酸鹽向對硝基苯酚的轉化[14]。每組實驗重復操作3次。

1.6 rBMSCs細胞的茜素紅染色 為了評估含有不同濃度SB的條件培養基對rBMSC晚期成骨分化的影響，8×103細胞接種于24孔板上并分別培養21 d，每3天換液1次。在預定的時間，使用4%的多聚甲醛固定細胞并在說明書指導下，根據茜素紅S(alizarin red S，ARS)染色試劑盒操作指南將200 uL茜素紅染色液加入24孔板中，用光學顯微鏡拍照記錄，收集數據。每組實驗重復操作3次。

1.7 rBMSCs細胞成骨相關基因的表達 將rBMSCs按5×104/孔接種在6孔板中，并在條件培養基中培養7 d。采用RT-PCR法檢測不同濃度SB對rBMSCs成骨基因表達的影響。以GAPDH mRNA作為對照組，獲得Ct值進行數據分析。利用交點法計算得到Ct值，即通過擴增曲線與閾值線的交點來計算Ct值。相對定量的分析結果要通過△△Ct法進行數據分析，目的基因相對于內參基因的表達量為2ΔCt=2Ctm-Ctn，各組樣本基因之間的表達量差異數據分析則通過2ΔΔCt=2ΔCt1-ΔCt2計算，繪制柱狀圖分析結果[13]。所有樣品一式三份進行測試。

1.8 SD大鼠顱骨缺損模型 如文獻報道所述根據SD大鼠顱骨骨缺損的手術模型建立標準的臨界性骨缺損模型[13]。簡而言之，應用0.5%的戊巴比妥鈉按9 mL/kg體重通過腹腔內注射麻醉6只250～300 g的SD雄性大鼠，在頭皮正中進行1.5 cm左右的矢狀切口，切開筋膜，用小的骨膜剝離子將顱骨表面骨膜剝向兩側暴露“人”字縫，接著在“人”字縫的近端用直徑5 mm的牙科環鉆在矢狀縫的兩側顱骨表面各鉆出直徑5 mm的全層顱骨缺損。隨后將兩組直徑5 mm厚度約2 mm經過γ射線滅菌的多孔支架分別植入缺損區，一側植入SF/MSB支架，另一側植入SF支架作為對照，逐層縫合骨膜、皮下組織及皮膚。術后3 d肌肉注射青霉素鈉4萬單位預防感染。在大鼠顱骨缺損手術后的2周、4周和6周，分別通過腹腔內注射鹽酸四環素(tetracycline，TE，25 mg/kg體重)，茜素紅(alizarin red，AL，30 mg/kg體重)和鈣黃綠素(calcein，CA，20 mg/kg體重)標記新骨再生[1]。

1.9 Micro-CT分析缺損區新骨再生 使用Micro-CT掃描成像分析系統評價大鼠顱骨缺損區新骨再生。骨組織標本掃描的層厚為18 μm，經過Micro-CT掃描后直接獲得其斷層掃面的圖片，利用Micro-CT系統配套的軟件進行相關三維圖像的重建和具體數據指標的分析。利用CT-Vol軟件構建其三維重建骨組織圖片；依次利用DataViewer軟件和CT-An軟件選定的層面范圍內逐層手工選擇顱骨缺損內感興趣區域，調整參數對植入支架范圍內的骨生成情況進行定量分析，自動計算確定骨礦物質密度(bone mineral density，BMD)，骨體積分數(bone volume/tissue volume，BV/TV)[14]。

1.10 硬組織切片及染色分析骨再生 顱骨標本在10%中性福爾馬林固定液中固定48 h后，酒精梯度脫水(70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%-Ⅰ及100%-Ⅱ)，連續兩次無水乙醇脫水后將標本放入純的二甲苯中透明2 h，然后包埋在聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA)中。包埋成功后，使用硬組織切片機將顱骨標本縱向切片切成150～200 μm厚的切片，然后使用502膠粘到塑料載玻片上并用砂紙打薄、拋光至約50 μm厚度。使用共聚焦激光掃描顯微鏡(confocallaser scanning microscope，CLSM，Leica)檢測切片并進行圖像采集和數據分析連續三色序列熒光標記礦化的骨組織[14]。

將切片用van Gieson’s染色以評價顱骨缺損區新骨形成，紅色區域代表再生的新骨組織，黑色區域代表支架殘留。通過Image Pro 5.0系統(Media Cyber netics，Rockville，MD，USA)采集圖像，在4個隨機選擇的切片上定量評價新骨形成的面積[13]。

2 結 果

2.1 SF支架的結構以及SB在SF多孔支架中的釋放 根據圖1可以看到SF支架呈多孔互連結構。SpectraMax M2酶標儀(OD 286 nm)用于測定溶液中SB的含量以及用于計算SB釋放百分比。釋放結果顯示，三組含有不同質量濃度SB的SF支架顯示類似的釋放曲線。如圖2所示，第1天PBS中的SB從支架中的釋放百分比分別約為42.32%、40.40%和39.73%；在第10天SB的釋放達到頂峰，三組支架的釋放百分比分別約為79.63%、79.49%和80.14%。隨后，SB的釋放速率顯著減慢；第30天時，三組支架中SB的累積釋放百分比約為85%。這些結果表明，SB的釋放在前10天迅速，然后逐漸減慢。

圖1 掃描電鏡下的SF多孔結構 圖2 SB在SF多孔支架中的緩釋結果

2.2 條件培養基促進rBMSCs增殖 根據SB的釋放試驗顯示三組含有不同含量SB的SF支架條件培養基中SB的濃度分別約為0.89 μM、4.42 μM和22.30 μM。CCK-8細胞增殖實驗結果顯示SB以濃度依賴性的方式促進rBMSCs的增殖，但是SF/MSB和SF/HSB組間比較差異無統計學意義(見表1)；另外，細胞在條件培養基中培養7d時可觀察到SF/HSB組細胞增殖較SF/MSB組慢，這一現象可能與培養基中SB的濃度較高，有一定毒性有關。

表1 不同濃度SB條件培養基的rBMSCs細胞增殖實驗結果

2.3 SB條件培養基促進rBMSCs早期成骨分化 隨著培養時間的延長，rBMSCs細胞在條件培養基中培養14d時ALP的活性較培養7 d時明顯增高；但是ALP活性定量檢測顯示SF/MSB和SF/HSB兩組間差異無統計學意義(見表2)。這一結果說明SB能夠明顯地促進rBMSCs的早期成骨分化，并且在一定范圍內呈劑量效應關系。

表2 條件培養基培養后rBMSCs細胞ALP活性表達

2.4 SB條件培養基促進rBMSCs晚期成骨分化 rBMSCs細胞在條件培養基中培養21 d時ARS的活性檢測結果見圖3，在SF中加入不同濃度的SB可以促進鈣結節的形成，但是對于鈣結節陽性區域面積統計分析發現：SF/LSB和SF/MSB兩組間差異無統計學意義(見表3)。這一結果說明SB能夠明顯地促進rBMSCs的早期成骨分化，并且在一定范圍內呈劑量效應關系。

圖3 紅色塊狀結節為成骨分化晚期得到的鈣結節(茜素紅染色，×100)

表3 條件培養基培養后rBMSCs細胞ARS活性表達

2.5 SB條件培養基促進rBMSCs成骨相關基因的表達 為了進一步證實SB對rBMSCs細胞成骨分化的影響。我們通過PCR檢測了成骨過程中幾個重要的標記基因如ALP、I型膠原(collagen I，COL1)、成骨特異性轉錄因子(runt-related transcription factor 2，RUNX2)和骨鈣素(osteocalcin，OCN)。表4顯示，與單純的SF組相比，含有SB組培養的rBMSCs的成骨相關基因表達均上調，并且SF/MSB和SF/HSB組較SF/LSB組成骨相關基因的表明均明顯增高(P<0.05)。但是，SF/MSB和SF/HSB組間差異沒有統計學意義(P>0.05)。PCR檢測結果進一步說明了SB能夠促進rBMSCs的成骨分化。

表4 SB條件培養基對rBMSCs細胞成骨分化相關基因表達的影響

2.6 Micro-CT分析SF/MSB促進骨再生 體外結果顯示攜載SB的SF多孔支架能夠明顯地促進rBMSCs的成骨分化，為了進一步驗證SF/SB支架在體內對骨再生的作用，我們將SF/MSB多孔支架植入大鼠體內8周。8周后從Micro-CT三維重建影像正面、背面以及橫斷面可以明顯地觀察到攜載SB的SF支架能夠更好地促進局部缺損區的新骨再生(見圖4a)；缺損區Micro-CT定量分析結果也顯示SF/MSB組BV/TV(36.91±4.35)%明顯高于SF組的BV/TV(5.44±1.33)%，P<0.05(見圖4b)；BMD在SF/MSB組(0.45±0.06)g/cm3顯著高于SF組(0.08±0.03)g/cm3，P<0.05(見圖4c)。Micro-CT結果進一步證明了SB不僅可以在體外促進rBMSCs的增殖和成骨分化，還可以在體內促進骨再生。

a 三維影像的正面、背面及橫斷面

b 缺損區新骨百分比 c 缺損區骨密度圖4 組間骨再生Micro-CT定量分析比較

2.7 序列熒光標記新骨礦化 序列熒光標記技術是一種標記礦化組織和評價骨再生過程中新骨礦化的時間進程的技術。在不同時間點注射不同的鈣結合染料觀察骨再生。雖然礦化骨組織百分比較低，但SF/MSB組在2周(TE黃，早期成骨)和4周(AL紅，新骨礦化最活躍階段)的熒光陽性面積明顯大于SF組(見圖5)。6周后(CA綠)，SF/MSB組較4周時礦化度未見顯著升高，提示骨改建階段，但SF/MSB組仍明顯高于SF組(見圖6)。

圖5 序列熒光標記新骨再生 圖6 組間熒光面積定量分析比較

2.8 硬組織切片染色 為了進一步證實SB在體內對新骨再生的影響，我們采用van-Gieson骨膠原染色對缺損區新生骨形成進行分析。在van Gieson染色切片中，我們發現SF/MSB組有更多的新骨形成(37.35±5.25)%(見圖7)。相比之下，SF組缺損區邊緣有少量的新生骨(8.24±1.71)%，定量分析顯示兩組間差異有統計學意義(P<0.05，見圖8)。

圖7 紅色以及紅褐色區域為骨膠原陽性區域(VG染色，×50)

圖8 組間VG染色定量分析比較

3 討 論

這項研究驗證了具有生物活性功能的SB可以從多孔SF支架中緩慢釋放。體外細胞和體內動物實驗結果表明多孔SF支架中釋放的SB可以促進rBMSCs的成骨分化和增強多孔SF支架修復顱骨缺損。我們的結果證明SB可能是一個潛在的生物活性藥物，促進骨再生。

目前，多孔SF因其優異的生物相容性、可降解性得到了越來越多的研究，特別是作為骨組織工程支架[5]。然而，由于缺乏生長因子等骨誘導因素，單純的SF支架在動物體內植入后新骨形成受到限制[6-7]。考慮到骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP2)等生長因子的副作用，越來越多的研究轉向于發展具有低生物毒性可替代的成骨誘導活性分子[15-16]。SB已被證明是一種具有生物活性的植物分子，具有骨誘導作用，具有血管生成作用和低細胞毒性[11]。本研究結果顯示，丹酚酸B在多孔SF支架中釋放穩定，但10d后釋放動力學逐漸降低。根據SB的累積釋放曲線我們注意到，SB在低、中、高濃度下的釋放曲線非常相似，這表明了相似的釋放曲線和穩定性。在本研究中約80%的SB在前10天內從支架中釋放，比之前的研究結果略高[17]，這可能與不同成分的運輸載體有關。先前的細胞研究報道顯示0.1～5 μM的SB能夠促進干細胞的成骨分化[11]；本研究中，SF/LSB組、SF/MSB組和SF/HSB組在浸泡10 d后條件培養基中的SB最終濃度分別約為0.89、4.42和22.30 μM；成骨分化檢測結果顯示和之前的研究一致，并且我們發現SF/HSB組和SF/MSB組相比并沒有顯著促進rBMSCs的成骨分化。在我們的實驗中顯示22.30 μM的SB相比4.42 μM的SB沒有進一步促進rBMSC細胞的成骨分化，可能與高濃度的SB對細胞分化產生一定的抑制作用相關，另外在細胞增殖實驗也觀察到類似的趨勢，結果說明高濃度的SB對細胞增殖可能會存在抑制作用進而抑制成骨分化。此外需要指出的是，由于類似的PH值，SB釋放到條件培養基中的濃度是根據SB從SF支架釋放到PBS中推測出來的。但需要注意的是，由于培養基與PBS的化學成分不同，可能導致SB的有效濃度略有差異[17]。總之，本研究證實了從SF支架中緩釋出來的SB能夠顯著促進rBMSCs的增殖和成骨分化。

盡管體外已經證實SB能夠促進干細胞成骨分化，但體內骨再生是評估生物材料是否可以植入體內的重要標準[18]。雖然SB在臨床上已經作為多種疾病的治療用藥[19]，并且一些動物實驗研究發現SB可以改善去勢后大鼠的骨質疏松表型[20]。然而，目前將局部緩釋的SB用于松質骨缺損有相關報道[17]，而用于皮質骨缺損修復的相關研究還較少。在本研究中，體內實驗沒有研究SB的局部釋放，但是從Micro-CT影像學檢查、序列熒光標記和骨膠原染色都進一步證實了載有SB的多孔SF支架可以明顯增強皮質骨缺損的骨修復。這一結果進一步說明了SB不僅可以在體外促進成骨分化，還可以促進骨缺損的修復，為攜載SB的SF骨組織工程支架修復骨缺損提供了有力證據。

然而，本研究也存在一些局限性。盡管丹酚酸B對骨形成有顯著影響，但本實驗并沒有設置與自體松質骨修復骨缺損做對照。另一方面，研究更高濃度的SB摻入能否進一步提高骨缺損修復效果具有重要的科學意義。