Claudin-14 在兩種腎結石模型腎組織中表達的對比研究

楊 恒，錢 彪，王勤章，郝志強，王敬珅，汪 淵，李永樂，譚明輝，鄭麗英

（1.石河子大學醫學院第一附屬醫院泌尿外科，新疆 石河子 832008 2.贛南醫學院第一附屬醫院泌尿外科，江西 贛州 341000）

Claudin 蛋白是構成機體內最主要的緊密連接功能分子，對緊密連接細胞旁通透性發揮決定性作用[1]，主要存在于上皮細胞、內皮細胞間的連接復合體中，可使相鄰細胞膜緊靠在一起，形成圍繞細胞的物理屏障結構，防止可溶性物質從細胞一側擴散到另一側[2]。研究發現Claudin-14 基因與腎結石、骨質疏松的發病密切相關，是腎結石的主要易感基因[3]。本實驗通過構建納米細菌與乙二醇兩種腎結石動物模型，對檢測到的Claudin-14 蛋白進行系統分析，旨在從蛋白水平為腎結石病因學的解釋尋找新的突破點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 自新疆醫科大學實驗動物中心購得SPF 級[合格證號SCXK（新）2013-0001]，6 周齡左右，體重（200±20）g，Wistar 雄性大鼠90 只，實驗動物飼養于新疆地方與民族高發病教育部重點實驗室，并通過福利倫理委員會審查。動物倫理審查證號：[2016]院倫審動實字（001）號（NO）A2016-001。

1.2 儀器及試劑 電子天平（LT1000B，江蘇常熟市大量儀器有限責任公司）、全自動生化分析儀（Modual DPP，德國羅氏）、多功能光學顯微鏡及圖像采集系統（BX40，日本Olympus）、透射電鏡（JEOL-1230 Electronics，日本JEOL）、紅外光譜自動分析儀（LIIR-20，天津藍莫德）。納米細菌懸濁液[4]、0.9%生理鹽水、1.25%乙二醇飲水、1%氯化銨、兔抗Claudin-14 抗體（Santa Cruz，美國）、山羊抗兔二抗IgG（Santa Cruz，美國）等。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型的建立 90 只大鼠按隨機數表法，隨機分為空白對照組（NC 組，30 只，大鼠尾靜脈注射生理鹽水+生理鹽水灌胃2 周）、納米細菌組（NB組，30 只，大鼠尾靜脈注射NB+生理鹽水灌胃2周）、乙二醇組（EG 組，30 只，大鼠尾靜脈注射生理鹽水+1.25%乙二醇飲水和2%氯化銨2 ml/d 灌胃2周）。標準飼料飼養，飲用自來水。

1.3.2 標本采集及檢測 處死大鼠前1 d 用代謝籠收集大鼠24 h 尿液，全自動生化分析儀檢測尿鈣。取材前將大鼠用10%水合氯醛腹腔內注射麻醉，劑量為4 ml/kg；待肌肉松弛后，取腹部正中切口，打開腹部暴露腎臟及下腔靜脈，抽取靜脈血3～4 ml，行血鈣生化檢測，切取雙側腎組織，沖洗后快速冰凍保存，用粗針頭挑取腎臟冠狀剖面附近組織約0.5 g，烘干后采用紅外光譜自動分析儀進行結石成分分析。

1.3.3 免疫組化檢測Clanudin-14 蛋白表達 取病理鑒定模型成功的另一部分腎臟用于做免疫組化。免疫組化采用SP 法，石蠟包埋后切片4 μm，常規脫蠟，H2O2處理清除內源性過氧化物酶，枸緣酸緩沖液抗原修復，血清封閉。滴加Clanudin-14 抗體（1∶200），4 ℃孵育過夜，滴加二抗，DAB 顯微鏡下控制顯色，蘇木素復染，不同濃度酒精和二甲苯脫水，樹膠封片，顯微鏡下觀察1～10 周三組Wistar 雄性大鼠腎臟Clanudin-14 免疫組織化學染色情況。

1.4 統計學分析 使用SPSS 22.0 統計學軟件進行分析，血、尿鈣離子濃度用（）表示，組間比較使用兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結石成分分析 紅外光譜自動分析儀成分分析，NB 組含草酸鈣結石占總結石數的61.54%，EG 組達到78.95%，表明兩種腎結石動物模型主要成分均為草酸鈣，見表1。

表1 三組大鼠結石成分分析占比[n（%）]

2.2 血鈣、尿鈣檢測 1～10 周內，NB 組與EG 組血鈣、尿鈣濃度較NC 組漲幅明顯，NB 組與EG 組血鈣、尿鈣含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2、表3。

表2 三組大鼠血鈣對比（，mmol/L）

表2 三組大鼠血鈣對比（，mmol/L）

注：與NB 組比較，#P＞0.05

表3 三組大鼠尿鈣比較（，mmol/L）

表3 三組大鼠尿鈣比較（，mmol/L）

注：與NB 組比較，*P＞0.05

2.3 各組大鼠腎組織Claudin-14 蛋白免疫組化檢查結果 Claudin-14 在EG 組和NB 組大鼠腎組織中有持續表達，而在NC 組大鼠腎組織中未見顯著表達；第3 周后，EG 組Claudin-14 蛋白的表達較NC組增強；第4 周后，NB 組Claudin-14 蛋白的表達也開始增強，且彌漫分布在腎小管上皮細胞的細胞膜上，呈棕褐色；EG 組不同時間Claudin-14 蛋白的表達較NB 組強，且隨時間增加而增強，見圖1。

圖1 三組Wistar 雄性大鼠腎臟組織Claudin-14 的陽性表達（免疫組化×200）

3 討論

泌尿系結石是泌尿外科的常見病，其中以腎結石和輸尿管結石最為普遍[5，6]，結石成分分析顯示其中草酸鈣結石占泌尿系含鈣結石的絕大多數[7，8]。本研究利用兩種手段構造Wistar 大鼠腎結石模型，其中乙二醇與氯化銨[9]這一經典造模方式已得到廣泛認可；另外，本課題組前期利用納米細菌已成功構造腎結石動物疾病模型[4]。紅外光譜自動分析儀成分分析顯示，NB 組含草酸鈣結石占總結石數的61.54%，EG 組達到78.95%，表明兩種腎結石動物模型主要成分均為草酸鈣。

研究表明[10，11]，腎結石的發生與炎癥反應有關。草酸鈣結晶與腎小管上皮結合位點結合[12]的同時伴隨著巨噬細胞的大量聚集、中性粒細胞“氧化爆發”、氧自由基以及炎癥因子釋放增加等，提示草酸鈣晶體的形成與腎小管上皮細胞炎癥反應有關。同時腎小管上皮細胞的損傷又為晶體的粘附提供場所，如此惡性循環，進而加劇形成結石的可能性[13]。氧自由基和中性粒細胞介導局部炎癥反應不僅導致腎小管上皮細胞損傷，還可致腎小球及腎小管周圍毛細血管損傷，使腎小管上皮細胞缺乏氧氣及營養，進而細胞發生變形壞死[14]。

腎小管上皮細胞的損傷最終導致鈣離子調節失衡，尿液中過飽和鈣離子是形成結石的重要危險因素。本研究對大鼠血液、尿液中鈣離子進行定量分析，結果顯示1～10 周內，NB 組與EG 組血鈣、尿鈣濃度較NC 組漲幅明顯，NB 組與EG 組血鈣、尿鈣含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），即NB 在升高體液鈣離子含量方面與國際上公認的乙二醇、氯化銨誘導腎結石形成方面相比差異不明顯，從而進一步肯定納米細菌的成石效能。

尿鈣水平升高，激活近曲小管鈣敏感受體[15]，進而機體調鈣蛋白代償性表達增加。緊密連接蛋白（Claudins）是相鄰連接復合體的成分之一，屬于不通透連接，可限制旁細胞通路轉運和相鄰細胞間跨上皮細胞溶質與物質的運動[16]。在腎臟中，Claudins 決定沿著腎小管的不同腎單位片段的滲透性和選擇性。在髓袢升支粗段，Claudins 對鈣的重吸收是非常重要的，并受到鈣敏感受體的嚴格調控[17，18]。Claudin-14 作為緊密連接蛋白家族的一員，是構成TAL 細胞旁途徑的的重要組成蛋白[19]。有研究顯示[20]，在給予Claudin-11/Claudin-14 雙基因敲除小鼠高鈣飲食時，小鼠出現了高鎂血癥、低鎂尿癥，尿鈣未出現增高反而降低，這提示Claudin-14 可能在腎臟鈣離子的排泄過程中發揮重要作用。本研究對3 組大鼠腎臟進一步進行免疫組化檢測，發現EG 組大鼠腎組織的Claudin-14 從第3 周開始表達強度逐漸增強；NB 組大鼠腎組織的Claudin-14 從第4 周開始表達強度增強；NC 組各周腎組織中Claudin-14未見明顯表達。

綜上所述，納米細菌作為形成腎結石的原因之一，參與了草酸鈣晶體的形成，腎小管上皮細胞受損，誘導炎癥反應。鈣離子調節失衡導致Claudin-14表達增加，尿鈣升高，最終導致結石的發生。