5種禾草種子萌發及幼苗生長對干旱脅迫的響應和抗旱性評價

張杰雪，王占青，全小龍，梁軍，史惠蘭，陳夢詞，喬有明

(1.青海大學省部共建三江源生態和高原農牧業國家重點實驗室，青海 西寧 810016；2.青海大學農牧學院，青海 西寧 810016；3.青海大學生態環境工程學院，青海 西寧 810016)

三江源區的高寒草甸重度退化后用草甸原有的嵩草屬(Kobresia)植物進行草地恢復或重建幾乎是不可能的，只有采取人工播種或補播等措施才能實現快速恢復或植被重建的目的。而退化高寒草地恢復或重建一般采用披堿草屬(Elymus)、早熟禾屬(Poa)和羊茅屬(Festuca)等多年生禾草的混播方式進行，播種深度在2 cm以內，播種后主要靠降水和土壤水分完成種子萌發和幼苗生長。由于播深淺，一旦遇到土壤長時間干旱，種子萌發和幼苗生長就會受到脅迫，出現種子不能發芽或幼苗不能存活的問題，特別是早熟禾等小粒種子植物更易受到影響。萌發被認為是植物生命周期中最關鍵的階段，是一個非常復雜的過程，在此過程中，種子需要迅速從休眠狀態轉換為加速代謝狀態，以使胚根和胚芽形成[1-2]，這個過程對干旱脅迫非常敏感[3]。有關禾草的研究發現，隨著滲透勢的降低，草地早熟禾(Poapratensis)、冷地早熟禾(P.crymophila)等種子的萌發受到抑制[4]，多年生黑麥草(Loliumperenne)、高羊茅(Festucaarundinacea)和草地早熟禾種子的發芽勢和發芽率隨滲透勢的降低先升高后下降[5],但也有研究發現蒙古冰草(Agropyronmongolicum)種子的發芽率、發芽勢、活力指數等隨PEG溶液滲透勢的降低而降低[6]，干旱脅迫對老芒麥(Elymussibiricus)、披堿草(E.dahuricus)等多年生禾本科牧草萌發有顯著影響，隨著脅迫強度的增加，發芽率、發芽勢和胚根長等指標均呈降低趨勢[7]。

聚乙二醇( Po1yethy1ene g1yco1，PEG-6000 ) 是高分子物質，能通過調節溶液的滲透壓來限制水分進入種子內部，而不影響種子內營養物質的積累[8]，常被作為干旱脅迫的滲透脅迫劑。通常采用不同滲透勢的PEG-6000溶液誘導干旱脅迫，測定種子發芽率、發芽勢、發芽指數，以及幼苗苗高、根長和干重等多個指標評價植物抗旱性[9-10]。本試驗研究了不同滲透勢的PEG溶液對同德老芒麥(Elymussibiricuscv.Tongde)、 同德短芒披堿草(Elymusbreviaristatuscv.Tongde)、青海冷地早熟禾(Poacrymophilacv.Qinghai)、青海草地早熟禾(Poapratensiscv.Qinghai)、青海中華羊茅(Festucasinensiscv.Qinghai)5種禾草品種種子萌發以及幼苗生長的影響，以期驗證高滲透勢是否促進幾種多年生栽培牧草種子的萌發，為退化高寒草甸恢復和人工草地的建植及高寒地區牧草抗旱種質資源的選擇、應用提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試禾草品種種子分別為同德老芒麥、同德短芒披堿草、青海冷地早熟禾、青海草地早熟禾、青海中華羊茅的種子。種子采集信息見表1。

表1 供試禾草種子

1.2 試驗方法

1.2.1 禾草種子發芽的測定 2020年7月15日從供試禾草種子中篩選出大小均勻、籽粒飽滿的成熟種子，用0.6%的次氯酸鈉(NaClO)溶液對種子和培養皿消毒15 min，蒸餾水反復沖洗。將消毒的種子均勻擺放在鋪有濾紙的培養皿，每個培養皿放置100粒。加2 mL不同滲透勢的PEG-6000溶液，稱取每個培養皿的原始重量，做好標記。PEG溶液滲透勢分別為0 (CK)，-0.05，-0.15，-0.30，-0.49 MPa，即5個處理，每個處理重復5次。發芽實驗在人工智能光照培養箱中進行，白天和夜晚溫度均為25 ℃，濕度為80%，光照強度為2 000 lx，光周期12 h。每天用稱重法補水并記錄正常發芽的種子數目，為了減少水勢變動，每隔5 d更換1次無菌濾紙，并及時清理污染發霉的種子。種子發芽以種子的胚芽突破種皮1～2 mm為標準。連續記錄21 d，最后計算發芽率，發芽勢和發芽指數。

發芽率(Germination rate，GR)=(發芽種子總數/供試種子總數)×100%

相對發芽率=(處理種子發芽率/對照種子發芽率)×100%

發芽勢(Germination potential，GP)是規定期限的最初1/3期間內的種子發芽數占供試種子數的百分比為標準[11]，本實驗以前7 d發芽為準。

相對發芽勢=(處理種子發芽勢/對照種子發芽勢)×100%

發芽指數(Germination index，GI)=∑(Gt/Dt)，式中，Gt為每天的種子發芽數，Dt為相應的發芽天數。

相對發芽指數=(處理種子發芽指數/對照種子發芽指數)×100%

相對苗高=(處理幼苗苗高/對照幼苗苗高)×100%

相對根長=(處理幼苗根長/對照幼苗根長)×100%

相對干重=(處理幼苗干重/對照幼苗干重)×100%

1.2.2 禾草幼苗生長的測定 幼苗生長試驗在人工智能培養箱中進行，白天和夜晚溫度均為25 ℃，濕度為80%，光照強度為2 000 lx，光周期12 h。用0.6%的次氯酸鈉溶液對種子和培養皿進行消毒15 min，再用蒸餾水反復沖洗。將消毒過的每個品種約200粒種子均勻擺放在鋪有濾紙的培養皿中，添加蒸餾水進行發芽，待胚芽長出后，將發芽的種子移植到基質為蛭石和珍珠巖(1∶1)的穴盤上。每個穴盤為25孔，每孔移植5株，每種禾草各種植5孔，5種禾草共移植125株，1個滲透勢處理(含對照)為1個穴盤，每個滲透勢處理(含對照)設3次重復，即每個滲透勢處理3個穴盤。用噴壺均勻噴灑不同滲透勢PEG(0 (CK)，-0.05，-0.15，-0.30，-0.49 MPa)8 mL，對照(CK)噴灑蒸餾水，并用水分測定儀測定不同滲透勢處理(含對照)下基質的水分含量，以后每隔2 d噴灑蒸餾水以補充基質水分(補充時用水分測定儀檢測補充的水分是否達到不同處理基質的水分含量需求)，使基質水分含量保持一定。以發芽日起，生長15 d后，從每個重復內隨機取每種植物10株進行測定。將植株幼苗從穴盤中取出，用自來水沖洗根部附著的基質，表面水分晾干后，用游標卡尺測量苗高和根長，最終計算10株的平均值，然后將其裝入紙袋置入烘箱于65 ℃條件下將植株烘干至恒重后稱重，得到10株植株總干重。

1.2.3 抗旱性綜合評價方法 采用模糊數學中隸屬函數法對供試禾草種質抗旱性進行綜合評價。求出5種供試禾草的各指標在模擬干旱處理下的平均隸屬函數值，計算公式如下：

u(Xab)=(Xab-Xbmin)/(Xbmax-Xbmin)

式中：Xab為a禾草b指標在某一處理下的均值，Xbmax為當前處理下b指標測定最大值，Xbmin為當前處理下b指標最小值，當測定指標為負向指標時，應采用反隸屬函數：

u(Xab)=(Xbmax-Xab)/(Xbmax-Xbmin)

然后把b指標在全部處理下的隸屬值累加，求其平均值，該平均值即為a牧草b指標的耐旱隸屬函數值，其值越大代表供試種質抗旱性越強。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 滲透勢對5種禾草種子萌發的影響

2.1.1 滲透勢對禾草種子發芽率和發芽勢的影響 對照的發芽率顯示，5種禾草種子發芽率在70%～90%，其中草地早熟禾最低，只有71%。PEG溶液處理后發芽率總體變化趨勢是隨著PEG滲透勢的逐步降低而下降，但不同禾草的發芽率對不同滲透勢的響應有所不同(圖1)。-0.05和-0.15 MPa處理下同德老芒麥發芽率與CK的發芽率無顯著差異，青海冷地早熟禾的發芽率也未受到-0.05 MPa處理的顯著影響。但2個高滲透勢溶液處理已引起同德短芒披堿草、青海草地早熟禾及中華羊茅發芽率的顯著下降(P<0.05)。滲透勢低于-0.30 MPa后，同德老芒麥、同德短芒披堿草、青海冷地早熟禾、青海草地早熟禾及青海中華羊茅的發芽率分別比對照降低了21%、22%、58%、60%和64%，特別是兩種早熟禾和中華羊茅的發芽率下降嚴重。

圖1 滲透勢下禾草種子發芽率和發芽勢Fig.1 Effects ofosmotic potential on the germination rate and germination potential ofgrass seeds注：不同小寫字母表示同一品種不同處理間差異顯著性(P<0.05);LM:同德老芒麥，DP:同德短芒披堿草，LD:青海冷地早熟禾，CD:青海草地早熟禾，ZH:青海中華羊茅

同德老芒麥、同德短芒披堿草種子的發芽勢均大于80%，而青海冷地早熟禾、青海草地早熟禾及青海中華羊茅發芽勢均不到45%，特別是中華羊茅的發芽勢只有32%，表明3種小粒禾草種子的發芽具有不整齊性(圖1)。PEG溶液處理后5種禾草種子發芽勢的變化趨勢與發芽率基本一致，因PEG滲透勢和禾草的不同存在一定的差異，PEG滲透勢為-0.30 MPa時，同德老芒麥、同德短芒披堿草的發芽勢分別比對照降低了56%和39%，青海冷地早熟禾、青海草地早熟禾及青海中華羊茅發芽勢接近于0，表明這一滲透勢已嚴重影響這3種禾草的發芽整齊性。

2.1.2 滲透勢對禾草種子發芽指數的影響 2種披堿草屬禾草對照的種子發芽指數不到20%，2種早熟禾及青海中華羊茅對照的種子發芽指數在10%左右；不同滲透勢的PEG溶液對5種禾草種子發芽指數的影響與發芽率和發芽勢一致，隨著PEG滲透勢的逐步降低，發芽指數急劇降低(表2)。當PEG滲透勢降為-0.15 MPa時，青海冷地早熟禾發芽指數比對照低50%以上，PEG滲透勢降至-0.30 MPa時，同德老芒麥和同德短芒披堿草種子的發芽指數低于對照50%，而青海草地早熟禾和青海中華羊茅的發芽指數降幅超過80%，表明低滲透勢PEG溶液處理可導致5種禾草種子的活力進一步降低。

2.2 滲透勢對5種禾草幼苗生長的影響

2.2.1 滲透勢對禾草幼苗苗高和根長的影響 不同滲透勢的PEG溶液對5種禾草幼苗苗高和根長均有不同程度的影響(圖2)。與對照相比，PEG溶液滲透勢降為-0.30 MPa時，同德老芒麥苗高出現明顯下降，而同德短芒披堿草在-0.15 MPa時就已出現顯著下降，PEG溶液滲透勢繼續降低后，對2種披堿草屬植物幼苗苗高的影響不再顯著。青海草地早熟禾和青海冷地早熟禾的幼苗苗高顯著降低分別出現在PEG溶液滲透勢低于0.05 MPa和-0.15 MPa時，而青海中華羊茅幼苗苗高在PEG滲透勢低于-0.49 MPa時顯著降低。

不同滲透勢的PEG溶液對同德老芒麥幼苗根長無顯著影響，對短芒披堿草、青海冷地早熟禾、青海草地早熟禾和青海中華羊茅幼苗根長的影響程度有所不同(圖2)。PEG溶液滲透勢降為-0.15 MPa時，同德短芒披堿草幼苗根長相比對照顯著縮短(P<0.05)。-0.05 MPaPEG溶液對青海冷地早熟禾和青海草地早熟禾幼苗根長無顯著影響，但-0.15 MPa和-0.30 MPa PEG溶液能顯著增加兩者的幼苗根長(P<0.05)，當PEG滲透勢降為-0.49 MPa時，兩者的幼苗根長受到抑制，相比對照顯著縮短(P<0.05)。與對照相比，-0.49 MPa的PEG滲透勢并不能引起中華羊茅幼苗根長的顯著降低，一定范圍的PEG溶液滲透勢(-0.05～-0.30 MPa)對中華羊茅幼苗的根生長有促進作用。

表2 滲透勢下禾草種子發芽指數

2.2.1 滲透勢對禾草幼苗干重的影響 同德老芒麥和同德短芒披堿草幼苗干重在PEG滲透勢為-0.05 MPa就出現降低(P<0.05)。PEG滲透勢分別降為-0.15和-0.30 MPa時對青海冷地早熟禾和青海草地早熟禾幼苗干重開始產生影響，而對青海中華羊茅幼苗干重的影響在滲透勢為-0.30 MPa時才表現出來(P<0.05)。PEG溶液滲透勢降到-0.49 MPa時，同德老芒麥、同德短芒披堿草、青海冷地早熟禾、青海草地早熟禾和青海中華羊茅幼苗干重分別比對照降低33%、25%、33%、40%和24%(表3)。

圖2 滲透勢下禾草幼苗苗高和根長Fig.2 Effect of osmotic potential on shoot and root length of grass seedlings

表3 滲透勢對禾草幼苗干重的影響

2.3 5種禾草抗旱性綜合評價

利用隸屬函數對5種禾草PEG處理下的相對發芽率、相對發芽勢、相對發芽指數以及幼苗相對苗高、相對根長和相對干重進行綜合評價，得到5種禾草的抗旱性(表4)，其中青海冷地早熟禾、青海草地早熟禾和青海中華羊茅相對根長數據采用隸屬函數計算，5種禾草的相對發芽率、相對發芽勢、相對發芽指數以及幼苗相對苗高和相對干重均采用反隸屬函數計算。根據隸屬函數的平均值進行排序，得出5種禾草的抗旱性強弱依次為：同德老芒麥>青海草地早熟禾>同德短芒披堿草>青海冷地早熟禾>青海中華羊茅。

表4 5種禾草抗旱指標隸屬函數值及抗旱性綜合評價

3 討論

植物種子的萌發期和幼苗生長期為生命周期最敏感時期[12]，極易受到外界環境因子的影響，且不同植物的種子在干旱條件下表現出不同的發芽能力[13-14]。多數研究表明，種子的發芽率、發芽勢、發芽指數等隨著滲透勢的降低而降低，即很多植物種子的萌發都會受到抑制[15-16]，這是由于活性氧的產生加速[17-18]，導致細胞損傷、細胞周期異常[19]，致使種子不能正常發芽。有人對老芒麥和不同品種草地早熟禾的研究發現隨著PEG溶液滲透勢降低，干旱脅迫加劇，種子的發芽率和發芽勢均呈現下降趨勢[20-22]；任畇霏等[23]對羊茅屬，段金秀等[24]對草地早熟禾的研究也表明，高滲透勢能提高禾草種子發芽率、發芽勢和發芽指數，低滲透勢溶液抑制種子的萌發，這可能是植物在輕度水分虧缺時，補償與超補償生長效應的表現[25-26]，也可能是在低滲透勢脅迫下細胞內膜系統的某些酶得到了激發，從而提高了種子的萌發能力[27]。本研究未發現高滲透勢提高5種禾草種子發芽率、發芽勢和發芽指數的情況，且5種禾草種子萌發對滲透調節的響應不完全一致，高滲透勢(-0.05 MPa)PEG溶液對同德老芒麥和青海冷地早熟禾發芽率沒有顯著影響，但已能引起同德短芒披堿草、青海草地早熟禾和中華羊茅發芽率的下降，預示田間輕度干旱可能影響這3種禾草的發芽；低滲透勢(<-0.30 MPa)PEG溶液能顯著降低5種禾草種子的發芽率，與前人的研究結果相一致。5種禾草種子對照的發芽指數均較低，表明供試禾草種子的活力較低；PEG溶液滲透勢降到-0.30 MPa時5種禾草的發芽指數顯著降低，表明低滲透勢PEG溶液處理可導致其種子的活力進一步降低甚至失活。較低的種子活力加上低滲透勢共同作用是導致發芽率和發芽勢顯著下降的主要原因。幼苗苗高對滲透調節的響應類似于種子發芽的情況，總的趨勢是隨滲透勢降低而降低，是由于滲透勢的降低使植物吸收水分的能力降低，莖葉生長受到抑制[29]。不同禾草根長對模擬干旱脅迫的響應表現出差異，一定范圍的PEG溶液滲透勢能促進青海冷地早熟禾和青海中華羊茅幼苗根的生長，但當滲透勢達到-0.49 MPa時，5種禾草幼苗根的生長均受到抑制，這與梁國玲等[23]對羊茅屬、孫清洋[20]和曾怡[30]對老芒麥和披堿草的研究結果相一致。在干旱脅迫下，植物吸收水分和營養物質優先供給地下器官(胚根)，從而利于幼苗的成活和生長，是植物水分缺乏時適應環境的一種表現[31-32]。當滲透勢達到-0.49 MPa時，已經超過植株忍耐的強度范圍，植株的生長受到強烈抑制，甚至死亡。

植物抗旱性受多種因素的影響，不同植物對同一指標的抗旱性反應也不一定相同[34]。植物萌發過程涉及復雜的生理生化作用[35]，用單一的指標難以準確地反映牧草萌發期抗旱性的強弱，必須運用多個指標進行綜合評價[36-37]。季波等[7]對老芒麥、披堿草等10種多年生禾本科牧草萌發期的抗旱性研究中發現老芒麥的抗旱性強于披堿草，楊滿業等[40]對老芒麥、同德短芒披堿草等5種禾草萌發期抗旱性研究中也發現老芒麥的抗旱性強于同德短芒披堿草；魯存海[4]在對8種野生早熟禾抗旱性研究比較中發現，草地早熟禾萌發期的抗旱性強于冷地早熟禾，這均與本研究中禾草的抗旱性順序一致。本研究發現5種禾草在萌發期同德老芒麥的抗旱性最強，其次是青海草地早熟禾、同德短芒披堿草和青海冷地早熟禾，而青海中華羊茅的抗旱性最差，這是由于種子萌發期的抗旱性與種子本身的特性與生理狀況有著密切的關系，不同牧草種子對干旱的敏感性不同，可能與種子大小和每種禾草自身的活力有關[15]。

4 結論

不同滲透勢對5種禾草種子萌發和幼苗生長均有顯著影響，總體上，隨著PEG溶液滲透勢降低，5種禾草種子發芽率、發芽勢、發芽指數以及幼苗苗高和干重均降低；但各草種的不同指標響應不一致，未發現高滲透勢介質對發芽有促進作用，但一定范圍的滲透勢對青海冷地早熟禾和青海中華羊茅幼苗根的生長有促進作用，而對其他3種禾草幼苗的根則有抑制作用。利用隸屬函數對5種禾草進行綜合評價，其萌發期抗旱性強弱依次為：同德老芒麥>青海草地早熟禾>同德短芒披堿草>青海冷地早熟禾>青海中華羊茅。