健脾清熱通絡法改善RA濕熱痹阻證患者circRNA0003353及免疫炎癥、骨代謝指標影響的回顧性數據挖掘研究*

王杰，劉健，文建庭，王馨

安徽中醫藥大學第一附屬醫院 安徽合肥 230031

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以對稱性多關節炎為主要臨床表現的自身免疫性疾病[1]，以關節滑膜慢性炎癥、關節的進行性破壞為特征，最終影響患者生活質量和社會功能[2-3]。滑膜成纖維細胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）是RA病理變化過程中的關鍵效應細胞，伴隨FLS大量的增殖、凋亡不足、炎性細胞的大量浸潤，出現骨破壞，最終導致關節畸形、功能障礙[4]。同時circRNAs是一類新型的RNA，可作為RA臨床血標本的生物標志物。在RA骨破壞的發展中發揮著獨特的作用，在FLS、成骨細胞與破骨細胞分化、分子信號通路、免疫炎癥反應等方面具有調控作用[5]。本團隊前期通過高通量測序及GO分析研究，認為circRNA0003353是參與RA炎癥反應的關鍵circRNA[6]。

濕熱痹阻證是RA主要證型之一，主要臨床表現為關節腫痛而熱，屈伸不利；發熱、口渴、不欲飲、煩悶不安、小便黃；舌質紅，苔黃膩；脈滑數或弦滑等[7]。導師劉健教授依據新安醫學從脾治痹的觀點創制具有清熱祛濕、健脾通絡中藥復方新風膠囊（Xinfeng capsule，XFC，由黃芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公 藤組成，專利號：ZL201310011369.8）、黃芩清熱除痹膠囊（Huangqin Qingre Chubi capsule， HQC，由黃芩、梔子、薏苡仁、威靈仙等組成，專利號：ZL201110095718.X）治療RA濕熱痹阻證療效明顯，可以顯著降低免疫炎癥指標如紅細胞沉降率（ESR）、超敏C-反應蛋白（hs-CRP）、類風濕因子（RF）、抗環瓜氨酸肽抗體（CCP-AB）、免疫球蛋白G（IgG）、補體C3等[8-9]。但是RA濕熱痹阻證circRNA0003353表達如何，炎癥、骨代謝指標表達如何，以及XFC聯合HQC能否改善circRNA0003353及免疫炎癥、骨代謝指標尚不明確。

回顧性數據挖掘一般是指從過往大量的數據中搜索隱藏于其中的有著特殊關系性（屬于Association rule learning）的信息的過程。主要有關聯分析、聚類分析、分類分析、異常分析、特異群組分析和演變分析等[10]。本文擬采用回顧性數據挖掘之關聯規則分析，觀察RA濕熱痹阻證患者circRNA0003353及炎癥、骨代謝指標的變化，研究健脾清熱通絡法XFC聯合HQC干預后對其的影響，為臨床應用提供借鑒。

材料與方法

1 臨床病例來源

收集安徽中醫藥大學第一附屬醫院風濕免疫科住院RA濕熱痹阻證患者（2021年4月—2021年8月）30例，25例正常人來自我院健康體檢中心。用肝素鈉抗凝管清晨空腹留取靜脈血4mL，利用Ficoll提取PBMCs，保存至-80℃冰箱備用。

2 診斷及納排標準

2.1 診斷標準 所有患者均符合2010年美國風濕病學會（ACR）聯合歐洲抗風濕病聯盟（EULAR）提出的RA診斷標準[11]；RA濕熱痹阻證中醫辨證論治方案參照2018年類風濕關節炎病證結合診療指南[7]。

2.2 納入標準 符合上述中西醫診斷；均簽署知情同意書；治療前后實驗室指標完善；住院期間均給予中醫藥治療：XFC（由黃芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公藤組成）每粒含生藥0.4 g，專利號：ZL201310011369.8；HQC（由黃芩、梔子、薏苡仁、威靈仙等組成）每粒含生藥0.4 g，專利號：ZL201110095718.X；再加中醫辨證論治[7]1劑/d，均以四周為一療程。治療藥物由安徽中醫藥大學第一附屬醫院中藥房和制劑室提供。

2.3 排除標準 關節嚴重畸形，完全喪失關節功能者；合并有心、肝、腎等嚴重疾病以及嚴重關節外表現；妊娠或哺乳期婦女；腫瘤性疾病；觀察期間應用免疫抑制劑和生物制劑的患者。

本研究經安徽中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會批準（倫理編號：2019AH-12）。

3 觀察指標

一般性指標：年齡、性別、病程；circRNA0003353表達；免疫炎癥指標：ESR、CRP、RF、IgA、IgG、IgM、C3、C4；骨代謝指標：BALP、OC、OPG、RANKL。

4 實驗試劑及儀器

4.1 DMEM 培養基（Hyclone）；胎牛血清（浙江天杭生物公司）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma 公司）；ELISA試劑盒（JYM0155Hu，JYM0082Hu，武漢基因美生物科技公司）；逆轉錄試劑盒（TaKaRa）；DAPI（Solarbio）；Fluoromount-G熒光封片劑（SourthernBiotech）；山羊抗兔的二抗（Cy3）（紅光）（Beyotime，A0516）。

4.2 熒光顯微鏡（Motic，BA410E）；普通PCR儀（杭州晶格科學儀器有限公司，K960）；熒光定量PCR儀（Thermo Scientific，PIKOREAL 96）；高速臺式冷凍離心機（安徽嘉文儀器裝備有限公司，JW-3021HR）；酶標儀（雷杜生命科學股份有限公司，RT-6000）

5 實驗方法

5.1 RT-qPCR檢測circRNA0003353的表達Trizol提取各組RA-FLS總RNA，逆轉錄反應，進行擴增反應，瓊脂糖凝膠電泳，采用Gelpro32 凝膠圖像分析軟件對PCR產物進行半定量分析，以β-actin表達量為參照采用2-△△Ct進行相對定量分析。

5.2 ELISA法檢測免疫炎癥指標ESR、CRP、RF、IgA、IgG、IgM、C3、C4，骨代謝指標BALP、OC、OPG、RANKL的表達 采集RA濕熱痹阻證患者組與正常對照組血液，室溫下自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。將上清液加入酶標板中（每孔100uL），37℃孵育1.5h，采用ELISA方法，嚴格按照各試劑盒說明書進行操作，酶標儀測定490 nm處的OD值，以上重復3次。

6 關聯規則分析

對circRNA0003353及臨床指標以四分位數為界，四分位數內取值定為“T”，四分位數外取值定為“F”，治療中有XFC聯合HQC用藥定為“T”僅有XFC或HQC取值定為“F”，設最小支持度設置為35%，最小置信度設置為85%，使用SPSS Clementine 11.1進行分析。其計算公式如下[12]:

7 統計學方法

采用SPSS 23. 0軟件進行統計學處理，采用Graphpad 8.0進行圖表制作，計量資料滿足正態性以表示，采用兩獨立樣本t檢驗；不滿足正態性以四分位數表示，采用秩和檢驗；多組數據比較采用oneway ANOVA檢驗，以P＜0.05有統計學意義。

結 果

1 RA濕熱痹阻證患者一般資料、circRNA0003353、炎癥指標、骨代謝指標變化

在納入的正常對照組與RA濕熱痹阻證患者組病例中，RA濕熱痹阻證患者年齡（52.12±11.64）歲，男5例（16.67%），女25例（83.33%），正常人患者年齡（49.66±14.09）歲，男4例（16%），女21例（84%），2組患者在年齡、性別上無顯著差異（P＞0.05），具有可比性；與正常對照組相比，RA濕熱痹阻證患者circRNA0003353、RANKL、ESR、CRP、RF、CCP-AB、IgA、IgG、IgM、C3和C4指標升高（P＜0.05），OC、BALP、OPG指標降低（P＜0.05）。見表1。

表1 RA濕熱痹阻證患者與正常人實驗室指標對比

2 circRNA0003353與RA濕熱痹阻證患者炎癥指標、骨代謝指標之間的相關性分析

Spearman相關性分析結果顯示，RA濕熱痹阻證患者circRNA0003353表達與ESR、RF、RANKL呈正相關（P＜0.05）。見圖1。

圖1 circRNA0003353與RA濕熱痹阻證患者炎癥指標、骨代謝指標之間的相關性分析

3 RA濕熱痹阻證治療前后circRNA0003353、免疫炎癥指標和骨代謝指標的變化

健脾清熱通絡法治療后，RA濕熱痹阻證患者circRNA0003353的表達下降，骨代謝指標OC、OPG、BALP升高，RANKL降低（p＜0.05），免疫炎癥指標ESR、CRP、CCP-AB、RF、IgG降低（p＜0.05），見表2。

表2 RA濕熱痹阻證治療前后免疫炎癥指標、骨代謝指標及其余各指標的變化

4 XFC聯合HQC與實驗室指標改善的關聯規則分析

關聯規則結果顯示，XFC+HQC對實驗室指標改善的支持度均大于35%、置信度均大于85%、提升度均大于1；支持度最高的前三位分別是XFC+HQC與circRNA0003353（90.00%），XFC+HQC與OPG（90.00%），XFC+HQC與RANKL（90.00%），見圖2，表3。

圖2 XFC聯合HQC與各指標改善的關聯規則分析圖

表3 XFC聯合HQC與各指標改善的關聯規則分析

討 論

中醫藥治療RA濕熱痹阻證在療效和安全性上具有顯著優勢，國醫大師范永升先生臨證經驗認為活動期RA主要以風濕熱痹型為主，運用清熱祛風通絡法治療RA效果明顯，主要使用清熱解毒、祛濕通絡、活血止痛之類中藥[13]。梁國強[14]研究發現相比于西藥對照組，吳門三黃湯聯合西藥組可以有效地降低ESR、C反應蛋白、IL-1等指標。王杰[15]通過數據挖掘和動物實驗研究發現XFC聯合HQC可以顯著降低RA濕熱痹阻證患者體內免疫炎癥指標，改善AA濕熱證大鼠關節炎腫脹程度，抑制IL-1β、IL-6、TNF-α表達，升高IL-10表達。但是采用具有健脾清熱通絡法XFC和HQC聯合應用改善RA濕熱痹阻證circRNA、免疫炎癥及骨代謝指標鮮見報道，本文研究結果表明與正常對照組相比，RA濕熱痹阻證患者體內circRNA0003353高表達，免疫炎癥指標ESR、CRP、RF、CCP-AB、IgA、IgG、IgM、C3和C4指標，骨代謝指標RANKL升高，而OC、BALP、OPG指標降低，且circRNA0003353表達與ESR、RF、RANKL呈正相關。XFC聯合HQC可以下調circRNA0003353表達，降低炎癥指標，改善骨代謝失衡。

具有健脾化濕、清熱通絡的XFC、HQC是國家發明專利（專利號：ZL201310011369.8；ZL201110095718.X），XFC由黃芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公 藤組成，以黃芪、薏苡仁為君藥，具有健脾化濕通絡作用，其中黃芪甲苷可以通過調控JNK信號通路相關細胞因子表達抑制TNF-α誘導的RA滑膜成纖維細胞增殖[16]。動物實驗表明[17]薏苡仁蛋白和薏苡仁揮發油對可以減輕AA大鼠關節紅腫的癥狀，降低關節炎癥。HQC由黃芩、梔子、薏苡仁、威靈仙等組成，以黃芩、梔子為君藥，其中黃芩素可減輕RA患者外周血單個核細胞炎癥反應[18]，梔子苷可升高IL-10表達，降低IL-17[19]。諸藥合用，共奏健脾化濕、清熱通絡之效，從而起到改善免疫炎癥和骨代謝的作用。

但是本文對于circRNA0003353是如何調控炎癥、骨代謝指標以及XFC聯合HQC如何通過調控circRNA0003353改善炎癥、骨代謝指標尚未研究。下一步我們將用系統生物學方法，觀察circRNA0003353干擾和過表達狀態下對下游指標的調控關系，以及XFC聯合HQC的干預機制。