通竅益腦方對東莨菪堿癡呆模型小鼠學習記憶行為的影響

阿力努爾·艾麥爾 聶雨楠 阿娜古麗·馬合木提 高莉

1.新疆醫科大學藥學院，新疆烏魯木齊 830011；2.新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所 新疆維吾爾醫方劑學重點實驗室，新疆烏魯木齊 830049

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是老年人中最常見的致死性神經退行性疾病[1-2]，通常表現為進行性記憶力下降，伴隨或隨后出現的其他認知功能障礙，如視覺空間異常、導航困難、執行問題和語言障礙等[3]。隨著人口老齡化的加劇，其發病率呈增高趨勢，因此AD 也成為不能忽視的公共衛生問題，給家庭和社會造成巨大的經濟負擔[4]。目前臨床上治療AD的藥物主要有多奈哌齊、鹽酸美金剛片等，而這些藥物均是以改善癥狀為主，并不能延緩或終止疾病的進展[5]，故仍需探索預防及延緩其發病進程或改善癥狀的藥物。

本研究所用的通竅益腦方是由薰衣草、水龍骨、余甘子、牛舌草等幾味藥材配伍而成。研究證實這些藥材具有抗氧化[6-12]、預防心腦血管疾病、降血脂[9-10]、保肝[10]、抗細胞凋亡[11,13]等功效。本研究建立東莨菪堿模型，觀察通竅益腦方對東莨菪堿模型小鼠學習記憶行為及對腦內乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）、乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）和乙酰膽堿轉移酶（choline acetyltransferase，ChAT）含量的影響，探討其對獲得性短暫記憶障礙小鼠學習記憶行為的改善作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF 級雄性昆明小鼠50 只，體重（20±2）g，由新疆醫科大學動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK（新）2018-0002。小鼠分籠飼養，12 h/12 h 白天和黑夜循環照明，自由飲水和進食。飼養溫度為21～25℃，濕度為40%～60%。本研究經新疆維吾爾醫藥研究所動物倫理委員會批準。

1.2 藥品與試劑

通竅益腦方（新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所自制）；氫溴酸東莨菪堿（Sigma 公司，批號：P1736201）；ACh 測試盒（南京建成生物工程研究所，批號：20201 223）；AChE 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20201224）；ChAT 酶聯免疫吸附試驗試劑盒（江萊生物，批號：JL20662）。

1.3 儀器

SQP 型電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司，稱量范圍：0.01～120 g）；YLS-3TB 型跳臺記錄儀（濟南益延科技發展有限公司）；1510 型全波長酶標儀（Thermo Fester Scientific）；TL2010S 高通量組織研磨儀（SOP-EQ036）；SPX-150B-Z 恒溫生化培養箱。

1.4 動物分組、給藥與模型制備

采用隨機數字表法將50 只小鼠分為空白對照組、東莨菪堿模型組、多奈哌齊組、通竅益腦方0.41 g/kg組、通竅益腦方0.82 g/kg 組，每組10 只。各組按劑量連續灌胃給藥29 d，空白對照組與東莨菪堿模型組給予相同劑量的溶媒。除空白對照組外，其他各組行為學實驗前30 min 腹腔注射2 mg/kg 東莨菪堿造模，空白對照組腹腔注射生理鹽水[14-15]。

1.5 跳臺試驗

給藥第27～28 天進行跳臺試驗。跳臺實驗分為兩個階段：訓練期和測試期。訓練期將小鼠放入箱內適應3 min，然后立即通以36 V、2 mA 交流電，小鼠在受到電擊后回到平臺，多數動物可能會多次下臺受到電擊再回到平臺，這是小鼠學習找臺逃避電擊的過程。如此訓練5 min 記錄實驗小鼠第一次跳下絕緣平臺的時間，為下臺潛伏期；小鼠跳下絕緣平臺遭受電擊的次數，即下臺錯誤次數作為學習成績。24 h 后重復測試，記錄下臺潛伏期和下臺錯誤次數作為記憶成績[16-17]。

1.6 ACh、ChAT 含量及AChE 活力測定

給藥第29 天斷頭取腦，用生理鹽水沖洗大腦皮層表面血液然后在冰袋上分離海馬組織。根據試劑盒說明書對海馬組織進行預處理并檢測小鼠海馬中的ACh、ChAT 含量及AChE 活力。

1.7 統計學方法

采用SPSS 26.0 軟件進行統計學分析，計量資料用均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差比較分析或t 檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組跳臺試驗結果比較

與空白對照組比較，在跳臺試驗的訓練期和測試期，東莨菪堿模型組下臺潛伏期縮短，下臺錯誤次數增加，差異有統計學意義（P <0.05）；與東莨菪堿模型組比較，在跳臺試驗的訓練期和測試期，通竅益腦方0.41 g/kg 組、通竅益腦方0.82 g/kg 組下臺潛伏期延長，下臺錯誤次數減少，差異有統計學意義（P <0.05）；在跳臺試驗的訓練期和測試期，通竅益腦方0.41 g/kg 組與通竅益腦方0.82 g/kg 組下臺潛伏期、下臺錯誤次數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組跳臺試驗結果比較（n=10）

2.2 各組ACh、ChAT 含量及AChE 活力比較

與空白對照組比較，東莨菪堿模型組ACh、ChAT含量下降，AChE 活力升高，差異有統計學意義（P <0.05）；與東莨菪堿模型組比較，通竅益腦方0.41 g/kg組、通竅益腦方0.82 g/kg 組ACh、ChAT 含量升高，AChE 活力下降，差異有統計學意義（P <0.05）；通竅益腦方0.41 g/kg 組與通竅益腦方0.82 g/kg 組ACh、ChAT 含量，AChE 活力比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組ACh、ChAT 含量及AChE 活力比較（n=10）

3 討論

研究表明，膽堿能突觸在人類中樞神經系統中無處不在[18]。他們在丘腦、紋狀體、邊緣系統和新皮質中的高密度表達表明膽堿能的傳遞可能對記憶、學習、注意力和其他高級大腦功能至關重要[19-20]，而中樞膽堿能系統功能損傷是導致AD 的重要發病機制[21]。ACh 是腦內重要的神經遞質，突觸前膜ACh 的合成、ChAT 酶活性、AChE 活性都與AD 患者學習記憶能力的損傷有關[22]。

AD 患者腦內ACh 含量普遍偏低，這可能是形成AD 的主要原因之一[23]。東莨菪堿是M 受體阻斷藥，特異性抑制大腦1 級記憶轉變成2 級記憶的過程，干擾近期記憶的形成，從而模擬AD 膽堿能系統受損，一直被廣泛用于AD 機制研究及藥物開發[24]。因此，本研究使用腹腔注射東莨菪堿造模，抑制中樞膽堿能系統，神經元缺失后神經遞質ACh 減少，造成學習記憶功能受損，此種造模方法對記憶影響的機制較為明確，重現性較好，因此廣泛應用[25-26]。

本研究結果顯示，與空白對照組比較，東莨菪堿模型組在跳臺實驗中下臺潛伏期縮短，下臺錯誤次數增加（P <0.05），提示造模成功，且造模過程中未出現小鼠死亡。本研究結果顯示，與東莨菪堿模型組比較，通竅益腦方0.41 g/kg 組、通竅益腦方0.82 g/kg 組ACh、ChAT 含量升高，AChE 活力下降（P <0.05），提示通竅益腦方作用于腦內中樞膽堿能系統，但無法確定量效關系，因此還需要做進一步研究確定量效關系、作用機制以及病理變化。