舞春花原生質體分離條件的優化研究

沈雁翔 梁言 王鵬 陸燕青 彭勇政 陶懿偉 曾麗*

(1上海交通大學農業與生物學院，上海 200240；2上海莘辛園藝有限公司，上海 201114)

舞春花（Calibrachoa hybrida），又名小花矮牽牛，因其花期長、花量大、花冠顏色豐富、觀賞價值高，近年來在園林綠化中得到越來越廣泛應用，成為了目前重要的園林綠化草本花卉之一[1-2]。舞春花雖與矮牽牛為同科不同屬植物，且舞春花具有矮牽牛缺乏的鮮艷、亮麗的黃色花品種，但兩者親緣關系較遠，存在有性雜交障礙（前人對此進行了相關研究，結果表明，兩者絕大多數雜種胚胎在授粉后的幾天內就停止發育[3]），故難以通過常規雜交技術獲得鮮艷、亮麗的黃色花矮牽牛新品種。研究表明，植物原生質體融合是克服遠緣雜交親和性差的一種有效的育種手段[4]，故建立舞春花原生質體分離體系，既能為進一步原生質體培養與融合奠定基礎，又能為培育亮黃色矮牽牛及舞春花新品種提供一種新途徑[5]。

植物原生質體是指植物細胞壁以內的植物原生質部分。自1960 年首次利用纖維素酶從番茄根尖分離出原生質體以來，目前前人已在水稻、小麥和馬鈴薯等植物中開展了原生質體融合的相關研究，并實現了種質資源的創新[6-8]。而原生質體融合技術必須建立在高效高產的原生質體分離技術上，前人也已在擬南芥、水稻、玉米、煙草、馬鈴薯、甜櫻桃等植物中建立了原生質體分離體系[9-15]，但關于舞春花原生質體分離的研究較少，僅Meyer等[16]于2009年對12個舞春花品種進行了原生質體分離與培養，但分離效率低、可重復性差；同時，有關黃色花舞春花品種原生質體分離體系的研究目前尚未見報道。在此背景下，筆者擬以黃色花舞春花的幼嫩葉片為實驗材料，通過研究其幼嫩葉片的預處理方式和原生質體分離的酶液組合、酶組合滲透壓、酶解時間等原生質體分離的關鍵因素，來獲得適宜的舞春花原生質體分離條件，從而建立舞春花原生質體分離體系，進而為舞春花與矮牽牛原生質體融合提供實驗材料，以及為舞春花和矮牽牛種質資源創新奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗采用的舞春花品種為泛美種子公司的Calibrachoa hybrid“Lindura Yellow”，該品種的花為黃色，種子購于鄭州貝利得花卉有限公司，采用播種育苗方式獲得實驗材料。實驗試劑為甘露醇、2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES）、牛血清白蛋白（BSA）、二乙酸熒光素（FDA）、纖維素酶R-10、果膠酶Y-23、離析酶R-10、CPW溶液、CaCl2。

1.2 外植體的準備

取舞春花枝條頂芽下第2～5片生長健壯的幼嫩葉片，在黑暗、4 ℃條件下處理1 d，在洗衣粉水中浸泡20 min后，用流水沖洗90 min，再轉入超凈工作臺，用75%酒精浸泡20～30 s，然后用1%次氯酸鈉消毒90～120 s，最后用無菌水沖洗3次。

1.3 原生質體的分離和純化

將準備好的外植體（葉片）切成厚度為0.5 mm的細絲，原生質體的分離和純化參考王鵬的實驗方法[17]。

1.3.1 適宜的離析酶濃度篩選

參照王禮強等[18]的研究方法和Meyer等[16]分離舞春花原生質體的實驗條件，設置4個酶解液組合，其中，纖維素酶和果膠酶的含量均為0.2%，離析酶濃度分別為0（Ⅰ號）、0.4%（Ⅱ號）、0.8%（Ⅲ號）、1.2%（Ⅳ號），甘露醇濃度為0.25 mol/L，附加20 mmol/L 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸（MES）、0.1%牛血清白蛋白（BSA）、0.11%CaCl2，酶解時間為6 h，測定不同離析酶濃度下舞春花原生質體的產量和活力。

1.3.2 適宜的酶解時間篩選

采用1.3.1中的Ⅲ號酶液組合，設置2、3、4、5、6、7 h共6個酶解時間梯度進行酶解，測定不同酶解時間下舞春花原生質體的產量和活力。

1.3.3 適宜的甘露醇濃度篩選

采用1.3.1中的Ⅲ號酶液組合，設置0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mol/L共 5個甘露醇濃度梯度，酶解5 h，測定不同甘露醇濃度下舞春花原生質體的產量和活力。

1.3.4 預處理方式的選擇

采用1.3.1中的Ⅲ號酶液組合，甘露醇濃度0.25 mol/L，設置預先質壁分離處理（0.55 mol/L CPW溶液浸泡1 h）、低溫黑暗處理（4 ℃放置24 h）、不預處理對照共3個不同的預處理方式，測定不同預處理方式下舞春花原生質體的產量和活力。

1.4 原生質體產量統計和活力檢測

采用血球計數板統計舞春花原生質體產量，計算公式為原生質體產量=原生質體個數÷葉片質量，10次重復。

采用二乙酸熒光素（FDA）染色法檢測原生質體的活力，即取洗滌過的原生質體懸浮液0.5 mL，加入FDA溶液使其最終濃度為0.01%，混勻置于室溫條件下5 min后，用熒光顯微鏡觀察，有活力的原生質體產生黃綠色熒光，無活力的原生質體則不產生熒光[19]。原生質體的活力采用一個視野內產生熒光的原生質體個數占總數的百分比表示，隨機統計10個視野，取平均值。

2 結果與分析

2.1 離析酶濃度對舞春花原生質體產量和活力的影響

由圖1可知，不同離析酶濃度會顯著影響舞春花原生質體的產量和活力，適宜的離析酶濃度可促進舞春花原生質體的分離。隨著離析酶濃度的增加，舞春花原生質體的產量和活力均表現為先增加后降低的趨勢，以離析酶濃度為0.8%時，舞春花原生質體的產量和活力表現最好（原生質體形狀、大小基本一致，邊緣清晰，內含物多，碎片少，產量為4.4×106個/g，活力為76%），離析酶濃度低于0.8%或高于0.8%時，舞春花原生質體的產量和活力均下降。

圖1 不同離析酶濃度對舞春花原生質體產量和活力的影響

2.2 酶解時間對舞春花原生質體產量和活力的影響

由圖2可知，不同酶解時間會顯著影響舞春花原生質體的產量和活力。隨著酶解時間的延長，舞春花原生質體的產量表現為先增加后降低的趨勢，以酶解時間為5 h的原生質體產量最高，為5.1×106個/g；隨著酶解時間的延長，舞春花原生質體的活力表現為逐漸降低的趨勢。綜合分析，5 h為舞春花葉肉原生質體分離的適宜酶解時間。

圖2 不同酶解時間對舞春花原生質體產量和活力的影響

2.3 甘露醇濃度對舞春花原生質體產量和活力的影響

由圖3可知，采用甘露醇為滲透壓調節劑，隨著甘露醇濃度的升高，舞春花原生質體的產量表現為逐漸降低的趨勢，舞春花原生質體的活力則表現為先增加后降低的趨勢，以甘露醇濃度為0.3 mol/L時，舞春花原生質體活力最高，為83%。經綜合分析，甘露醇濃度為0.25 mol/L是舞春花葉肉原生質體分離的適宜濃度。

圖3 不同甘露醇濃度對舞春花原生質體產量和活力的影響

2.4 預處理方式對舞春花原生質體產量和活力的影響

由表1可知，不同預處理方式會顯著影響舞春花原生質體的產量，但對原生質體活力的影響不顯著。經綜合分析，低溫黑暗處理（4 ℃、黑暗放置24 h）為最適宜的預處理方法，舞春花原生質體產量為5.62×106個/g、活力為87.13%。

表1 不同預處理方式對舞春花原生質體產量和活力的影響

3 討 論

在進行葉片原生質體分離時，對材料進行預處理可提高分離效果，預處理方式一般有預質壁分離法和低溫黑暗處理法兩種。其中，預質壁分離法采用CPW溶液和甘露醇等高滲溶液浸泡葉片，使葉肉細胞處于質壁分離的初始狀態，這有利于提高細胞壁的酶解效率和促進原生質體的釋放；低溫黑暗處理法是將植物材料放置在低溫黑暗的環境中，通過提高原生質體的活力和細胞膜抵抗外界壓力的能力，從而達到提高原生質體的分離效率。在本實驗中，分別采用了預質壁分離法和低溫黑暗處理法兩種預處理方法進行舞春花幼嫩葉片處理，相較于不預處理對照，均提高了原生質體的分離效率，這與李玉株等[20]的研究結果一致。

在采用酶解法分離原生質體時，適宜的酶種類及濃度是關鍵。目前，植物原生質體分離常用的酶種類有纖維素酶、果膠酶及離析酶，其中，纖維素酶的主要作用是解離細胞壁中的纖維素；果膠酶可用以降解果膠質，促進細胞彼此分離；離析酶是一種多酶復合物，與果膠酶的作用相似，對原生質體分離的傷害較小。不同植物材料因其細胞壁中纖維素、果膠的結構和含量不同，分離原生質體選擇的酶種類和濃度不同。例如，蔡肖等[21]以3.0%纖維素酶、0.5%離析酶、0.1%果膠酶的組合酶解液，高效分離出了小葉青楊葉片原生質體；王姿童等[22]在水曲柳原生質體制備中發現，1.5%纖維素酶+0.8%離析酶+0.4%半纖維素酶為最佳組合。同時，酶濃度過低會影響細胞壁酶解效率，酶濃度過高則會對細胞造成傷害。此外，不同的植物材料、酶的質量、酶解過程的振蕩頻率等，均會影響原生質體的酶解過程。因此，本實驗設置了四種酶液組合，其中以2.0%纖維素酶+0.2%果膠酶+0.8%離析酶的酶液組合，對舞春花幼嫩葉片原生質體的分離效果最好。

酶解時間是原生質體分離的核心因素，對原生質體的最終分離效果有很大影響，且采用不同的植物材料、酶液種類及濃度，需要的酶解時間也不同。例如，油棕、杉木的酶解時間分別為3.5 h、2.0 h[23-24]；Yoo等[10]報道，分離擬南芥葉肉原生質體的酶解時間因材料生態型和基因型不同而出現差異，酶解時間一般為3～18 h。同時，酶解時間過短，酶解不充分，會導致原生質體釋放不完全、質量不佳、產量低；酶解時間過長，會產生毒害作用，從而損傷細胞膜，造成原生質體活力下降。因此，本實驗對舞春花幼嫩葉片的適宜酶解時間進行了研究，隨著酶解時間的增加，舞春花原生質體活力降低，原生質體產量先升高再降低，以酶解時間為5 h時，舞春花原生質體產量最高，故舞春花原生質體最適的酶解時間為5 h，該結果與Meyer等[16]的研究結果相比，酶解時間縮短了近10 h。

植物原生質體對外界的滲透壓變化敏感，適宜的滲透壓是保證原生質體質量的重要因素，外界滲透壓過高，會導致原生質體失水皺縮；外界滲透壓過低，會導致原生質體吸水脹破。一般在酶解過程中可通過添加甘露醇來調節酶解液滲透壓，使其與原生質體內部滲透壓基本一致，但是，不同植物的原生質體的滲透壓差異較大，需針對不同的植物材料分別進行摸索。因此，本實驗設置了5個甘露醇濃度梯度，最終得出舞春花原生質體分離適宜的甘露醇濃度為0.25 mol/L，與已報道的原生質體適宜的酶解液甘露醇濃度為0.23～0.90 mol/L的研究結果相符[25]，但與Meyer等[19]的研究結果不同。

4 結 論

本實驗初步探明了舞春花葉肉原生質體的分離條件，即葉片于低溫（4 ℃）黑暗條件下預處理24 h，酶液組合為2%纖維素酶+0.2%果膠酶+0.8%離析酶+0.25 mol/L甘露醇+20 mmol/L MES+0.1%BSA+0.11%CaCl2，酶解 5 h，在此分離條件下，舞春花原生質體產量為5.62×106個/g、活力為87.13%。

本實驗結論對舞春花的基因研究、遺傳改良和新品種培育具有重要意義。