養血安胎顆粒抑制外泌體中miR-16促進血管生成的作用研究

姚偉潔 杜博冉 李瀟 馮欣

血管生成參與了妊娠的全過程。血管生成伴隨著子宮和臍帶血流量增加，通過提供給胎兒充足的血液，從而促進胚胎的著床與發育[1]。血管生成異常，會導致流產的風險增加[2]。陳雷寧等[3]采用三維多普勒超聲發現，復發性自然流產(recurrent spontaneous abortion，RSA)患者的子宮內膜血管化程度與正常妊娠女性相比較顯著降低，表明血管生成異常是RSA患者的病理特征。研究表明，滋養層細胞功能缺陷導致的血管生成異常被認為是RSA最重要的原因之一[4]。因此，改善胎盤血管生成可以作為治療RSA的有效方法。

中藥復方養血安胎顆粒是北京婦產醫院臨床應用30余年的院內制劑，在臨床治療RSA中具有確切的療效[5-6]。研究發現養血安胎顆粒能夠通過調節溶酶原活化物抑制因子-1治療RSA[5]，而溶酶原活化物抑制因子-1是胎盤功能不全的標志，與血管生成密切相關[7]。課題組進而通過整合藥理學結合Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes富集分析發現，養血安胎顆粒治療RSA與調控血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)信號通路密切相關[8]。VEGF對血管生成發揮促進作用，是重要的血管生長調節因子[9]，但是養血安胎顆粒調控VEGF的機制尚缺少深入報道。研究發現，miR-16與VEGF的3-UTR互補，進而抑制人絨毛膜滋養層細胞和人絨毛膜癌細胞(JEG-3)中的VEGF表達，從而抑制血管生成[10]。

研究發現，外泌體在滋養層細胞與子宮各種細胞的相互作用中發揮了重要的溝通作用，從而保證了血管生成和胎盤的正常發育[11]，養血安胎顆粒能否通過外泌體作為媒介調控VEGF以促進血管生成仍不清楚。故本實驗以養血安胎顆粒為治療藥物，滋養層細胞和人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)為研究對象，血管生成和外泌體為切入點，探討養血安胎顆粒調控VEGF以促進血管生成的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、實驗細胞及培養

20只SD雄性大鼠，鼠齡6～8周、體質量(200±20)g、購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證編號：SCXK(京)2016-0006。

人絨毛膜癌細胞(JEG-3)、人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；JEG-3細胞及HUVECs均培養在25 cm2培養瓶中，使用DMEM培養基培養，培養基中含10%胎牛血清及1%青鏈霉素混合液，培養環境為37℃和5%二氧化碳的培養箱。

1.2 實驗藥物

養血安胎顆粒(8 g/袋，每g含生藥3.25 g)，首都醫科大學附屬北京婦產醫院制劑(批準文號：京藥制字Z20062027；產品批號：200301Y)，由當歸417 g、白芍417 g、續斷417 g、桑寄生417 g、蓮子417 g、菟絲子500 g、山藥417 g和廣木香250 g組成，煎煮并濃縮成顆粒至1000 g。

1.3 實驗試劑

小鼠單克隆VEGF抗體(Santa Cruz，貨號：sc-7269)，兔多克隆p-VEGFR2抗體(貨號：ab194806)，兔單克隆CD9抗體(貨號：ab92726)，小鼠單克隆TSG101抗體(貨號：ab83)，兔多克隆Flotillin 1抗體(貨號：ab41927)，小鼠單克隆β-actin抗體(貨號：ab8226)，購自Abcam公司。Trizol試劑(Invitrogen，貨號：223306)，TransStart Tip Green qPCR SuperMix(全式金，批號：20200105)，TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(全式金，批號：20200105)，高效RIPA組織/細胞裂解液(索萊寶，批號：20200305)，超敏發光液(Millipore，批號：1907701)，BCA蛋白定量試劑盒(博奧森，批號：20190805)，CCK-8試劑盒(尚寶生物，批號：20200111)，miR-16-5p mimic、NC及轉染試劑(銳博生物)。

1.4 實驗儀器

超速離心機(美國Beckman公司，L-80XP)，實時熒光定量PCR儀(Bio-Rid，CFX96TM)，PowerPacTM基礎電泳儀電源(Bio-Rid)，Mini-PROTEAN?Tetra電泳槽(Bio-Rid)，小型Trans-Blot?轉印槽(Bio-Rid)，全波長酶標儀(Molecular Devices，SpectraMax Plus 384)。

1.5 實驗方法

1.5.1 養血安胎含藥血清的制備 將20只SD大鼠適應性喂養一周后，隨機分為2組，每組10只，分別為空白血清組和養血安胎血清組。其中養血安胎血清組每天灌胃給予6.24 g/kg的養血安胎溶液，空白血清組每次灌胃給予等量蒸餾水。連續給藥7天，末次給藥1小時后處死，腹主動脈取血，靜置2小時后，使用離心機在4℃，3 000r/min離心20分鐘，吸取上清液，60℃滅活處理后，通過0.22 μm的微孔濾膜除菌，隨后將血清分裝凍存備用[12]。

1.5.2 JEG-3細胞的分組與處理 將JEG-3細胞以4×103細胞/孔的數量接種于96孔板中或4×105細胞/孔的數量接種于6孔板中并放置過夜，隨后將6孔板的細胞分為4組，分別為空白對照+mimic NC組、養血安胎+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組和養血安胎+miR-16 mimic組。其中空白對照+mimic NC組加入空白組血清并轉染miR-16-5p mimic NC，養血安胎+mimic NC組加入養血安胎含藥血清并轉染miR-16-5p mimic NC，空白對照+miR-16 mimic組加入空白組血清并轉染miR-16-5p mimic，養血安胎+miR-16 mimic組加入養血安胎含藥血清并轉染miR-16-5p mimic。72小時后收集細胞[13]。96孔板細胞分為空白對照組，1%養血安胎組、5%養血安胎組和10%養血安胎組，分別加入空白血清，1%、5%、10%含藥血清。

1.5.3 外泌體的分離 通過差速離心法分離JEG-3細胞分泌的外泌體，具體方法為將培養有JEG-3細胞的培養基先后以300 g離心10分鐘，2 000 g離心15分鐘，10 000 g離心30分鐘，隨后吸取上清液并以70 000 g離心70分鐘2次，得到的沉淀物為外泌體。隨后使用磷酸緩沖鹽溶液溶解外泌體，用于后續實驗[14]。

1.5.4 HUVECs的分組與外泌體共培養 將HUVECs以4×103細胞/孔的數量接種于96孔板中或4×105細胞/孔的數量接種于6孔板中并放置過夜，將6孔板的細胞設置空白對照+mimic NC組、養血安胎+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組和養血安胎+miR-16 mimic組。按1∶40 000將HUVECs分別與相應組別JEG-3細胞分泌的外泌體共培養24小時[15]。96孔板細胞分組同1.5.2。

1.6 檢測指標

1.6.1 Cell Counting Kit-8(CCK-8)法測定JEG-3和HUVECs的活力 將96孔板中JEG-3細胞放置過夜后，加入不同濃度養血安胎含藥血清(分別為1%、5%、10%)分別處理JEG-3細胞24小時和48小時；將96孔板中HUVECs放置過夜后，按照步驟1.5的方法處理細胞；分別在JEG-3細胞和HUVECs每孔中加入CCK-8溶液后37℃孵育3小時，使用酶標儀在490 nm處測定吸光度值。

1.6.2 實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)法檢測JEG-3細胞、外泌體和HUVECs中miR-16水平的變化 使用步驟1.5.2的方法處理JEG-3細胞，步驟1.5.4的方法處理HUVECs，隨后收集細胞和外泌體。采用Trizol法提取細胞和外泌體中的總RNA，然后通過反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，進而通過SYBR預混系統和特異性引物進行RT-PCR擴增，以U6為內參，計算2-△△Ct目的基因相對表達量，結果以倍數形式表示。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.6.3 蛋白質印跡(Western blot)法檢測JEG-3細胞和HUVECs中VEGF和磷酸化血管內皮細胞生長因子受體2(phosphorylated VEGF receptor 2，p-VEGFR2)蛋白表達及外泌體的標記蛋白的表達 使用步驟1.5.2的方法處理JEG-3細胞，步驟1.5.4的方法處理HUVECs，隨后收集細胞和外泌體。使用RIPA裂解液提取細胞中的總蛋白，并使用蛋白定量試劑盒測定蛋白質濃度，將蛋白加入十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝中，使用電泳分離蛋白質，隨后使用濕轉系統將蛋白轉移至0.45 μm的PVDF膜上。使用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2小時，4℃下加入相應一抗孵育過夜，回收一抗后洗膜，加入對應二抗室溫孵育1小時，加入電化學發光試劑并在凝膠成像系統中形成圖像。使用Image J軟件計算樣品灰度值，計算蛋白表達，將β-actin作為內標蛋白，結果以倍數的形式表示。一抗分別為小鼠單克隆VEGF抗體、兔多克隆p-VEGFR2抗體、兔單克隆CD9抗體、小鼠單克隆TSG101抗體、兔多克隆Flotillin 1抗體。

1.7 數據處理

2 結果

2.1 養血安胎含藥血清對JEG-3細胞活力的影響

結果顯示，與空白對照組、1%養血安胎組比較，24小時和48小時的5%和10%養血安胎組JEG-3細胞活力均顯著升高(P<0.05)；與48小時的5%養血安胎組比較，48小時的10%養血安胎組JEG-3細胞活力進一步升高(P<0.05)，表明養血安胎含藥血清能夠提高JEG-3細胞的細胞增殖，后續實驗選擇10%含藥血清干預JEG-3細胞48小時。見表2。

表2 不同濃度養血安胎含藥血清在不同時間點對JEG-3細胞活力的影響

2.2 外泌體分離結果

使用超速離心法對處理后的JEG-3細胞培養基中外泌體進行分離，通過Western blot法對外泌體標記蛋白進行測定。結果顯示，CD9、TSG101和Flotillin1蛋白表達呈陽性，Calnexin蛋白表達陰性，表明分離得到的物質為外泌體，且外泌體中未包含細胞碎片，純度符合標準。見圖1。

圖1 Western blot法測定外泌體標志性蛋白的表達結果

2.3 外泌體對HUVECs細胞活力的影響

將外泌體與HUVECs共培養，明確其對細胞增殖的影響。結果顯示，與空白對照+mimic NC組比較，miR-16 mimic來源的外泌體干預后，HUVECs細胞活力顯著降低(P<0.05)；與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較，養血安胎來源的外泌體干預后，HUVECs細胞活力顯著升高(P<0.05)，表明養血安胎能夠通過外泌體對HUVECs的細胞增殖進行調節，其調節作用可能與外泌體中miR-16水平有關。見表3。

表3 不同處理組細胞的外泌體對HUVECs細胞活力的影響

2.4 養血安胎顆粒對JEG-3細胞、HUVECs及外泌體中miR-16的影響

結果顯示，在JEG-3細胞中，與空白對照+mimic NC組、養血安胎+mimic NC組比較，轉染miR-16 mimic后，miR-16水平均顯著升高(P<0.05)，表明miR-16被成功過表達。與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較，使用養血安胎干預后，miR-16水平均顯著降低(P<0.05)，表明養血安胎含藥血清能夠抑制miR-16水平。見表4。

在外泌體中，與空白對照+mimic NC組、養血安胎+mimic NC組比較，轉染miR-16 mimic后，外泌體中miR-16水平均顯著升高(P<0.05)；與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較，使用養血安胎干預后，miR-16水平均顯著降低(P<0.05)，表明JEG-3細胞miR-16變化能夠進一步影響其分泌的外泌體中miR-16水平。見表4。

在HUVECs中，與空白對照+mimic NC組、養血安胎+mimic NC組比較，miR-16 mimic來源的外泌體干預后，HUVECs中miR-16水平均顯著升高(P<0.05)；與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較，養血安胎來源的外泌體干預后，HUVECs中miR-16水平均顯著降低(P<0.05)，表明外泌體與HUVECs共培養后，外泌體進入HUVECs中，并影響了HUVECs中miR-16水平。見表4。

表4 養血安胎顆粒對不同組別細胞及JEG-3細胞分泌的外泌體中miR-16的影響

2.5 養血安胎顆粒對JEG-3細胞、HUVECs中VEGF、p-VEGFR2的影響

研究發現，miR-16直接靶向VEGF，進而對VEGF進行負調節。本實驗結果顯示，在JEG-3細胞中，與空白對照+mimic NC組、養血安胎+mimic NC組比較，轉染miR-16 mimic后，JEG-3細胞中VEGF和p-VEGFR2蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，表明過表達miR-16能夠抑制VEGF的表達。與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較，使用養血安胎干預后，VEGF和p-VEGFR2蛋白表達均顯著升高(P<0.05)，VEGF對血管生成發揮促進作用，表明養血安胎能夠增加VEGF表達以促進血管生成。見圖2、表5。

在HUVECs中，與空白對照+mimic NC組、養血安胎+mimic NC組比較，miR-16 mimic來源的外泌體干預后，HUVECs中VEGF和p-VEGFR2蛋白表達均顯著降低(P<0.05)；與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較，養血安胎來源的外泌體干預后，HUVECs中VEGF和p-VEGFR2蛋白表達均顯著升高(P<0.05)表明外泌體通過影響HUVECs中miR-16，進而影響血管生成。見圖2、表5。

注：A 空白對照+ mimic NC組; B 養血安胎+mimic NC組; C 養血安胎+miR-16 mimic組; D 養血安胎+miR-16 mimic組。

表5 養血安胎顆粒對不同組別JEG-3細胞和HUVECs中VEGF和p-VEGFR2的影響

3 討論

RSA在中醫學中屬“滑胎”范疇，治療的關鍵在于調補腎氣，活血化瘀。近年來，以補腎活血法治療RSA的方劑臨床療效確切，并被證明與改善血管生成相關[16-17]。養血安胎顆粒由菟絲子、續斷、山藥、益母草、白芍、當歸、石蓮子、桑寄生、廣木香組成，以補腎活血為治則，諸藥合用，以奏補腎健脾，養血安胎之功。其治療RSA可能也與改善血管生成相關[8]，但目前尚未有深入的研究報道。

VEGF是重要的血管生成的調控因子，對血管生成發揮促進作用，利于胚胎著床。在妊娠過程中，胎盤組織中能夠檢測到VEGF蛋白和mRNA的高表達，而RSA患者血清中VEGF表達則顯著降低[18]。VEGF也可通過介導VEGFR2發揮促血管生成作用，通過與VEGFR2結合，后者發生二聚化和自磷酸化，進而激活下游通路，促進細胞增殖與遷移，發揮促血管生成作用[19-21]。

miRNA能夠通過調節相關血管生成蛋白表達進而導致RSA發生。研究發現，將miR-16注入妊娠小鼠胎盤，會導致小鼠胎盤異常，出現自然流產幾率明顯增加。此外，通過分離RSA患者的絨毛和蛻膜組織，也檢測到miR-16水平相比正常妊娠女性明顯增加，表明miR-16在RSA中發揮了重要的作用[10]。熒光素酶報告基因結果顯示，miR-16與VEGF的3-UTR互補，通過直接靶向VEGF來負調節VEGF表達，是血管生成的新型抑制劑[10]。本實驗中，為了探討養血安胎顆粒能否提高VEGF的表達，首先通過miR-16 mimic過表達了JEG-3細胞中miR-16水平，發現JEG-3細胞中VEGF蛋白表達顯著降低，也驗證了miR-16能夠抑制VEGF的表達。而養血安胎顆粒干預后，發現其能夠抑制miR-16的水平，進而增加VEGF的表達。CCK-8實驗也顯示，養血安胎顆粒能夠促進JEG-3細胞的增殖。以上結果表明，養血安胎顆粒具有增加VEGF表達，促進血管生成的作用。

血管生成是由蛻膜化子宮內膜細胞作用于內皮細胞以促進其增殖，遷移和侵襲產生的[22]。為了進一步研究養血安胎顆粒如何調節血管生成，課題組分離了JEG-3細胞中的外泌體。細胞外囊泡是由真核和原核細胞釋放到細胞外空間的各種具有膜結構的囊泡結構統稱，根據直徑大小可分為外泌體、微囊泡和凋亡小體[23]。外泌體的研究目前最為廣泛，其直徑約40～100 nm，具有雙層膜結構，內部包含多種蛋白、mRNA和miRNA等多種物質。外泌體一旦釋放到細胞外空間，即可改變臨近細胞活性或進入體液向遠端發揮作用，通過攜帶來源細胞的蛋白質、mRNA和miRNA至受體細胞，進而對受體細胞功能進行調控，發揮細胞通訊作用。研究發現，外泌體能夠調節血管生成，并在胚胎植入中發揮重要的通訊作用。細胞的跨膜蛋白CD9、CD63、多泡體產生的蛋白Alix和TSG101以及轉膜和融合相關蛋白Flotillin 1可作為鑒定外泌體的標記物[24]。Calnexin是細胞內質網的標記蛋白，本實驗中，通過Western blot法對外泌體和內質網標記蛋白進行測定，發現CD9、TSG101和Flotllin 1呈陽性表達，Calnexin蛋白呈陰性表達，表明分離得到的物質為外泌體，且不含其他細胞成分，純度符合標準，能夠用于后續實驗。實驗結果表明，過表達JEG-3細胞中的miR-16后，其分泌的外泌體中miR-16也同樣升高；而養血安胎干預后，外泌體中的miR-16水平也得以降低。

將分離的外泌體進而與HUVECs共培養后可觀察到HUVECs的細胞增殖與JEG-3細胞趨勢一致，表明外泌體能夠對受體細胞進行調控，且受源細胞的影響。檢測與外泌體共培養后的HUVECs中miR-16水平和VEGF的蛋白表達，結果顯示miR-16水平和VEGF的蛋白表達也均與JEG-3細胞的趨勢相同，表明JEG-3分泌的外泌體進入HUVECs后，對HUVECs的活性進行了調節。養血安胎顆粒則通過外泌體增加了HUVECs的VEGF表達，進而發揮了促血管生成作用。

綜上，養血安胎顆粒抑制JEG-3細胞外泌體中miR-16水平，進一步抑制HUVECs中的miR-16水平，進而增加HUVECs中VEGF和VEGFR2的蛋白表達，促進血管生成。