miR-3188對胃癌細胞惡性生物學行為的作用及機制研究

王坤男，張錦明，張 蕓，張鈞則，袁新普，鄒貴軍，張朝軍

在全球范圍內，胃癌是消化系統最常見惡性腫瘤之一[1]。在我國其發病率居第二位，是導致癌癥相關死亡的重要因素[2]。隨著醫學水平不斷發展已在一定程度上改善了胃癌患者預后，但晚期胃癌患者尚無有效治療手段，中位生存期不到12個月[3-4]。因此，探索胃癌發生、發展的分子機制對胃癌防治至關重要。

microRNA是真核生物中抑制基因表達的內源性非編碼RNA，可調節細胞增殖、凋亡、腫瘤生長等生物學功能[5]。有研究[6]證實大多數癌癥中存在miRNA異常表達。相關研究[7-10]提示miR-3188在多種癌癥的發生、發展過程中發揮重要作用。該研究通過生物信息學分析預測miR-3188的下游靶基因，通過使用基因干擾技術，觀察miR-3188通過調控下游靶基因表達對胃癌細胞增殖、凋亡、侵襲及遷移能力的影響，為探究胃癌進展機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料胃癌細胞系HGC-27細胞、胃黏膜細胞系GES-1細胞購自廣州賽庫生物技術有限公司，胃癌細胞系MGC-803細胞購自北納創聯生物科技有限公司，BGC-823細胞、MKN-45細胞獲贈于陸軍軍醫大學生物醫學材料學教研室。DMEM培養基、PBS緩沖液購自索萊寶科技有限公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自Gibco公司，LipofectamineTM2000轉染試劑盒及TRIzol試劑均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；反轉錄試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit、定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM、microRNA提取試劑盒Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis and TB Green? qRT-PCR User Manual購自Takara公司；miR-3188 mimic、miR-3188 inhibitor、陰性對照以及pc-control、pc-NRAGE質粒均由蘇州吉瑪生物科技有限公司提供，含野生型和突變型NRAGE序列的熒光素酶報告基因質粒由上海吉凱基因化學技術有限公司提供；細胞周期蛋白D 1(CyclinD 1)，基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP 9)，B-cell leuke-2蛋白(Bcl-2)，N鈣黏蛋白(N-cadherin)，波形蛋白(Vimentin)，E鈣黏蛋白(E-cadherin)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG二抗及電化學發光(ECL)液購自江蘇親科生物研究中心有限公司；NRAGE抗體購自Abcam公司，雙熒光素酶檢測報告試劑盒購自美國Progema公司；Transwell小室、Matrigel基質膠購自美國Corning公司；RIPA、BCA蛋白定量試劑盒等蛋白免疫印跡實驗所需試劑均購自北京陽光英銳生物有限公司；CCK-8試劑盒購自北仁化學科技(北京)有限公司，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自Miltenyi Biotec公司。

1.2 細胞轉染及分組細胞系HGC-27、MGC-803、BGC-823、MKN-45及GES-1放入含有10% FBS的DMEM培養基，在37 ℃、5%CO2、相對濕度95%的恒溫培養箱內培養。當細胞匯合度到80%左右時進行傳代。將HGC-27細胞分為陰性對照組(miR-NC組、antimiR-NC組)：轉染對照模擬物、對照抑制物；miR-3188上調組(miR-3188組)：轉染miR-3188 mimic；miR-3188下調組(antimiR-3188組)：轉染miR-3188 inhibitor；miR-3188+pc-control組：共同轉染miR-3188 mimic與陰性對照質粒；miR-3188+pc-NRAGE組：共同轉染miR-3188 mimic與NRAGE過表達質粒。將miRNA模擬物NC(miR-NC)、miRNA抑制物NC(antimiR-NC)、miR-3188 mimic、miR-3188 inhibitor、陰性對照質粒(pc-control)、NRAGE過表達質粒(pc-NRAGE)分別或共同轉染至HGC-27細胞中，嚴格按照轉染試劑盒說明書進行操作,首先將細胞均勻接種至6孔板中，待細胞匯合度至40%左右時，使用LipofectamineTM2000試劑進行細胞轉染，轉染48～72 h后進行后續實驗。

1.3 qRT-PCR檢測細胞中miR-3188及NRAGE mRNA表達水平采用TRIzol提取細胞總RNA后進行反轉錄。根據SYBR Premix Ex TaqTM、Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis and TB Green? qRT-PCR User Manual說明書進行qRT-PCR檢測。miR-3188以U6為內參基因，NRAGE以GAPDH為內參基因，用公式2-ΔΔCt計算miR-3188和NRAGE mRNA表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 生物信息學分析使用基因預測網站Tar-getScan(www.targetscan.org)預測miR-3188的下游靶基因，從TCGA數據庫(https://cancergenome.

nih.gov)下載胃癌患者的基因表達數據并分析miR-3188與所預測靶基因表達的相關性。

1.5 雙熒光素酶報告實驗利用生物信息分析數據庫(TargetScan)預測NRAGE mRNA的3′UTR存在miR-3188的結合位點，分別構建重組熒光素酶報告基因質粒pGL3-NRAGE-3′UTR(WT-NRAGE)及突變熒光素酶報告基因質粒pGL3-NRAGE-3′UTR(MUT-NRAGE)，按照轉染試劑說明將WT-NRAGE和MUT-NRAGE轉染至細胞中，同時將miR-control或miR-3188 mimic轉入各組細胞中，轉染48 h后按照熒光素酶檢測試劑盒說明書檢測細胞熒光素酶活性。

1.6 Western blot檢測轉染后HGC-27細胞中NRAGE、CyclinD 1、Bcl-2、MMP 9及EMT相關蛋白表達收集各組對數生長期細胞，PBS洗滌細胞2次，加入RIPA裂解液，經12 000 r/min離心10 min后吸取上清液，測定蛋白濃度后各蛋白樣品分別加入5倍上樣緩沖液，金屬浴變性5 min。取等量蛋白進行SDS-PAGE電泳實驗(80 V 20 min；120 V 90 min)，電泳結束后轉移至PVDF膜，將PVDF膜剪裁為合適大小，室溫下用5% 脫脂奶粉封閉2 h，加入各蛋白一抗(除GAPDH稀釋比例為1 ∶5 000外，其余蛋白一抗稀釋比例均為1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，5 min/次，加入二抗(稀釋比例1 ∶8 000)于室溫條件下孵育1 h，TBST洗滌3次，5 min/次，加入ECL化學發光試劑進行曝光拍照。

1.7 CCK-8法檢測HGC-27細胞增殖率將各組細胞經胰蛋白酶消化后重新調整細胞濃度為5×105個/ml，以5 000個/孔的密度將細胞接種至96孔板內,每組設置6個復孔。分別在培養48、72 h后，每孔加入10 μl CCK-8試劑，于細胞培養箱內孵育1 h，使用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度(optical density，OD)值。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡情況各組細胞經PBS洗滌、胰蛋白酶消化后重懸調整細胞濃度為1×106個/ml，收集細胞后加入1 ml 1×binding Buffer洗滌兩次后，加入5 μl Annexin V-FITC混勻、室溫下避光孵育15 min，使用1 ml 1×Binding Buffer洗滌細胞，重懸細胞加入5 μl PI后使用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.9 Transwell實驗檢測HGC-27細胞侵襲和遷移能力預備：將基質膠至于4 ℃冰箱內過夜解凍，次日使用無血清DMEM培養基將基質膠稀釋至30 mg/ml，取100 μl稀釋液置于Transwell小室上室；細胞處理：收集各組處于對數生長期的HGC-27細胞，胰蛋白酶消化后制備細胞懸液，調整細胞密度為5×105個/ml，取100 μl細胞懸液置于鋪滿基質膠的Transwell小室的上室；恒溫細胞培養箱內孵育24 h后用沾有PBS的棉簽除去基質膠及Transwell小室的上室細胞，用多聚甲醛固定20 min，結晶紫溶液染色20 min，在顯微鏡下隨機選取5個視野計數。細胞遷移實驗：除去制備基質膠實驗步驟外，其余實驗步驟均與細胞侵襲實驗相同。

1.10 統計學處理采用SPSS 21.0統計軟件進行數據統計分析及制圖。本研究統計數據均采用均值±標準差進行表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，雙連續變量相關性分析采用Pearson檢驗。當P<0.05時，說明數據差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃黏膜細胞及胃癌細胞中miR-3188的表達水平qRT-PCR實驗結果顯示，miR-3188在 HGC-27、MGC-803、BGC-823、MKN-45 中的相對表達量低于 GES-1，其中 HGC-27 細胞中 miR-3188 相對表達量最低，選擇 HGC-27 細胞進行后續實驗，胃黏膜膜細胞同胃癌細胞系中的miR-3188相對表達量差異有統計學意義(F=362，P<0.001)，見圖1。

圖1 qRT-PCR檢測正常胃黏膜細胞及胃癌細胞系中miR-3188表達與正常胃黏膜細胞GES-1比較：***P<0.001

2.2 miR-3188靶向調控胃癌細胞中NRAGE的表達生物信息分析數據庫(TargetScan)預測NRAGE可能是miR-3188的靶基因，使用TCGA數據庫進行數據挖掘，Spearman相關分析提示在胃癌中NRAGE的表達量與miR-3188表達量呈負相關(rho=-0.22，P<0.05)，見圖2A。雙熒光素酶報告實驗顯示，在WT-NRAGE轉染的細胞中，與miR-control轉染組細胞相比較，miR-3188 mimic 轉染組的細胞熒光素酶活性降低，差異有統計學意義(F=1.791，P<0.01)，共轉染MUT-NRAGE與miR-3188 mimic的細胞熒光素酶活性未見改變，差異無統計學意義(F=1.388，P>0.05)，見圖2B。Western blot檢測轉染miR-3188 mimic、miR-3188 inhibitor及其陰性對照物miR-NC、antimiR-NC的HGC-27細胞中NRAGE蛋白的表達水平，結果顯示轉染miR-3188 mimic的HGC-27細胞中miR-3188組NRAGE蛋白表達水平低于miR-NC組，而轉染miR-3188 inhibitor的HGC-27細胞中antimiR-3188組NRAGE蛋白表達水平高于antimiR-NC組。qRT-PCR檢測結果顯示，各組NRAGE mRNA表達水平差異無統計學意義(F=24.08，P>0.05)，見圖3。

圖2 miR-3188在HGC-27細胞中與NRAGE 3的靶向關系A：生物信息學分析預測miR-3188與NRAGE 3′UTR的結合位點及在胃癌組織中miR-3188與NRAGE表達水平的相關性；B：雙熒光素酶報告實驗驗證miR-3188的靶基因；與WT-NRAGE+miR-control比較：**P<0.01

圖3 miR-3188對HGC-27細胞NRAGE蛋白及mRNA表達水平的影響A：miR-NC組；B：miR-3188組；C：antimiR-NC組；D:antimiR-3188組

2.3 miR-3188通過調控NRAGE表達抑制HGC-27細胞增殖CCK-8實驗結果顯示，轉染48 h時，同miR-NC組相比，miR-3188組細胞增殖率降低，差異有統計學意義(F=14.504，P<0.001)，而miR-3188 mimic+pc-NRAGE組的細胞增殖率高于miR-3188 mimic+pc-control組，差異有統計學意義(F=2.630，P<0.001)；轉染72 h時，同miR-NC組相比，miR-3188 mimic組細胞增殖率降低，差異有統計學意義(F=8.301，P<0.001)，而miR-3188 mimic+pc-NRAGE組的細胞增殖率高于miR-3188 mimic+pc-control組，差異有統計學意義(F=2.125，P<0.001)，見圖4。

圖4 miR-3188靶向NRAGE對HGC-27細胞增殖的影響與miR-NC組比較：***P<0.001；與miR-3188+pc-control組比較：###P<0.001；A:miR-NC組；B:miR-3188組；C:miR-3188+pc-control組；D:miR-3188+pc-NRAGE組

2.4 miR-3188通過調控NRAGE表達促進HGC-27細胞凋亡流式細胞術實驗結果提示，同miR-NC組相比，miR-3188組的細胞凋亡率增加，差異有統計學意義(F=16.735，P<0.001)，而miR-3188+pc-NRAGE組細胞凋亡率低于miR-3188+pc-control組，差異有統計學意義(F=1.96，P<0.01)，見圖5。

圖5 miR-3188靶向NRAGE對HGC-27細胞凋亡的影響A：流式細胞術檢測各組細胞凋亡率變化；B：與miR-NC組比較：***P<0.001；與miR-3188+pc-control組比較：##P<0.01；a：miR-NC組；b：miR-3188組；c：miR-3188+pc-control組；d：miR-3188+pc-NRAGE組

2.5 miR-3188通過調控NRAGE表達抑制HGC-27細胞侵襲及遷移能力Transwell實驗結果提示，同miR-NC組相比，miR-3188組各視野下的細胞侵襲數下降，差異有統計學意義(F=5.760，P<0.01)，各視野下的細胞遷移數下降，差異有統計學意義(F=4.590，P<0.01)；同miR-3188+pc-control相比，miR-3188+pc-NRAGE組各視野下細胞侵襲數升高，差異有統計學意義(F=2.151，P<0.01)，各視野下細胞遷移數升高，差異有統計學意義(F=3.361，P<0.01)，見圖6。

圖6 miR-3188靶向NRAGE對HGC-27細胞侵襲、遷移能力的影響 ×200與miR-NC組比較：**P<0.01；與miR-3188+pc-control組比較：##P<0.01

2.6 miR-3188通過調控NRAGE表達抑制HGC-27細胞的增殖、凋亡、轉移、EMT相關蛋白的表達Western blot結果顯示，miR-3188組的N-cadherin、Vimentin、CyclinD 1、Bcl-2、MMP 9蛋白表達水平低于miR-NC組，而miR-3188+pc-NRAGE組N-cadherin、Vimentin、CyclinD 1、Bcl-2、MMP 9的表達水平高于miR-3188+pc-control組，同時miR-3188組E-cadherin蛋白表達水平高于miR-NC組，而miR-3188+pc-NRAGE組E-cadherin蛋白表達水平低于miR-3188 mimic+pc-control組，見圖7。

圖7 miR-3188靶向調控NRAGE對HGC-27細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移、EMT相關蛋白表達影響A：miR-NC組；B：miR-3188組；C：miR-3188+pc-control組；D：miR-3188+pc-NRAGE組

3 討論

胃癌是當前威脅人類生命健康的常見惡性腫瘤之一，探索胃癌的發病機制及尋找潛在治療靶點仍是需要解決的重要難題。大量研究已經證實miRNA在眾多癌癥當中存在異常表達，其在癌癥的診斷及治療方面的價值不言而喻，同時越來越多的研究亦表明miRNA密切參與調控胃癌的發展過程。例如，miR-505可通過靶向調控HMGB 1抑制胃癌細胞增殖并促進胃癌細胞凋亡[11]。相反，miR-532可靶向調控NKD 1促進胃癌細胞的遷移和侵襲[12]。miRNA在胃癌發展過程中可扮演多種角色并發揮重要作用，因此研究miRNA對胃癌細胞的生物學行為的影響對探索胃癌發病機制及發展過程具有重要意義。

有研究[7]證實miR-3188在不同癌癥當中發揮重要作用，例如在鼻咽癌中，miR-3188可作為腫瘤抑制因子直接靶向mTOR參與FOXO 1介導的細胞生長抑制，腫瘤發生和鼻咽癌化療耐藥。miR-3188在頭頸部癌(HNC)細胞系、組織來源的外泌體及其親本癌癥相關成纖維細胞(CAFs)中低表達，外泌體內的miR-3188可通過靶向Bcl-2影響HNC細胞的增殖和凋亡[8]。miR-3188在非小細胞肺癌(NSCLC)細胞中通過mTOR/PI3K/AKT/c-jun信號通路與FOXO 1相互作用從而抑制NSCLC細胞增殖[9]。相反，miR-3188在乳腺癌組織和細胞中表達上調，并可通過抑制p 27促進乳腺癌細胞增殖[10]。本研究結果顯示miR-3188在胃癌細胞中的表達量低于正常胃黏膜細胞，通過在胃癌細胞HGC-27中轉染miR-3188 mimic，并進行CCK-8實驗、流式細胞術、Transwell實驗，實驗結果顯示在胃癌細胞HGC-27中過表達miR-3188能夠抑制胃癌細胞的增殖、侵襲、遷移并促進其發生凋亡，miR-3188可能在胃癌發展過程中發揮抑癌作用。

本研究通過生物信息學分析預測NRAGE可能是miR-3188的靶基因，有研究[13]表明，在胃癌組織中NRAGE表達上調與TNM分期、局部浸潤和預后不良相關。此外，熒光素酶報告實驗結果顯示，在WT-NRAGE轉染的細胞中，miR-3188過表達降低熒光素酶活性，而在MUT-NRAGE轉染的細胞中，則未見熒光素酶活性降低，該結果顯示NRAGE是miR-3188的靶基因。通過在胃癌細胞HGC-27中分別轉染miR-3188 mimic及miR-3188 inhibitor，Western blot及qRT-PCR結果顯示miR-3188可負向調控NRAGE蛋白表達，但不影響其mRNA表達水平。為進一步探究胃癌細胞中miR-3188是否通過調控NRAGE發揮抑癌作用，將pc-control及pc-NRAGE分別轉染至miR-3188過表達的HGC-27細胞中，CCK-8實驗、流式細胞術、Transwell結果顯示轉染pc-NRAGE可逆轉miR-3188對胃癌細胞HGC-27增殖、侵襲及遷移能力的抑制作用，并減少細胞凋亡。CyclinD 1、Bcl-2、MMP 9分別是細胞增殖、凋亡、侵襲及遷移生物學行為的重要標志蛋白[14-15]。Western blot結果提示miR-3188/NRAGE軸可能通過干擾上述蛋白表達而抑制胃癌細胞發展。EMT機制在腫瘤的侵襲、轉移過程中發揮重要作用，E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等蛋白是EMT的標志蛋白[15]。本研究結果顯示胃癌細胞HGC-27中miR-3188過表達可通過抑制NRAGE表達導致N-cadherin、Vimentin蛋白表達下調同時促進E-cadherin蛋白表達。這一結果提示在胃癌細胞HGC-27中，miR-3188可能通過靶向調控NRAGE抑制EMT進程。

綜上所述，miR-3188過表達可抑制胃癌細胞的生長，其作用機制可能與通過靶向調控NRAGE的表達有關，該研究結果為探索胃癌發展機制及找尋新的胃癌治療靶點提供了實驗依據。