大腸桿菌感染對綿羊乳腺成纖維細胞損傷及TLR4表達的影響

馬小軍，王加冕，李世瑛，顏麗嬌，麻強生，張小麗

(1.甘肅農業大學 動物醫學院，甘肅 蘭州 730070；2.申聯生物股份有限公司，甘肅 蘭州 730070；3.新疆昌吉市大西渠鎮農業畜牧業發展服務中心，新疆 昌吉 831100)

動物乳腺炎是由多種因素作用引起的乳腺炎癥，最常見的致病因素為病原微生物感染[1-2]。動物乳腺炎的病原微生物種類繁多，多達150種以上，最為常見的病原微生物是細菌、病毒、支原體及真菌等，其中大腸桿菌占我國奶牛乳房炎臨床分離病原菌總量的14.4%[3]。大腸桿菌性乳腺炎有2個最為顯著的特點，即流行性和急性；大腸桿菌屬于環境性致病菌，飲水、糞便、泥土、墊料及擠奶工具等都會成為其傳播介質；大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，具有LPS、外毒素、黏附素及莢膜等多種致病力較強的毒性物質，大腸桿菌通過動物乳腺侵入血循環，細菌突破機體防御機制后在血液中生長、定居、繁殖并釋放毒素，最終引起機體全身急性敗血癥，從而導致動物泌乳量減少、生產性能降低甚至急性死亡[4]。成纖維細胞的功能包括構成結締組織、參與膠原纖維形成、分泌免疫蛋白、修復創傷及防治疾病，電鏡觀察可見成纖維細胞胞質中含有大量粗面內質網、核糖體和高爾基體，這表明成纖維細胞具有強大的合成及分泌蛋白功能；Picard等[5]、Davidson等[6]及von Bernuth等[7]研究指出，成纖維細胞可被用來定位并研究病原體檢測和信號通路，其分泌的免疫蛋白可參與機體的免疫活動，在抗擊感染中發揮重大作用，不少國內外研究發現也都預示著乳腺成纖維細胞的免疫機制在乳腺炎防治中有著重大意義。

TLRs是非特異性免疫系統中的主要模式識別受體，具有感知病原體侵襲、刺激免疫信號通路活化及調節免疫反應的重大功能；TLRs不僅參與機體的先天性免疫應答，同時也是維系機體先天性與獲得性免疫的關鍵樞紐。1997年，Medzhitov等[8]發現了第一個存在于人體細胞表面的Toll樣受體蛋白，它可激活適應性免疫有關基因，同時在人體抗感染免疫中有重要意義，該蛋白后來被稱為TLR4；隨后Poltorak等[9]發現TLR4可識別內毒素(LPS)，同時發現TLR4突變而喪失功能的小鼠對LPS并無反應，從而推測TLR4是LPS的特異性識別受體[10]。急性大腸桿菌乳腺炎的核心階段是大腸桿菌細胞壁上的LPS與細胞膜表面受體TLR4的識別，目前TLR4與綿羊乳腺炎的相關報道甚少，Goldammer等[11]為了分析先天免疫系統在抵抗乳腺感染中的作用，測定了健康和受感染的乳腺組織中TLR9、TLR2、TLR4、BNBD5的mRNA豐度，結果顯示，除TLR9外，其他基因在受感染組織中mRNA豐度均顯著增加 (4～13倍)，這表明TLR4與先天性免疫系統在抵御乳腺炎中有著重大作用；王興平等[12]對牛TLR4基因的遺傳多態性與乳腺炎的關聯進行了研究，他們分析并指出TLR4基因可能作為奶牛乳房炎抗性的候選基因。

目前，我國對于治療乳腺炎常用抗生素療法，該療法副作用大且易增強細菌耐藥性；機體的免疫反應作為機體抵抗病原微生物感染的重要途徑，具有重大研究價值與意義。由于TLR4作為LPS的特異性識別受體，其在大腸桿菌性乳腺炎中必定扮演著重要角色，了解TLR4在大腸桿菌引發細胞損傷中的具體分子信號轉導機制，有助于更清晰地認識大腸桿菌性乳腺炎；通過研究大腸桿菌對細胞損傷的影響，探究LPS特異性識別受體TLR4對乳腺炎發生發展的影響，有助于在分子水平了解機體自身的免疫機制，發掘機體的免疫能力以提高自身抗病性能，為有效防治乳腺炎提供基礎資料。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

主要試劑：Giemsa染液、細胞增殖檢測試劑盒、caspase-4，5活性測定試劑盒、高效細胞裂解液，索萊寶；DME/F-12細胞基礎培養基，HyClone；FBS，Biological Industries；乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒，建成；HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)、ChamQ Universal SYBR qPCR、Bradford 蛋白濃度測定試劑盒，諾唯贊；TRIzol，Ambion；TLR4 阻斷劑 CLI-095，InvivoGen；GEN，Biofroxx；0.22 μm PVDF 膜，Millipore；兔抗TLR4抗體，兔抗β-Actin抗體，羊抗兔IgG H&L標記抗體，博奧森。

主要儀器：梯度基因擴增儀，德國Eppendorf；qRT-PCR儀，美國Applied Biosystems；瓊脂糖凝膠成像儀，美國BIO-RAD；全自動化學發光免疫分析儀，美國Beckman Coucter；全自動酶標儀，美國BioTek；超微分光光度計，美國Thermo。

1.2 試驗方法

1.2.1 綿羊乳腺成纖維細胞的原代培養 酶消化法結合差速消化法獲得乳腺成纖維細胞[13]。選擇處于泌乳期且無乳腺炎病史的健康小尾寒羊，飼養觀察14 d后無異?，F象采集綿羊乳腺組織，剪碎組織后加入消化液(DME/F-12培養基中含 200 U/mL Ι 型膠原酶及120 U/mL透明質酸酶)消化3 h，收集細胞懸液于細胞瓶中繼續培養，純化時使0.05%胰蛋白酶消化 2 min收集成纖維細胞。

1.2.2 Giemsa染色法鑒定乳腺成纖維細胞 成纖維細胞的鑒定采用Giemsa染色法。細胞爬片上細胞貼壁面積達80%后用預冷PBS洗3次，混合液(PBS∶甲醇= 1∶1)染色2 min，甲醇固定后Giemsa染色2 min[14]，蒸餾水洗去染液后顯微鏡下觀察。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖率 采用MTT比色法檢測細胞增殖率[15]。調整細胞濃度為1.0×106個/mL，96孔板中每孔接種200 μL細胞懸液，細胞培養箱中分別培養0.5，1，2，3，4 d，設置調零孔，每組6個重復；MTT染色后加入Formazan溶解液振蕩10 min，酶標儀測定OD492。

1.2.4 LDH法篩選大腸桿菌最適感染比 采用微量酶標法檢測大腸桿菌感染細胞后培養上清液中LDH的釋放量[16]。96孔板中細胞貼壁90%以上后棄培養液，將大腸桿菌按照MOI=1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1 人工感染細胞 1，2，3，4，5 h，設置對照組不感染大腸桿菌，每組4個重復，收集細胞培養上清液。根據說明書操作后測定OD450，計算LDH 的活力(單位：U/L)，即LDH 釋放量。

1.2.5 qPCR檢測細胞凋亡因子caspase-3基因表達 采用TRIzol法提取綿羊乳腺成纖維細胞總RNA[17]，超微分光光度計測定RNA的純度與濃度。2步法合成cDNA：4×gDNA wiper Mix，4 μL；RNA模板，1 μg；DEPC水補充總體積至16 μL；42 ℃反應2 min；向16 μL混合液中加入4 μL 5×HiScript Ⅱ qRT SuperMix Ⅱ；50 ℃反應 15 min，85 ℃反應 5 s。qRT-PCR 使用 25 μL反應體系：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，12.5 μL；DEPC水，8.5 μL；上、下游引物各 1 μL(表1)；模板 2 μL。95 ℃預變性10 min；95 ℃變性 15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s。根據所得Ct值計算caspase-3mRNA相對表達量，結果用 2-ΔΔCt表示。

表1 綿羊caspase-3引物信息Tab.1 Sheep caspase-3 primer information

1.2.6 比色法檢測細胞焦亡蛋白caspase-4，5 酶活性變化 收集細胞蛋白裂解液至離心管中，Bradford法測定并調整蛋白濃度。根據說明書操作，設置空白組、對照組及試驗組，每組3個重復，反應底物最后加入以確保反應起始時間相同。37 ℃培養至肉眼觀察板內液體變黃后測定OD405，計算細胞蛋白裂解液中caspase-4，5的活性變化百分比。

1.2.7 qRT-PCR及WB檢測TLR4的表達 qRT-PCR檢測TLR4的表達參照1.2.5，綿羊TLR4引物信息如表 2 所示。WB檢測TLR4蛋白表達，RIPA收集細胞總蛋白上清液，BCA法測定并調整蛋白濃度，蛋白變性后收集上清進行蛋白印跡分析[18]。目的蛋白TLR4的分子量大小為93 ku，選取5%的濃縮膠進行電泳，收集膠塊后轉膜，將PVDF膜置于孵育盒中，5% 脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，熒光標記二抗(1∶3 000)37 ℃孵育1 h；取Signal Fire ECL試劑滴于膜表面，化學發光儀顯色曝光。

表2 綿羊TLR4引物信息Tab.2 Sheep TLR4 primer information

1.2.8 MTT法檢測TLR4阻斷劑CLI-095的細胞毒性作用 細胞于96孔板中長至單層后進行試驗，每孔加入100 μL TLR4阻斷劑CLI-095(終濃度1 μg/mL)，37 ℃孵育細胞0.5，1，2 h后采用MTT法檢測細胞增殖率，方法參照 1.2.3；同時設置不使用阻斷劑的細胞作為對照組，每組6個重復。

1.2.9 qRT-PCR檢測CLI-095對TLR4的阻斷效果 非阻斷組處理：大腸桿菌感染綿羊乳腺成纖維細胞(MOI=4∶1)，37 ℃培養1 h；阻斷組處理：每孔加入100 μL TLR4阻斷劑CLI-095(1 μg/mL)，37 ℃孵育1 h，大腸桿菌感染細胞1 h(MOI=4∶1)，每組3個重復。參照1.2.5，利用qRT-PCR法檢測各組別TLR4mRNA的相對表達量，驗證CLI-095的阻斷效果。

1.2.10 平板活菌計數法檢測CLI-095對大腸桿菌黏附乳腺成纖維細胞的影響 細菌感染細胞 4 h后PBS洗去未黏附的細菌；每孔加入 1 mL 1% Triton X-100室溫通透處理10 min，收集裂解液后平板活菌計數法測定細菌黏附數，每組取 200 μL細胞裂解液平板涂布，每組3個重復。細菌黏附數(單位：cfu/mL)=3個平板菌落平均數×5×稀釋倍數，阻斷率=(非阻斷組-阻斷組)/非阻斷組×100%。

1.3 數據處理

試驗數據均使用IBM SPSS Statistics 19進行單因素方差分析，P<0.05 、P<0.01 或P<0.001 表示數據具有統計學意義，利用OriginProPorable軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 綿羊乳腺成纖維細胞培養及鑒定結果

細胞培養及純化結果如圖 1 所示，圖 1 左為原代培養所得到的乳腺細胞，細胞貼壁狀況良好且形態特征明顯，綿羊乳腺成纖維細胞為長梭狀、乳腺上皮細胞為鋪路石狀；圖 1 右為純化后的乳腺成纖維細胞，細胞純度達90%以上。Giemsa染色如圖 2 所示，成纖維細胞染色后呈藍紫色、邊緣光滑、排列整齊。

圖1 乳腺成纖維細胞形態Fig.1 Mammary fibroblast morphology

圖2 乳腺成纖維細胞Giemsa染色Fig.2 Giemsa staining of mammary fibroblasts

2.2 MTT法檢測細胞增殖率

在細胞培養1～4 d內 490 nm處OD值隨著時間延長逐漸升高，說明細胞增殖率逐漸升高，反映細胞活力良好(圖3)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖4，6—9，11同。

2.3 LDH法篩選最適MOI比值

當MOI為 1∶1、2∶1、3∶1、5∶1時，LDH釋放量均為不規則變化，無統計學意義；當MOI比值為4∶1。時，大腸桿菌感染乳腺成纖維細胞1～5 h內細胞培養液中LDH的釋放量分別為75.81，95.46，188.27，213.36，229.48 U/L，且LDH的釋放量隨著感染時間的延長均顯著升高(P<0.05)，說明隨著感染時間的延長，細胞損傷程度逐漸加深(圖4)，同時表明大腸桿菌對細胞的損傷是快速且持續的，因此選用MOI比值=4∶1建模最具統計學意義。

圖4 LDH釋放量的變化Fig.4 Changes in LDH release

2.4 大腸桿菌感染細胞后細胞狀態

大腸桿菌感染細胞(MOI比值= 4∶1)后，倒置顯微鏡觀察細胞狀態。如圖 5 所示，大腸桿菌感染細胞后細胞形態特點逐漸消失，并產生圓形小泡，且隨著感染時間的延長，這一現象越來越明顯。

圖5 倒置顯微鏡觀察大腸桿菌感染成纖維細胞Fig.5 Inverted microscope observation of E.coli infected fibroblasts

2.5 caspase-3基因表達

大腸桿菌感染細胞后caspase-3mRNA表達情況如圖 6 所示。與對照組相比，大腸桿菌感染綿羊乳腺成細胞后1～5 h內caspase-3mRNA表達量顯著增加至1.30～2.08倍(P<0.05)。

圖6 caspase-3 mRNA相對表達量Fig.6 Relative expression of caspase-3 mRNA

2.6 caspase-4，5酶活性變化

大腸桿菌感染細胞后caspase- 4，5酶活性變化如圖 7 所示。與對照組相比感染 1～3 h內caspase-4活性逐漸上升，caspase-5活性顯著上升(P<0.05)；在感染時間超過3 h后，caspase-4活性逐漸下降(P>0.05)，caspase-5活性顯著下降(P<0.05)。

圖7 caspase-4，5酶活性變化Fig.7 caspase-4，5 enzyme activity change

2.7 CLI-095對細胞的毒性作用

CLI-095說明書指出阻斷劑孵育細胞 1 h即可達到阻斷TLR4表達的效果，因此，檢測2 h內阻斷劑對細胞增殖率的影響足夠判斷本試驗中阻斷劑對細胞有無毒性作用。試驗結果見圖 8，阻斷劑作用細胞后 2 h內ΔOD490顯著升高(P<0.05)，說明此時細胞活力仍正常，因此該抑制劑可用于后續試驗。

圖8 CLI-095對細胞增殖率的影響Fig.8 Effect of CLI-095 on cell proliferation rate

2.8 TLR4 mRNA表達

大腸桿菌感染細胞后TLR4mRNA表達量如圖 9 所示。非阻斷組結果顯示細菌感染細胞1～2 h內，TLR4mRNA相對表達量顯著上升(P<0.05)，感染2 h后TLR4表達量顯著下降(P<0.05)；阻斷組結果顯示，在細菌感染細胞1～3 h內，TLR4mRNA的相對表達量顯著上升(P<0.05)，感染3 h后TLR4表達量下降但無明顯規律；阻斷組與非阻斷組對比可知，阻斷劑孵育細胞 1 h后，細菌感染細胞1～4 h內對TLR4mRNA的表達均有顯著抑制效果(P<0.05)。

圖9 TLR4 mRNA相對表達量Fig.9 Relative expression of TLR4 mRNA

2.9 TLR4蛋白表達

大腸桿菌感染細胞后TLR4蛋白表達情況如圖 10，11 所示，TLR4蛋白的相對表達量在大腸桿菌感染細胞1～2 h內顯著升高(P<0.05)，2 h后逐漸下降(P<0.05或P>0.05)。

圖10 TLR4蛋白表達Fig.10 TLR4 protein expression

圖11 TLR4蛋白相對表達量Fig.11 Relative expression of TLR4 protein

2.10 細菌黏附數測定

平板活菌計數結果見表 3，非阻斷組的大腸桿菌黏附數為(40.3×106)cfu/mL，阻斷組的大腸桿菌黏附數為 (33.0×106)cfu/mL；TLR4阻斷劑CLI-095處理細胞后，細菌的黏附力有所下降，計算得出細菌黏附阻斷率為18.32% 。

表3 細菌黏附數及黏附阻斷率Tab.3 Bacterial adhesion number and adhesion blocking rate

3 討論

目前乳腺細胞已被用來研究哺乳動物乳腺生長發育、泌乳機理、乳腺疾病的理想模型[19]，Kandasamy等[20]利用體外培養獲得奶牛乳腺成纖維細胞，大腸桿菌LPS感染后分析了細胞基因組的表達情況，結果顯示，試驗組IL-8、TNF-α基因表達存在顯著性差異；Kandasamy 等[21]利用大腸桿菌LPS人工感染奶牛乳腺成纖維細胞建立大腸桿菌性乳腺炎細胞模型，從43頭泌乳早期的奶牛中分離得到乳腺成纖維細胞，細胞經LPS感染后將各組IL-8蛋白的產生量進行了分析排序，結果顯示，未感染LPS的細胞不分泌IL-8，LPS處理后的細胞在IL-8表達的變化量高達7倍左右；Benjamin等[22]利用金黃色葡萄球菌感染奶牛乳腺成纖維細胞，根據細胞的反應性將奶牛分為低反應型和高反應型，結果表明，乳腺成纖維細胞可作為進一步研究動物對乳腺感染反應差異的參考模型，這些研究發現都預示著乳腺成纖維細胞的免疫機制在乳腺炎防治中有著重要意義。本試驗采用透明質酸酶結合Ι型膠原酶的酶消化法分離并獲得乳腺成纖維細胞，利用MTT法檢測細胞增殖率，結果顯示，細胞活力良好，可用于后續試驗。

LDH主要存在于細胞質中，細胞受損后細胞膜破裂，LDH釋放至胞外，故細胞培養液中LDH的活力是反映細胞損傷的重要指標。Wellnitz等[23]為了研究體細胞SCC數和LDH活性在脂多糖(LPS)大腸桿菌性乳腺炎中的情況，發現LPS刺激可使牛奶SCC升高，且牛奶中LDH活性隨著LPS的刺激而增加；SCC數升高和LDH活性增加反映了乳腺受損嚴重、機體免疫效率降低，這可能是由于細胞受損后無法參與產生免疫調節因子，同時說明乳腺細胞與乳腺組織的免疫功能密切相關。本試驗結果顯示，當大腸桿菌感染細胞后細胞培養液中LDH活力顯著上升，說明細胞受損隨著感染時間的延長進一步加強；大腸桿菌感染細胞3 h后細胞培養液中LDH的釋放量即達到188 U/L，這與王胤杰[24]在研究金黃色葡萄球菌對奶牛乳腺上皮細胞LDH影響的結果相比，金葡菌在感染細胞8 h后才達到這一水平，這也說明大腸桿菌對細胞的損傷更為迅速，同時驗證了大腸桿菌性乳腺炎具有急性這一特點[25-27]。Caspase是一類蛋白酶，在細胞質中表達不同的亞型，caspase-3位于級聯反應的下游，在細胞凋亡中占據主導位置[28]，caspase-3作為凋亡反應的效應子，其mRNA的相對表達量上調是細胞凋亡的標志性現象；caspase-4，5為炎性半胱天冬酶，在細胞焦亡中主要通過炎癥反應實現生理功能。大腸桿菌感染后caspase-3、caspase-4、caspase-5表達均顯著性升高(P<0.05)；這反映大腸桿菌通過活化caspase-3來執行細胞凋亡信號，通過激活caspase-4，5誘導細胞發生焦亡；崔新潔[29]在用金黃色葡萄球菌誘導牛乳腺上皮細胞凋亡的過程中發現，凋亡過程中caspase-3基因表達顯著性升高，與本試驗結果一致。目前細胞焦亡在人及小鼠的研究中較為廣泛，在綿羊乳腺炎中報道甚少。大腸桿菌作為革蘭氏陰性菌，引起細胞焦亡的主要效應因子是caspase-4、caspase-5、caspase-11，本試驗結果顯示在大腸桿菌性乳腺炎中caspase-4、caspase-5酶活性變化百分比均存在顯著性升高。

TLR4是細胞膜表面的受體，同時也是介導LPS應答的特異性受體。本試驗結果表明,TLR4在感染大腸桿菌的綿羊成纖維細胞中基因和蛋白水平的表達均明顯上升，說明TLR4在大腸桿菌性乳腺炎的發病機制中發揮了一定的作用。目前，關于TLR4與綿羊乳腺炎的相關報道甚少，Goldammer等[11]為了分析先天性免疫應答在抵抗乳腺感染中的作用，測定了健康和受感染的乳腺組織中TLR9、TLR2、TLR4、BNBD5mRNA的豐度，試驗結果表明，除TLR9外，其他基因在受感染組織中的mRNA豐度均顯著增加(4～13倍)，這也表明TLR4在抵御乳腺炎中起著重要作用。Pandey等[30]、Werner-Misof等[31]研究了不同劑量大腸桿菌脂多糖在乳腺內部灌注時乳腺細胞的免疫反應和乳腺緊密連接的狀態，結果顯示，隨著LPS劑量的升高，乳腺蛋白質斑塊密度降低、TLR4mRNA表達顯著增加，這些特點在Schmitz等[32]、Prgomet等[33]的研究中均有體現。

細菌的黏附力及侵襲力是衡量細菌致病力的重要指標。本試驗結果顯示，阻斷劑可以降低細胞中TLR4的表達及E.coli的黏附力。Gonen等[34]利用小鼠乳腺炎作為模型來研究乳腺的先天炎癥反應，發現將LPS輸注在野生型小鼠中可誘發乳腺炎，但在表達突變TLR4的小鼠中不誘導乳腺炎；將TLR4表達的巨噬細胞移入小鼠肺泡乳腔，小鼠恢復野生型表型。此外，在缺乏功能性TLR4的情況下，細菌高效入侵并感染上皮細胞后形成胞內微菌落；并且TLR4表達的巨噬細胞過繼轉移大大減少了細菌對上皮細胞的侵襲。Wang等[35]在小鼠慢性淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)感染模型中，發現TLR4通過亞致死劑量的LPS和PD-1阻斷劑觸發后，可以顯著改善循環中病毒特異性CD8 T細胞的反應，結果反映了TLR4阻斷劑可通過對LPS的作用顯著改善病毒細胞的反應，這可能對開發針對慢性病毒感染的新型檢查點療法具有重要意義。本試驗可能是由于CLI-095抑制了大腸桿菌LPS與細胞表面TLR4的特異性結合，從而降低了細菌的黏附力，減弱了細菌的致病力，試驗結果可為大腸桿菌性乳腺炎的防治提供理論基礎。