仿生取向纖維的剛度變化對巨噬細胞極化特性的影響

沈 勇，易兵成，沈炎冰，唐 寒，周 璟，薛蘇桐，張彥中

(東華大學 化學化工與生物工程學院，上海 201620)

各種血管疾病是導致全球死亡病例增多的重要原因之一[1]。采用組織工程化血管移植物(tissue engineered vascular grafts，TEVGs)被認為是實現(xiàn)患病血管組織功能恢復的最有前景的替代方法[2-3]。然而，直徑在6 mm以下的小口徑TEVGs植入身體后存在因生物相容性不佳引起的通暢率低的問題[4]。巨噬細胞作為與植入生物材料相遇最早的一類先天免疫細胞，其通過極化成促炎(M1)或抗炎(M2)表型來決定植入物誘導組織再生的功效[5-6]。

基于靜電紡的仿生纖維在構建TEVGs方面具有巨大潛力。采用靜電紡技術制備的納/微米超細纖維與天然組織細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)中纖維組分的纖維細度類似，其高比表面積可為細胞黏附提供較多的結(jié)合位點，超細度帶來的力學柔順性可有效促進細胞的重塑基質(zhì)作用[7-8]，因此非常適合用于軟組織工程。巨噬細胞在TEVGs植入后的早期炎癥反應中發(fā)揮著重要作用，為了解這類仿生纖維對巨噬細胞表型和功能的影響，Saino等[9]將巨噬細胞RAW 264.7培養(yǎng)在4種不同類型的靜電紡左旋聚乳酸(poly(L-lactic acid)，PLLA)纖維支架上，發(fā)現(xiàn)RAW 264.7細胞分泌促炎分子主要取決于纖維直徑，且以納米纖維PLLA支架的炎癥反應最小。Garg等[10]研究靜電紡支架的纖維直徑和孔徑大小對鼠骨髓源巨噬細胞向M2或M1極化的影響，結(jié)果顯示，與纖維直徑相比，支架的孔徑對巨噬細胞極性的調(diào)節(jié)更為關鍵。Jia等[7]將鼠骨髓源巨噬細胞接種在取向和無紡聚(L-丙交酯-co-己內(nèi)酯)(poly(lactide-co-caprolactone，PLCL)支架上，發(fā)現(xiàn)取向納米纖維顯著引導巨噬細胞沿著纖維方向伸長并向促再生表型發(fā)展，而無紡納米纖維引導促炎表型。這些研究雖然探索了靜電紡纖維支架的直徑、取向和孔尺寸等參數(shù)對巨噬細胞極化的影響，但在靜電紡纖維剛度變化(尤其是具有結(jié)構特異性的取向纖維)對巨噬細胞極化影響方面的研究還少有關注。

鑒于天然血管的各向異性結(jié)構特點，筆者課題組前期研究了靜電紡取向纖維的表面拓撲特征[11]、生化信號修飾[12]及剛度變化對血管細胞行為的影響[13-14]。作為對前期研究工作的一個拓展，本文仍采用調(diào)整剛性PLLA芯層和彈性PLCL殼層的組成比例作為改變PLCL/PLLA殼芯纖維剛度的策略，通過筆者課題組研發(fā)的穩(wěn)定射流同軸靜電紡技術(SJCES)制備了仿生取向纖維PLCL/PLLA，然后研究其剛度變化對RAW 264.7巨噬細胞響應行為(如形貌變化、增殖、遷移及極化等)的影響。

1 試驗部分

1.1 PLCL/PLLA殼芯取向纖維的制備

以六氟異丙醇為溶劑，配制質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的PLCL(丙交酯與己內(nèi)酯質(zhì)量比為50∶50，黏度為IV 2.9 dL/g，濟南岱罡生物材料)殼層溶液和PLLA(Mw=100 000，濟南岱罡生物材料)芯層溶液。為消除靜電紡中的射流不穩(wěn)定鞭動現(xiàn)象[15]，各紡絲溶液中分別添加質(zhì)量分數(shù)為5%的超高相對分子質(zhì)量聚氧化乙烯(Mw>5 000 000，Alfa Aesar公司，英國)。然后利用SJCES制備PLCL/PLLA殼芯結(jié)構纖維[14]，紡絲參數(shù)：電壓為5～9 kV；接收距離為20 cm；滾筒直徑為10 cm；收集速度為1 000 r/min；溫度為20～25 ℃，相對濕度為25%～30%。紡絲過程中通過同時調(diào)節(jié)PLCL殼層和PLLA芯層的注射速率(保持相同的總注射速率0.5 mL/h)，制備4種具有不同剛度的取向纖維基質(zhì)(AFSs)，即0.50、0(PLCL注射速率為0.5 mL/h，PLLA注射速率為0 mL/h，作為S1組，依此類推)，0.35、0.15(S2組)，0.20、0.30(S3組)，0.05、0.45(S4組)。將制備的纖維在真空中干燥2星期以完全去除溶劑。

1.2 取向纖維的表征

通過掃描電子顯微鏡(SEM，Hitachi TM-1000型，日本)在5 kV加速電壓下觀察AFSs的形貌，在SEM拍攝之前對AFSs噴金60 s。基于獲得的SEM圖像，通過ImageJ軟件分析纖維直徑和纖維取向度。

采用拉伸力學法測試取向纖維的彈性模量。采用與PLCL/PLLA同樣的紡絲方法紡絲2 h制備取向纖維并剪成長20 mm的短纖維束，然后在環(huán)境條件下，將短纖維束夾固在臺式拉力測試儀(HY-940FS型，上海)上進行拉伸測試(n≥8)，所用的力傳感器容量為50 N，拉伸速率為10 mm/min。根據(jù)拉伸應力-應變曲線計算彈性模量。

1.3 巨噬細胞對不同剛度取向纖維的響應檢測

1.3.1 細胞培養(yǎng)與材料處理

RAW 264.7巨噬細胞購自美國ATCC細胞庫，其完全培養(yǎng)基由體積分數(shù)為10%的胎牛血清、體積分數(shù)為1%的青霉素/鏈霉素和基礎高糖培養(yǎng)基組成。在接種細胞之前，對AFSs進行滅菌處理：紫外照射過夜，在體積分數(shù)為75%的乙醇中浸泡2 h；用磷酸緩沖鹽(phosphate buffer saline，PBS)溶液清洗3次，每次5 min；浸沒于細胞培養(yǎng)基中在37 ℃下孵育過夜。

1.3.2 細胞形貌

以1×105個/孔的細胞密度將RAW 264.7接種于AFSs上，每孔加500 μL培養(yǎng)基。培養(yǎng)1 d后棄去培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗一遍；加體積分數(shù)為2.5%的戊二醛固定細胞至少4 h，用PBS溶液清洗3次，每次3～5 min；然后用體積分數(shù)為10%、30%、50%、70%、90%及100%的乙醇分別進行15 min以上梯度脫水；脫水后將樣品放入干燥箱中干燥；最后用SEM在8～10 kV的加速電壓下觀察細胞形貌。

以1×105個/孔的細胞密度將RAW 264.7接種于AFSs上。培養(yǎng)1 d后用PBS溶液清洗并用質(zhì)量濃度為0.04 g/mL的多聚甲醛固定細胞30 min，然后用體積分數(shù)為0.1%的Triton X-100(Aldrich公司，美國)通透細胞10 min。每孔用200 μL的Phalloidin(Invitrogen公司，美國)染色20 min，用DAPI(Invitrogen公司，美國)染細胞核10 min。最后，PBS溶液清洗后用倒置熒光顯微鏡(Eclipse Ti-S型，Nikon公司，日本)觀察細胞形貌。用ImageJ軟件對染色圖片進行細胞核取向度分析，如圖1所示。

圖1 細胞核取向度分析示意圖Fig.1 Schematic diagram of cell nucleus orientation analysis

1.3.3 細胞增殖檢測

將RAW 264.7以1×105個/孔的細胞密度接種在AFSs上后分別培養(yǎng)1和3 d，然后使用CCK-8(Beyotime公司，中國)檢測細胞增殖情況。檢測具體步驟：在指定的培養(yǎng)時間點，將原先的培養(yǎng)基替換為含有15 μL CCK-8溶液的300 μL新培養(yǎng)基，于37 ℃下孵育4 h，孵育結(jié)束后每孔取100 μL加到96孔板中，用酶標儀(MK3型，Thermo公司，美國)在450 nm波長處檢測吸光度。

1.3.4 細胞遷移檢測

參照文獻[14]中的細胞遷移方法，將中間有1 mm厚隔離橫杠的鋼環(huán)放置在24孔板中的AFSs上，然后將RAW 264.7以5×105個/孔的細胞密度接種在AFSs上預制“人工傷口”。培養(yǎng)24 h后，去除鋼環(huán)使細胞在“傷口”區(qū)域自由遷移24 h。最后將細胞固定并用Phalloidin染色后在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞遷移情況。根據(jù)拍攝的熒光圖片，用ImageJ軟件分析細胞集體遷移情況。按照式(1)計算細胞集體遷移速率。

(1)

式中：V為細胞集體遷移速率；H0為“人工傷口”的初始寬度；Sa為“人工傷口”的未愈合面積；L為拍攝圖片寬度。

1.3.5 基因表達分析

將RAW 264.7以1×106個/孔的細胞密度接種在6孔板里的AFSs上，培養(yǎng)1和3 d，然后進行qRT-PCR檢測。檢測過程：采用總RNA提取試劑盒(天根公司，中國)從細胞中提取RNA；再用FastKing RT Kit試劑盒(天根公司，中國)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；最后使用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒(天根公司，中國)根據(jù)其使用說明配制反應體系，并用ABI 7500型實時熒光定量PCR儀檢測基因表達情況。引物序列如表1所示，對所有檢測基因均基于Gapdh進行歸一化處理。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.6 蛋白表達分析

ELISA檢測：樣本孔加待測樣本10 μL，再加稀釋液40 μL(即樣本稀釋5倍)，空白孔不加樣本；除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100 μL，封孔后于37 ℃下溫育60 min；棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次；每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃下避光孵育15 min；每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)在450 nm波長處測定各孔的吸光度。

免疫熒光染色：將支架用PBS清洗3次后再用質(zhì)量濃度為0.04 g/mL的多聚甲醛固定30 min，用體積分數(shù)為0.1%的Triton X-100通透10 min后，用體積分數(shù)為10%的山羊血清封閉非特異性結(jié)合位點30 min；將小鼠單克隆抗小鼠CD206抗體(1∶100稀釋比，Proteintech公司，中國)和兔多克隆抗小鼠INOS抗體(1∶400稀釋比，Abcam公司，英國)在4 ℃條件下孵育過夜；在室溫下加入CD206山羊抗小鼠IgG二抗 (1∶100稀釋比，Abcam公司，英國)或INOS山羊抗兔IgG二抗(1∶100稀釋比，Abcam公司，英國)孵育90 min，然后對細胞核進行DAPI染色；最后用激光共聚焦掃描顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國)觀察表型蛋白的表達情況。

測量細胞熒光強度：基于ImageJ軟件，使用“任意繪圖/選擇工具”選擇要測量的細胞；從分析菜單中選擇“設置測量”，確保選擇了面積、累積光密度和平均灰度值(其余部分可忽略)；從分析菜單中選擇“測量”，可以看到一個彈出框，其中包含第一個細胞的值；選擇單元格旁無熒光的區(qū)域為背景；對視場中要測量的其他細胞重復此步驟；完成后，選擇結(jié)果窗口中的所有數(shù)據(jù)，然后復制到新Excel工作表(或類似程序)中；使用式(2)計算校正后的單細胞熒光強度。

(2)

式中：A為單細胞熒光強度；I為細胞總熒光強度；Sc為選定細胞面積；F為背景讀數(shù)的平均熒光強度；N為細胞數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”形式表示。統(tǒng)計圖的制作和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均采用Origin 8.0軟件。組間比較選擇方差分析(One way ANOVA)和Tukey檢驗進行顯著性差異分析。*p<0.05時為有顯著性差異；**p<0.01時為有極顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 AFSs的制備與表征

根據(jù)文獻[14]，通過SJCES法可成功制備高度取向的PLCL/PLLA復合纖維，如圖2(a)所示。在紡絲過程中通過調(diào)控殼、芯紡絲液注射速率獲得的S1～S4組復合纖維的平均直徑,分別為(1.56±0.13)、(1.45±0.13)、(1.47±0.12)及(1.38±0.14)μm，各組間的纖維細度無顯著差異。此外，從量化的纖維取向度來看，S1～S4組的纖維取向度分別為0°±2.52°、0°±1.82°、0°±1.45°及0°±1.71°，均具有極高的取向度(見圖2(b))。

圖2(c)為各組取向纖維典型的拉伸應力-應變曲線。在PLCL/PLLA復合纖維中，當逐漸增大剛性成分PLLA的比例使其質(zhì)量分數(shù)從0增加到90%時，不僅纖維的拉伸強度得到顯著提高，復合纖維的彈性模量也從(18.05 ± 1.52)MPa增加到(951.92 ± 41.83)MPa，如圖2(d)所示，提高至近53倍；但是剛性PLLA的引入降低了PLCL/PLLA取向纖維的斷裂伸長率，從純PLCL的280%(S1)降低到PLLA質(zhì)量分數(shù)為90%時(S4)的60%，如圖2(c)所示。這些結(jié)果說明通過制備殼芯結(jié)構纖維實現(xiàn)對復合纖維剛度調(diào)控的可行性。由于采用殼芯纖維結(jié)構來調(diào)控纖維剛度，這將排除前人工作中因調(diào)控剛度參數(shù)帶來的支架表面的化學組成和拓撲結(jié)構的干擾[16]，從而為此類研究提供了一種理想的平臺。

圖2 通過SJCES制備的不同PLCL/PLLA纖維的表征Fig.2 Characterization of the different PLCL/PLLA fibers produced by SJCES

2.2 AFSs剛度對巨噬細胞表觀行為的影響

采用SEM和細胞骨架染色兩種方法首先探究了AFSs的剛度變化對RAW 264.7細胞形貌的影響，如圖3(a)和(b)所示。SEM結(jié)果顯示，最柔軟的S1組上的細胞接近紡錘形，立體凸起狀明顯，幾乎沒有鋪展，且紡錘兩端與纖維方向一致。隨著AFSs剛度的增加，細胞逐漸鋪展開來且扁平化。從熒光染色結(jié)果看，在S1組上能觀察到細胞骨架沿纖維方向取向的細胞形態(tài)，而S2～S4組的細胞具有更明顯的沿取向纖維方向延伸和鋪展的形貌，說明取向纖維對細胞的接觸誘導作用，這些結(jié)果與文獻[17]探索基質(zhì)剛度影響的研究一致。AFSs剛度對RAW 264.7細胞的遷移也有明顯影響，如圖3(c)所示，細胞沿纖維方向的遷移速率隨基質(zhì)剛度的增加而增加。

圖3 RAW 264.7細胞在不同剛度AFSs上的形貌和遷移Fig.3 Morphology and migration of RAW 264.7 cells on AFSs with varying stiffness

根據(jù)熒光染色圖片，對細胞黏附鋪展和取向進行定量測試的結(jié)果表明：S1組上的細胞鋪展面積最小，與其他3組有顯著性差異；S2～S4組上的細胞鋪展面積接近，組間無顯著性差異，如圖4(a)所示。

在取向度方面，不同剛度AFSs的細胞核取向相似，即細胞沿取向纖維方向延伸，不受纖維剛度的影響，如圖4(b)所示。細胞遷移定量測試結(jié)果顯示接種在最軟的S1組上的巨噬細胞具有最低的遷移速率(5.12±0.24)μm/h，而在S4基質(zhì)上的細胞遷移速率高達(10.42±0.54)μm/h，如圖4(c)所示。巨噬細胞的遷移功能在炎癥反應中必不可少[18]，與其及時到達發(fā)炎區(qū)域發(fā)揮防御功能密切相關，巨噬細胞遷移受損將導致多種疾病和自身免疫疾病。然而，目前尚無關于剛度對巨噬細胞遷移影響的共識。本研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞的遷移速率與基質(zhì)剛度呈正相關關系，這與文獻[19]的研究結(jié)果一致。RAW 264.7細胞增殖也受AFSs剛度影響，總體上在培養(yǎng)1和3 d后的巨噬細胞細胞數(shù)量與AFSs纖維的剛度也呈正相關，即剛度較大的纖維基質(zhì)更利于促進細胞的增殖，如圖4(d)所示。文獻[20-22]研究表明多種細胞類型(如平滑肌細胞、成纖維細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞等)在高剛度基質(zhì)上具有更強的生長增殖能力，本研究的RAW 264.7細胞在不同剛度取向纖維上的增殖結(jié)果支持這一結(jié)論。

圖4 RAW 264.7細胞在不同剛度AFSs上的鋪展面積、細胞核取向度、遷移速率和增殖Fig.4 Spreading area,nuclear orientation,migration rate and proliferation of RAW 264.7 cells on AFSs with varying stiffness

近年來，基質(zhì)剛度已被證明對細胞的黏附、收縮、遷移和分化等行為是至關重要的。Vatankhah等[23]制備了不同剛度的無紡纖維，研究發(fā)現(xiàn)低剛度的無紡纖維雖不利于細胞黏附，但卻更能維持平滑肌細胞的收縮表型，由此證實支架剛度是比生物信號更能影響平滑肌細胞功能的重要因素。Merkle等[24]采用調(diào)控不同組分的比例來制備不同剛度無紡纖維的方法，研究了纖維剛度對內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞行為的影響，結(jié)果證實纖維剛度的提高能促進細胞的黏附，也能促進內(nèi)皮細胞的遷移。這些研究表明特定細胞類型的細胞行為對基質(zhì)剛度的高度依賴性，不僅如此，組織病變?nèi)绨┌Y和動脈粥樣硬化也與基質(zhì)剛度的變化密切相關[25]。因此，研究巨噬細胞對纖維基質(zhì)剛度變化的響應行為將是對這一領域的重要補充和豐富，并體現(xiàn)出一定的在細胞表觀響應行為趨勢上的一致性。

2.3 AFSs剛度對巨噬細胞的極化特性的影響

使用qRT-PCR技術在基因水平檢測巨噬細胞M1相關基因(Tnf-α,Il-1β,Il-6,Mcp-1)和M2相關基因(Tgf-β,Il-10,Cd206)的表達情況，如圖5所示。由圖5(a)和(b)可知：培養(yǎng)1 d后M1表型相關基因中Il-1β和Il-6的表達無顯著性差異；Tnf-α在S1組表達較少且僅與S4組有顯著性差異；Mcp-1的表達總體上隨著基質(zhì)剛度的增加而增加。M2表型相關基因中Il-10在不同組的表達接近，組間無顯著性差異；Tgf-β在S2組表達最多，且僅在S2組和S1組之間有差異；Cd206在S1組表達最多，與其他組間均有顯著性差異。這些結(jié)果說明取向纖維的剛度性質(zhì)在短時間內(nèi)(1 d)對巨噬細胞極性的影響還比較有限。由圖5(c)和(d)可知：培養(yǎng)3 d后M1表型相關基因中，Il-1β的表達仍無顯著性差異；Tnf-α在S2組表達最少，卻在S1和S3組表達較多；Il-6和Mcp-1的表達與基質(zhì)剛度呈正相關。M2表型相關基因中，Tgf-β在S2組表達最多，在S1組表達最少；Il-10和Cd206的表達與基質(zhì)剛度呈負相關。這些基因水平結(jié)果表明，培養(yǎng)3 d后剛度較低的纖維基質(zhì)(S1、S2組)傾向于誘導巨噬細胞向M2表型發(fā)展。

圖5 RAW 264.7細胞在不同剛度AFSs上培養(yǎng)1和3 d后M1相關基因和M2相關基因的表達情況(n≥3)Fig.5 The expression of M1-related genes and M2-related genes of RAW 264.7 cells cultured on AFSs with varying stiffness for 1 day and 3 days (n≥3)

進一步采用ELISA和免疫熒光染色在蛋白水平評估AFSs剛度對巨噬細胞極化特性的影響。圖6為細胞培養(yǎng)1和3 d后ELISA檢測M1相關細胞因子(TNF-α,IL-1β)和M2相關細胞因子(IL-10,TGF-β)的表達情況。由圖6(a)可知，培養(yǎng)1 d，取向纖維的剛度變化對M1相關細胞因子(TNF-α,IL-1β)和M2相關細胞因子TGF-β的表達影響不明顯，只有IL-10在S1和S4組的表達有顯著性差異，IL-10在S1組的表達最多。由圖6(b)可知：培養(yǎng)3 d，M1相關細胞因子IL-1β的表達仍然無顯著性差異，而TNF-α的表達大體上與纖維剛度呈正相關；M2相關細胞因子IL-10的表達大體上與纖維剛度負相關，TGF-β在S2～S4組的表達較多，在S1組的表達最少。

圖6 RAW 264.7細胞在不同剛度AFSs上的蛋白表達(n ≥ 3)Fig.6 Protein expression of the RAW 264.7 cells cultured on AFSs with varying stiffness (n≥3)

選擇INOS和CD206分別作為M1和M2表型標志物進行免疫熒光染色，結(jié)果如圖7所示。可以比較直觀地看到：INOS的熒光強度在S2組較高，即INOS在S2組表達較多；CD206的熒光強度在S1組較高，即CD206在S1組表達較多。

圖7 不同剛度AFSs上RAW 264.7細胞INOS和CD206的免疫熒光染色Fig.7 Immunofluorescence staining of INOS and CD206 in RAW 264.7 cells cultured on AFSs with varying stiffness

熒光定量分析結(jié)果表明：INOS的表達在S2組中最多，而在S4組中最少，如圖8(a)所示；CD206的表達隨基質(zhì)剛度的增加而降低，即在S1組中表達最多，在S4組中表達最少，如圖8(b)所示。

圖8 不同剛度AFSs上RAW 264.7細胞INOS和CD206的定量表達(n≥3)Fig.8 Quantitative expression of INOS and CD206 in RAW 264.7 cells cultured on AFSs with varying stiffness (n ≥ 3)

根據(jù)第1 d的ELISA結(jié)果，不同剛度組AFSs之間的細胞因子分泌基本沒有差異，只有抗炎因子IL-10在S1組中表達最多，并與S4組有差異，如圖6(a)所示。但在第3 d可以明顯看到除促炎因子IL-1β外其他3種細胞因子分泌量的差異，這暗示了力學信號(如剛度)作用的時間依賴性。無論在第1 d還是第3 d，不同AFSs上IL-1β的分泌都沒有差異，因此推測IL-1β的分泌不受取向纖維的剛度調(diào)節(jié)，或者可以影響其表達的剛度不在本研究中用到的AFSs的剛度范圍。培養(yǎng)1 d后M1促炎標志物TNF-α和IL-1β在不同組無顯著性差異，而INOS在S2、S3組分泌較多，S1和S4組分泌較少，在本研究剛度范圍內(nèi)不呈線性表達，可能是S2和S3剛度范圍較有利于INOS的表達。根據(jù)文獻[17]研究的剛度范圍為130～840 kPa的水凝膠基質(zhì)對小鼠骨髓來源巨噬細胞表型極化的影響，可知在沒有可溶性共刺激物的情況下剛度變化不會帶來顯著影響。Irwin等[26]發(fā)現(xiàn)TNF-α在不同剛度基質(zhì)上的分泌無明顯差異，與TNF-α相比，IL-8的分泌呈雙相性，在1.4和348.0 kPa基質(zhì)上分泌較低，而在10.0 kPa基質(zhì)上分泌較高。基質(zhì)剛度對巨噬細胞黏附和激活的影響仍有爭議，目前未有一致的結(jié)論。

總體來看，研究結(jié)果表明AFSs基質(zhì)剛度對巨噬細胞具有深遠的影響。在細胞培養(yǎng)3 d后，軟基質(zhì)(如S1組)使巨噬細胞偏向M2表型，硬基質(zhì)(如S4組)使巨噬細胞偏向M1表型。對組織微環(huán)境力學線索(如剛度)的深度理解將有助于設計能夠改善組織重塑與再生的仿生纖維生物材料，促進仿生組織工程化血管的再生。

3 結(jié) 語

本研究將RAW 264.7細胞接種到不同剛度的AFSs上培養(yǎng)，通過SEM、熒光染色、CCK-8、ELISA、qRT-PCR等試驗研究發(fā)現(xiàn)，AFSs的剛度會影響巨噬細胞的響應行為。在細胞培養(yǎng)3 d后，與軟質(zhì)纖維基質(zhì)相比，硬質(zhì)纖維基質(zhì)更傾向于將巨噬細胞向促炎表型引導。巨噬細胞的表型功能對靜電紡仿生纖維的剛度具有高度的依賴性，研究結(jié)果可對未來設計有效的仿生纖維基TEVGs提供指導和借鑒。