四君子湯改善C57小鼠惡病質狀態肌肉消耗的療效及機制研究

朱健 吉兆奕 焦擁政 朱曉云 曹 袁國興 吳潔

惡病質是各種惡性腫瘤尤其是晚期患者的主要并發癥，是造成死亡的獨立危險因素，嚴重影響患者的生存期及生活質量，預后差[1]。晚期腫瘤患者約50%～80%存在厭食和體重下降等惡病質的表現[2]，且進行性的腫瘤惡病質狀態預后不佳，存活時間短，占所有癌癥死亡的近20%[3]。目前臨床尚缺乏合理的治療策略，尚無單一性、特異性的療效確切的藥物[4]。

中醫學雖無惡病質病名，但其以納呆食少、倦怠乏力、消瘦等一系列臟腑虛損癥狀為主要臨床表現，屬于中醫“虛勞”范疇[5]。中醫認為脾為后天之本、氣血生化之源，從脾論治虛勞最早見于《金匱要略》，而脾虛也是腫瘤發病的基礎[6]。四君子湯是中醫治療脾胃氣虛的經典方劑，近年研究文獻提示四君子能夠改善腫瘤惡病質狀態，與抑制炎癥因子有關[7]，而具體機制未詳細闡明。基于此，本課題組建立C57小鼠肺癌惡病質模型，觀察四君子湯改善C57小鼠惡病質狀態肌肉消耗的療效及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級近交系6～7周C57BL/6小鼠24只，雌雄各半，體質量18～24 g，購自中國中醫科學院藥品鑒定所實驗動物中心(動物許可證號：SCXK京20000010號)。

1.2 細胞株及種瘤方法

Lewis鼠源肺癌細胞由中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心提供。癌細胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，于37℃、5%CO2培養箱內培養，定期更換，約3～4日待細胞鋪滿瓶底胰酶消化后，用PBS配置為1×107/mL細胞懸液。使用隨機數字表法選取18只小鼠，采用1 mL注射器抽取0.2 mL細胞懸液注入小鼠右腋皮下，7天后皮下可觸及瘤體，成瘤18只。

1.3 實驗藥物

四君子湯組方為：黨參、白術、茯苓、甘草(批號分別為：21081501、21100904、21072002、21082301，均由康美智慧藥房連鎖有限公司提供)，以9∶9∶9∶6配比，藥材由中國中醫科學院廣安門醫院中藥房提供并煎湯取汁。醋酸甲地孕酮分散片(青島國海生物制藥有限公司，規格：40 mg，生產批號：16110502)，研磨杵研磨藥片，生理鹽水溶解，按照0.024 g/kg給藥。

1.4 主要試劑與儀器

兔來源一抗Activin-A、Myostatin、MuRF1及二抗均購于中國ABclonal公司(生產批號：RP02516、A6913、A3101)，Western Blot相關試劑盒購于中國Solarbio公司(生產批號：P1200、P1010)，人活化素A(Activin-A)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒分別購于上海遠慕生物科技有限公司、武漢云克隆科技股份有限公司(生產批號：YM-1058B、SEA133Ra)。

1.5 實驗方法

按照隨機數字表將上述成模的18只小鼠再次分為模型組、四君子組、地屈孕酮組，每組6只。此外，正常組為6只。其中四君子組以5倍臨床等效劑量，從接種第2日起開始灌胃，藥物濃度1 g/mL，每日1次灌胃，每次0.3 mL；模型組與正常組自接種第2日開始給予同等劑量的生理鹽水灌胃；地屈孕酮組從接種第2日開始每天給予甲地孕酮溶液，按照0.024 g/(kg·d)給藥，每天灌胃1次。

1.6 檢測指標

1.6.1 動態觀察小鼠進食量和體質量 給藥2周后處死動物，眼球取血，分離血清，解剖留取動物皮下腫瘤、脾臟、肝臟、腓腸肌標本，游標卡尺測量腫瘤長短徑，并稱取質量，計算腫瘤及臟器指數(臟器質量/體質量)。

1.6.2 透射電鏡觀察肌纖維形態 取1 cm3骨骼肌組織若干塊，經過乙醇梯度脫水、包埋切片染色等處理，置于JEOL-3010透射電子顯微鏡下觀察骨骼肌結構，并用相機記錄。

1.6.3 檢測血液中炎癥因子水平 采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附分析法(ELISA)檢測血清TNF-α、Activin-A水平，按ELISA試劑盒說明書操作。

1.6.4 蛋白免疫印跡(Western Blot)法及實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)肌萎縮基因Myostatin、Activin-A、MuRF-1表達水平 取惡病質小鼠骨骼肌組織2 mm3，加入裂解液及蛋白磷酸酶抑制劑，于超聲勻漿中提取蛋白，在4℃，12 000r/min條件下離心5分鐘，取上清后使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。經過SDS-PAGE電泳轉至PVDF膜，加入抗體Myostatin、Activin-A、MuRF-1，4℃條件下孵育過夜，在漂洗、二抗孵育、洗膜等操作后，將PVDF膜浸泡于電化學發光顯色成圖。

取惡病質小鼠骨骼肌組織，按照10～20 mg組織加入300 μL裂解液，進行勻漿處理，按照RNA提取試劑盒的操作要求提取RNA，在納滴儀上檢測核酸濃度并確定無雜質，配置20 μL反應體系將RNA轉化為cDNA，配置20 μL熒光PCR反應體系，使用StepOnePlusTMReal-TimePCRSystem型熒光定量PCR儀進行擴增，反應結束后確認擴增曲線和融解曲線，輸出數據。

1.7 數據處理

2 結果

2.1 四君子湯對肺癌惡病質小鼠體質量、腫瘤直徑、腫瘤質量的影響

實驗發現，與模型組和地屈孕酮組相比，四君子組瘤體質量降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組肺癌惡病質小鼠體質量、腫瘤直徑、腫瘤質量比較

2.2 四君子湯對肺癌惡病質小鼠脾臟、肝臟質量及臟器指數的影響

正常組無肝脾腫大現象發生，而肺癌惡病質小鼠均有肝脾腫大現象發生。在脾臟質量上，四君子組與模型組、地屈孕酮組差異無統計意義(P>0.05)。而對于肝臟質量，與四君子組相比，模型組、地屈孕酮組肝臟質量增加，差異具有統計意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組肺癌惡病質小鼠脾臟、肝臟質量及臟器指數比較

2.3 四君子湯對肺癌惡病質小鼠骨骼肌(腓腸肌、比目魚肌、脛前肌)質量及指數的影響

對腓腸肌進行解剖、剝離、稱重，發現荷瘤各組小鼠與正常組比較，肌肉質量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，四君子湯能夠改善骨骼肌的絕對質量(P<0.05)，地屈孕酮組無顯著改變，四君子組較模型組骨骼肌/體質量指數有升高的趨勢。見表3。

2.4 四君子湯對肺癌惡病質小鼠骨骼肌纖維形態學的影響

各組小鼠腓腸肌纖維橫截面切片經蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，在電鏡下可觀察到正常組小鼠腓腸肌紋路清晰，骨骼肌細胞排列緊密，呈圓形或多邊形，細胞核多位于細胞周邊，與細胞膜接近，細胞核被染成紫色，細胞質被染成粉紅色。惡病質小鼠腓腸肌肌細胞排列疏松，肌纖維細胞縮小，細胞間隙增大，肌纖維細胞大小差異較大，說明惡病質模型的腓腸肌存在明顯萎縮現象。四君子湯能明顯改善骨骼肌萎縮的癥狀。見圖1。

注：A 正常組；B 模型組；C 地屈孕酮組；D 四君子組。

表3 各組肺癌惡病質小鼠腓腸肌質量及指數比較

2.5 四君子湯對肺癌惡病質小鼠血清TNF-α、Activin-A含量的影響

惡病質模型組和四君子組小鼠血清中TNF-α含量、Activin-A較正常組明顯升高(P<0.05)，提示接種肺癌細胞的各組存在血清TNF-α、Activin-A的高表達(P<0.05)。地屈孕酮組和四君子組Activin-A表達水平與模型對照組相比，存在不同程度降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組肺癌惡病質小鼠血清TNF-α、Activin-A含量比較

2.6 四君子湯對肺癌惡病質小鼠肌萎縮相關基因表達的影響

與正常組相比，模型組腓腸肌中Activin-A、Myostatin、MuRF1的mRNA存在高表達(P<0.01)。四君子組的Activin-A表達水平與模型組相比明顯降低(P<0.05)；在Myostatin表達上，地屈孕酮組和四君子組較模型組顯著降低(P<0.01)；在MuRF1的表達上，四君子組與模型組相比明顯降低(P<0.05)，而地屈孕酮組與模型組相比顯著降低(P<0.01)。見表5。

表5 各組肺癌惡病質小鼠腓腸肌中Activin-A、Myostatin、MuRF1的mRNA表達比較

2.7 四君子湯對肺癌惡病質小鼠肌萎縮相關蛋白表達的影響

模型組小鼠肌萎縮相關蛋白Activin、Myostatin、MuRF1的表達顯著升高。與模型組比較，四君子湯顯著降低肌萎縮相關蛋白Activin-A的表達，結果與mRNA表達結果一致。說明四君子湯可能通過Myostatin/Actvin-ActRIIB信號途徑抑制肺癌惡病質小鼠骨骼肌萎縮。而Myostatin、MuRF1蛋白表達結果與mRNA表達存在不完全一致的現象，有待進一步實驗驗證。見圖2。

注：A 正常組；B 模型組；C 地屈孕酮組；D 四君子組

3 討論

腫瘤惡病質是中晚期腫瘤患者的常見臨床表現，以短期內體重嚴重下降、肌肉組織(伴或不伴脂肪組織)進行性消耗為顯著特征，同時伴有厭食、水腫、貧血、多器官功能衰竭等癥狀，嚴重影響患者的生活質量，縮短患者的生存時間[4]。研究結果表明，四君子組的腫瘤平均直徑相較于地屈孕酮組和模型組顯著縮小，同時四君子組的腓腸肌質量相較于模型組與地屈孕酮組有一定的增加，在改善肝腫大現象上優于地屈孕酮組，在腓腸肌的電鏡圖上顯示四君子組腓腸肌紋路相對清晰，骨骼肌細胞排列相對緊密，提示四君子湯能夠在改善小鼠腫瘤惡病質方面效果優于地屈孕酮。

四君子湯改善骨骼肌萎縮癥狀可能通過改善小鼠靜息能量消耗情況從而逆轉小鼠體內能量負平衡代謝狀態，一定程度上相對地提高骨骼肌質量。在能量消耗方面，人體內分為兩種消耗方式，包括靜息能量消耗和活動能量消耗及飲食生熱。而靜息能量消耗占人體消耗總能量的比值為60%～70%[8]，占人體能量消耗的主要部分。而在靜息能量消耗中，又以肝臟、大腦、心臟占靜息能量消耗的58%[9]，相反，骨骼肌能量消耗僅為22%[10]。肝臟是小鼠質量最大的臟器，與小鼠能量代謝和線粒體中解偶聯蛋白息息相關[11]。本研究結果表明，相較于地屈孕酮，四君子組能夠明顯改善肝腫大現象。

四君子湯通過抗炎作用改善腫瘤惡病質骨骼肌萎縮狀態。在惡病質肌肉萎縮眾多調控因素中，炎性反應也起著重要的作用[12]。蛋白質的分解增加和合成減少引起骨骼肌萎縮，最終形成腫瘤惡病質，而Activin A是腫瘤患者生存期縮短的預期指標。在骨骼肌中，Activin A和Myostatin的受體activin receptor ⅡB(ActRⅡB)能夠導致Smad2/3磷酸化及FOXO基因的去磷酸化，磷酸化的Smad2/3能夠下調與肌肉分化相關的基因[13]，還能抑制蛋白合成途徑AKT-mTOR[14]；而另一方面，磷酸化的Smad2/3和去磷酸化FOXO還能誘導MURF1和Atrogin-1基因的激活[15]，這兩種蛋白能夠促進骨骼肌中肌原纖維蛋白的降解，從而促進了骨骼肌的能量消耗。而TNF-α等炎癥因子水平升高，也與腫瘤相關性厭食等有關[16]。研究發現肌萎縮時確實存在很多細胞因子的表達，其中TNF-α通過其信號通路可最終導致MuRF-1表達，并引起肌肉蛋白的降解[17]。TNF-α還可抑制肌肉分化生長因子mRNA水平，導致骨骼肌的分化中斷，影響受損肌肉組織的修復，促進腫瘤惡病質的進展[18]。因此，Activin A和TNF-α水平的升高與腫瘤惡病質狀態密切相關。四君子組小鼠血清中Activin A較模型組和地屈孕酮組明顯降低，說明四君子組在降低Activin A水平方面明顯優于地屈孕酮。

四君子湯通過干預Myostatin/Actvin-ActRIIB信號途徑調控骨骼肌肌肉消耗。肌肉組織是人體最主要的蛋白質—能量儲備庫，在禁食、饑餓、各種疾病消耗狀態時，機體動員蛋白質分解以應對能量需求及合成新的蛋白質。在這種代謝狀態下，肌蛋白合成減少而分解增加，使機體骨骼肌肌肉量丟失，導致骨骼肌消耗。晚期腫瘤患者臨床表現為體質量丟失、骨骼肌萎縮、低蛋白血癥、內臟蛋白消耗、蛋白質合成減少和分解增加、蛋白轉化率升高、血漿氨基酸譜異常以及機體呈現負氮平衡等，都證實骨骼肌蛋白質分解旺盛是腫瘤惡病質的主要代謝特點，骨骼肌消耗是引起腫瘤蛋白質—能量消耗性營養不良的中心環節，是最終引起惡病質的決定因素[19]。無論是臨床還是實驗研究，均提示多種復雜因素參與腫瘤性骨骼肌消耗，近年來比較關注基因轉錄和蛋白翻譯水平對骨骼肌蛋白合成/分解的調控機制[20]。Myostatin/Actvin-ActRIIB信號途徑是肌肉消耗的一條重要通路。MuRF1是肌肉細胞特異性泛素蛋白連接酶，在骨骼肌細胞核中特異表達，是蛋白質降解的相關基因，并涉及肌肉應答和收縮調節的各個方面，過度表達后在骨骼肌M線處與粗肌絲連接蛋白結合，破壞粗絲聯接蛋白的亞結構域，導致粗絲聯接蛋白的降解[21]。實驗結果顯示，在肺癌惡病質小鼠肌萎縮相關基因表達中，四君子湯能夠明顯降低Activin-A、Myostatin、MuRF1的mRNA表達，其中降低血清Myostatin mRNA的表達更顯著。四君子湯顯著降低肌萎縮相關蛋白Activin-A的表達，結果與mRNA表達結果一致。而Myostatin、MuRF1蛋白表達結果與mRNA表達存在不完全一致的現象，有待進一步實驗驗證。

如何預防和逆轉腫瘤惡病質的發生發展，目前臨床上尚缺乏有效手段。針對骨骼肌消耗性營養不良的發病機制，采取的治療策略包括降低炎癥因子和氧化應激水平，改善胰島素抵抗，阻止caspase-3及Atrogin-1和MuRF-1的激活，降低抑制素或activin水平等。探討腫瘤惡病質的發病機制及有效干預措施，具有十分重要的意義。本研究從Myostatin/Actvin-ActRIIB信號途徑這一前沿領域，證實了四君子湯對腫瘤惡病質骨骼肌萎縮的干預作用，并能降低血清中的炎癥因子，明確了四君子湯治療腫瘤惡病質骨骼肌萎縮的關鍵靶點和核心通路，為應用中醫藥改善晚期腫瘤患者生存質量提供了生物學基礎和科學理論依據。