茯苓甘草湯治療肺動脈高壓機制探討*

馬雨婷，司明東，張笑迎，賈毓欣，閆翠環(huán)，馬東來

河北中醫(yī)學(xué)院河北省中藥組方制劑技術(shù)創(chuàng)新中心 河北石家莊 050091

肺動脈高壓（pulmonary hypertension， PH）作為一種常見的病理生理性、漸進性疾病，具有肺小動脈收縮、肺血管重塑、血栓形等主要病理特征[1]，是由多種原因引起的肺動脈壓異常升高的一種病理生理狀態(tài)[2]，是大多數(shù)的心血管和呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，最終會導(dǎo)致患者右心功能受損甚至死亡，如未進行及時治療，確診后平均壽命約2.8年[3-4]。PH機制尚未清晰，起病隱匿，發(fā)展緩慢，診斷方式較為復(fù)雜，難以盡早確診治療，右心導(dǎo)管檢查是目前唯一的確診肺動脈高壓的西醫(yī)檢查手段[5]。臨床治療上西藥種類繁多，價格昂貴，卻不能有效降低PH患者病死率，副作用及不良反應(yīng)較為明顯。PH以活動后氣促、疲勞、胸痛、暈厥、干咳、惡心、嘔吐、腹脹、水腫等為主要表現(xiàn)，當(dāng)屬中醫(yī)“肺脹”范疇[6]。“肺脹”病名首見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》曰：“肺脹者，虛滿而喘咳”表明本病病機源于“虛”，《丹溪心法》：“肺脹而咳，或左或右不得眠，此痰夾瘀血礙氣而病”，則詳細(xì)闡述PH的癥狀、病因，提示肺脹與痰血互結(jié)阻礙肺氣有關(guān)。現(xiàn)代中醫(yī)家多數(shù)認(rèn)為本病發(fā)生根本在于肺、腎、脾、心之臟腑功能虛衰，屬本虛標(biāo)實之證。在本病的發(fā)病及演變的過程中，諸因相兼共存，“虛”“痰”“瘀”貫穿于本病始終[7]。中醫(yī)學(xué)者運用中醫(yī)辨證論治的特色體系，在該病的預(yù)防和治療過程中取得了一定的關(guān)注和認(rèn)可[8-9]。

茯苓甘草湯由茯苓、甘草、生姜和桂枝等四味藥組成，始載于張仲景的《傷寒論》。《普濟方》：茯苓、甘草之甘，益津液而和營，桂枝、生姜之辛，助陽氣而解表。《傷寒附翼》：肺為水母，肺氣不化，則水氣不行。茯苓為化氣之品，故能清水之源；桂枝、生姜，則從辛入肺，使水氣通于肺，以行營衛(wèi)陰陽，則外走肌表而為汗矣，佐甘草以緩之。陳婷婷、周雯等在臨床上運用茯苓甘草湯治療肺動脈高壓氣虛血瘀證取得了較好的療效，可明顯改善患者肺功能和肺部血液循環(huán)[10-11]。范偉贏、王伯章等的研究也表明本方對治療慢性常壓低氧性肺動脈高壓具有較好的療效[12]。茯苓甘草湯治療PH具有多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點、多組分間協(xié)同調(diào)節(jié)的優(yōu)點，但其組分多樣，系統(tǒng)龐大，目前的深入研究缺乏系統(tǒng)性。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方式與中醫(yī)學(xué)的“整體觀念”十分契合，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討茯苓甘草湯治療肺動脈高壓的主要功效物質(zhì)以及配伍機制和可能的分子作用機制，為深入開展茯苓甘草湯臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)理論參考。

方 法

1 茯苓甘草湯的化學(xué)成分及其靶點預(yù)測

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP）（http://ibtshkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）檢索茯苓甘草湯中茯苓、甘草、生姜、桂枝的全部化學(xué)成分，并以口服利用度OB≥30%，類藥性DL≥0.18為條件篩選出其預(yù)測靶點基因。

2 疾病靶點的確定

通 過OMIM數(shù) 據(jù) 庫（http://omim.org/） 以“pulmonary hypertension”為關(guān)鍵詞搜集與肺動脈高壓疾病相關(guān)靶點。

3 藥物-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將在TCMSP平臺上所得潛在靶點與OMIM數(shù)據(jù)庫所得結(jié)果取交集，獲得化合物-疾病共同作用靶基因。在Cytoscape 3.7.1軟件（http://www.Cytoscape.org/）輸入候選化合物和相關(guān)疾病靶點數(shù)據(jù)，生成一個體現(xiàn)藥物靶點相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，構(gòu)建“藥物-化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)，并進行分析。

4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用 Cytoscape 3.7.1軟件中Bisogenet 3.0.0插件，物種選擇“Homo sapiens”，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并利用CytoNCA進行拓?fù)浞治觯鶕?jù)Degree centrality（DC）＞61，Betweenness centrality（BC）＞100篩選核心靶點。

5 基因功能分析與富集分析

利用Bioconductor中軟件包對共同靶點進行GO分子功能（MF）、生物過程（BP）、細(xì)胞組成（CC）和KEGG通路富集分析，保留P≤ 0.05的結(jié)果，得到GO柱狀圖及KEGG信號通路氣泡圖，最后運用Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建共同靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖。

6 核心化合物-靶標(biāo)蛋白分子對接

在TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫獲得化合物名稱、分子量以及三維結(jié)構(gòu)式，保存為mol2格式。從RSCB PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）和細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）的3D結(jié)構(gòu)文件。首先利用AutoDock 4.2.6（http:// autodock. Scripps. edu/news/autodock 42.6）將mol2格式的配體（化合物）文件通過加氫，計算電荷，合并非極性氫后保存成pdbqt格式；對蛋白質(zhì)進行去水、加氫等操作，保存為pdbqt格式文件備用；其后運行AutoDock進行對接，分子對接的Grid box設(shè)定為以原配體為中心的周圍所有殘基，根據(jù)每個化合物的最優(yōu)結(jié)合能（affinity）進行排序，研究選取結(jié)合能最低的3個活性成分作為茯苓甘草湯治療肺動脈高壓靶點的篩選依據(jù)，利用Pymol 2.3.3（https://pymol.org/2/）觀察和分析化合物與蛋白對接結(jié)果。

結(jié) 果

1 活性化合物及靶點基因的篩選

去重后本文共篩選出117個候選化合物，利用Venn 2.1軟件篩選出91個化合物-疾病共同作用靶基因，成分-靶點信息見表1。其中有兩個共有成分，β-sitosterol（β-谷甾醇）為桂枝生姜共有成分，sitosterol（谷甾醇）為桂枝甘草共有成分。

表1 成分-共同靶點信息

2 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

利用Cytoscape3.7.1將117個化合物共作用于91個相關(guān)靶點構(gòu)建藥物-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)，MOL000276等17個化合物在該數(shù)據(jù)庫中還未有相關(guān)的靶點，故而在網(wǎng)絡(luò)中不予顯示。其中紫色為甘草，綠色為生姜，橙色為桂枝，深藍色為茯苓。甘草作用于靶點的化合物多達88個，平均每個化合物作用于數(shù)十個靶點，化合物MOL000098 quercetin（槲皮素）有最多的潛在靶點（66個），其次為MOL000422 kaempferol（山柰酚）（29個）、MOL000354 isorhamnetin（異鼠李素）（13個）。單從作用層次上，提示槲皮素在網(wǎng)絡(luò)中貢獻最大。生姜和桂枝共有成分中的MOL000358 β-sitosterol（β-谷甾醇）也具有較多靶點（16個）。這些數(shù)據(jù)提示我們，靶點多的化合物很有可能在茯苓甘草湯的藥理功能中發(fā)揮著較為重要的作用。

圖1 藥物-化合物-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

3 蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)可以更好的了解各種蛋白質(zhì)在復(fù)合體中的作用。利用 Cytoscape3.7.1軟件中Bisogenet插件，構(gòu)建出靶蛋白之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系得到PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖3，其中包括1990個蛋白，12656條相互關(guān)系通道，將1990個蛋白做網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯渲袇?shù)包括DC、BC，DC的數(shù)值設(shè)置為大于61；BC的數(shù)值設(shè)置為大于100；得出11個靶標(biāo)蛋白，27條相互通路，排名前6的靶蛋白為EGFR、CTNNB1、UBC、YWHAZ、PRS27A、HSP90AB1。

圖3 拓?fù)浞治鼍W(wǎng)絡(luò)

4 靶點GO與KEGG富集分析

對91個共同靶點進行GO和KEGG富集分析，根據(jù)保留P≤0.05的結(jié)果，并分別對前20個條目進行可視化分析，得到柱狀圖和氣泡圖，其中柱狀圖縱坐標(biāo)表示GO名稱，橫坐標(biāo)表示富集個數(shù)；氣泡圖縱坐標(biāo)表示KEGG名稱，橫坐標(biāo)表示基因比例。如圖5A所示，共同作用靶點在生物過程（BP）中，主要為類固醇激素反應(yīng)（response to steroid hormone）、酮反應(yīng)（response to ketone）、對外來生物刺激的反應(yīng)（response to xenobiotic stimulus）等。如圖5B所示，其共同靶點在細(xì)胞組成（CC）中主要涉及受體復(fù)合物（receptor complex）、膜筏（membrane raft）、膜微結(jié)構(gòu)（membrane microdomain）等。如圖5C所示，共同靶點在分子功能（MF）中主要為細(xì)胞因子受體結(jié)合（cnuclear receptor activity）、磷酸酶結(jié)合（transcription factor activity， direct ligand regulated sequencespecific DNA binding）、細(xì)胞因子活性（DNA-binding transcription activator activity， RNA polymerase IIspecific）等過程。通過KEGG通路富集分析，其共同靶點主要富集于流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、乙型肝炎（Hepatitis B）等相關(guān)信號通路上，見圖5D。

圖4 核心靶點GO與KEGG通路富集圖

討 論

本研究結(jié)果分析了茯苓甘草湯4 味中藥（甘草、茯苓、生姜、桂枝）的有效活性成分119種，常春藤皂甙元（hederagenin，茯苓）、美迪紫檀素（Medicarpin，甘草）、異鼠李素（isorhamnetin，甘草）、7-甲氧基-2-甲將篩選得到的靶點和通路導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建基因-KEGG網(wǎng)絡(luò)圖，如圖5所示，紅色表示靶點，黃色表示KEGG通路。結(jié)果顯示鄰接節(jié)點數(shù)目較多的通路有Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、MAPK 信號通路、Human cytomegalovirus infection等，靶點有RAF1、CCND1、MAPK10等。

圖5 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

5 分子對接結(jié)果分析

分子對接結(jié)果顯示，將藥材-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中度值排序前15個核心活性化合物與VCAM-1和ICAM-1進行分子對接，與VCAM-1結(jié)合能最低的化合物分別為shinpterocarpin（結(jié)合能為-4.76 kJ/mol）、7-Methoxy-2-methyl isoflavone（結(jié)合能為-3.5 kJ/mol）、3’-Methoxyglabridin（結(jié)合能為-3.42 kJ/mol），與ICAM-1結(jié)合能最低的化合物分 別 為Licoagrocarpin（結(jié)合能為-3.46 kJ/mol）、shinpterocarpin（結(jié)合能為-2.73 kJ/mol）、β-sitosterol（結(jié)合能為-2.63 kJ/mol）。將核心化合物及目前報道的可能具有抗肺動脈高壓作用的化學(xué)藥中結(jié)合能最低的3種成分分別與VCAM-1（PDB ID：1VCA）和ICAM-1（PDB ID：5MZA）進行分子對接，結(jié)果見表2和圖6。基異黃酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone，甘草）、刺芒柄花素（formononetin，甘草）、槲皮素 （quercetin，甘草）、β-谷甾醇（β-sitosterol，生姜）等35種化學(xué)成分能作用于20個以上的 PH靶點基因，可認(rèn)為是茯苓甘草湯作用于PH的主要活性成分。由圖一可直觀體現(xiàn)化合物與靶點的相互作用關(guān)系，為茯苓甘草湯對PH的多靶點治療機制提供了參考，對中醫(yī)藥理論的整體觀念有著較好的體現(xiàn)。經(jīng)靶點映射，共獲得茯苓甘草湯治療PH的潛在靶點基因91個，且各個靶點、通路相互協(xié)同發(fā)揮作用，提示這可能是茯苓甘草湯治肺動脈高壓的關(guān)鍵。其中槲皮素可作用于66種靶點，其在抗炎、降血脂、抗血小板聚集、抗氧化、抗腫瘤等多方面都有較好的成效[13-14]。有研究表明槲皮素具有抑制肺動脈血管收縮和降低血壓的功效，并且在野百合堿誘導(dǎo)的PH大鼠模型中，槲皮素可顯著逆轉(zhuǎn)PH的形成[15-16]。

表2 核心化合物與VCAM-1及ICAM-1結(jié)合親和力

圖6 VCAM-1、ICAM-1與核心化合物的分子對接模式

本研究 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示EGFR、CTNNB1、UBC、YWHAZ、PRS27A、HSP90AB1等 靶 蛋 白 與細(xì)胞的轉(zhuǎn)化生長以及細(xì)胞間的黏附有密切關(guān)系，與炎癥、腫瘤、癌癥等疾病的發(fā)生與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，如HSP90AB1在肺癌組織中的表達水平顯著高于在正常肺組織中的表達[17-18]。在GO分析中在生物過程中主要富集的條目為類固醇激素反應(yīng)（response to steroid hormone），酮反應(yīng)（response to ketone）、對外來生物刺激的反應(yīng)（response to xenobiotic stimulus）在細(xì)胞分化/發(fā)育、增殖和代謝中發(fā)揮不可或缺作用。在靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖中，得到自由度較高的靶點有 RAF1、CCND1、MAPK10。RAF1與CCND1與癌癥的出現(xiàn)與發(fā)展關(guān)系密切，主要影響細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期等，其中CCND1還與炎癥、能量代謝以及腫瘤干細(xì)胞等關(guān)系密切[19-20]。MAKP10（絲裂原活化蛋白激酶10）與細(xì)胞分化、生長、增殖、免疫調(diào)控等多種細(xì)胞活動關(guān)系密切[21]。KEGG富集分析顯示現(xiàn)流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化信號通路是細(xì)胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)一個重要紐帶，在細(xì)胞抗凋亡、增殖、分化以及對環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種重要的細(xì)胞生理/病理過程中起到至關(guān)重要作用。

VCAM-1、ICAM-1是流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化信號通路上的重要蛋白，在正常生理情況下VCAM-1和ICAM-1呈低表達水平狀態(tài)，在缺氧、病原微生物等各種刺激因素影響后表達出現(xiàn)異常上調(diào)，易引起促炎因子表達升高以及單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生粘連，持續(xù)地異常表達可導(dǎo)致心肺等組織器官結(jié)構(gòu)和功能的損傷，廣泛參與支氣管哮喘、動脈粥樣硬化等病理過程[22-23]。有研究表明，肺組織VCAM-1和ICAM-1表達的提高與PH的形成有關(guān)，并通過抑制其在肺組織中的表達來進行治療[24]。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，該方中評分最高的15個化合物中與VCAM-1和ICAM-1進行分子對接的對比研究結(jié)果說明shinpterocarpin、7-Methoxy-2-methyl isoflavone、Licoagrocarpin等可能是茯苓甘草湯治療肺動脈高壓的關(guān)鍵成分。

綜上所述，茯苓甘草湯作用于PH是多成分、多靶點、多途徑的復(fù)雜機制過程，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步預(yù)測、探索了其治療PH的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子生物學(xué)機制，也為中藥復(fù)方治療PH 提供了機制研究方面的思路借鑒。