環介導恒溫擴增芯片法在機械通氣患者下呼吸道病原體檢測中的應用

劉佳佳 孫靜娜 閆海洋 韓振剛 陳靜 趙帥

河北醫科大學第一醫院檢驗中心，河北石家莊 050031

機械通氣患者病情危重，機體抵抗力明顯下降，尤其是有創機械通氣，極易發生院內肺部感染，如何在短時間內獲取病原微生物的信息廣受關注。傳統培養法需要3～5 d 獲得目標菌和藥敏結果，環介導恒溫擴增芯片法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）作為一種新型檢測技術，無需高溫變性、低溫退火過程，可在2 h 內完成常見下呼吸道病原菌及耐藥基因檢測[1-2]。恒溫擴增芯片采用環介導恒溫擴增技術與微流體芯片技術相結合設計而成的芯片，可同時檢測多種耐藥基因，針對性和特異度良好、靈敏度高、操作簡便[3-4]。恒溫擴增芯片法技術核心主要在于等溫擴增、微流控芯片和實時熒光檢測[5-6]。其中，等溫擴增技術可幫助有效簡化儀器操作，大幅度加快檢測速度[7-9]。微流控芯片技術則主要保障反應微腔體物理分隔良好，避免相互污染，且使用一次性、封閉反應微腔體，可以有效杜絕核酸擴增產物的污染以此保障恒溫擴增可以便捷高效地進行[10-12]。實時熒光檢測技術靈敏度極高，結合人工智能判讀軟件，可自動計算判定結果，縮短檢測周期[13-14]。本研究對恒溫擴增芯片法檢測經氣管插管機械通氣患者下呼吸道病原體及耐藥基因的情況進行評價。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2021 年1 月至6 月90 例新轉入河北醫科大學第一醫院呼吸內科及重癥監護室行經氣管插管機械通氣合并通氣后下呼吸道感染患者肺泡灌洗液標本。其中男62 例，女28 例；年齡16～95 歲，平均（63.42±7.21）歲。納入標準：合并咳嗽、咳痰及肺部濕啰音，經胸部CT 或胸部平片檢查證實存在下呼吸道感染，且經氣管插管吸痰，以白細胞數＞25×109個/低倍視野，且上皮細胞＜10 個/低倍視野為標本合格。排除標準：合并病毒性肺炎；合并肺部真菌感染；肺結核；標本不合格。標本合格標準：多形核白細胞＞25×109個/低倍鏡視野，鱗狀上皮細胞＜10 個/低倍鏡視野。

1.2 主要儀器和試劑

iChip-400 多通道核酸檢測系統（天津百康芯公司）；呼吸道病原菌核酸檢測（恒溫擴增芯片法）試劑盒（成都博奧晶芯生物科技有限公司，批號：202002031）；全自動細菌鑒定藥敏儀（迪爾96-Ⅱ）；Megafuge ST1R Plus 離心機（美國Thermo 公司，離心半徑為10 cm）。

1.3 檢測方法

所有患者均經氣管插管吸痰取肺泡灌洗液標本；所有樣本均分為兩份，一份加入等量4%NaOH，混勻后室溫液化，采用試劑盒行核酸提取，以恒溫擴增芯片法檢測耐藥基因，隨后按照核酸擴增反應體系，進行核酸靶序列擴增及檢測。于檢測頁面中錄入樣本信息，根據軟件設計對熒光數據進行處理分析，采用ROC法計算待測指標參考值。另一份行細菌培養，于采樣后2 h 內進行血平板和巧克力平板接種，35℃、5%二氧化碳恒溫箱孵育48 h 后，使用自動細菌鑒定藥敏儀進行鑒定及藥敏檢測。

1.4 觀察指標

根據芯片反應池分布情況，分析患者耐甲氧西林葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌屬、嗜肺軍團菌、肺炎鏈球菌、肺炎衣原體、肺炎支原體等病原體檢出情況；同時分析KPC、IMP、NDM、VIM、OXA-48/23、mecA、VanA、VanB 等耐藥基因檢出情況；比較環介導恒溫擴增芯片法與藥敏試驗匹配情況。

樣本檢測符合率情況分析：若樣本檢測耐藥基因陽性，且同時細菌培養結果提示該樣本對此耐藥基因相應藥物耐藥，則提示兩者檢測結果符合；若樣本檢測耐藥基因陽性，但細菌培養或藥敏試驗結果顯示該樣本對此耐藥基因相應藥物敏感，或細菌培養、藥敏試驗顯示樣本對耐藥基因相應藥物耐藥，但樣本檢測結果顯示耐藥基因陰性，則記為檢測結果不符合[15-17]。

2 結果

2.1 環介導恒溫擴增芯片法病原體檢測情況

共檢測標本90 例，環介導恒溫擴增芯片法檢測陽性標本69 例，標本陽性率為76.67%。未檢出卡他莫拉菌屬、嗜肺軍團菌、肺炎衣原體、肺炎支原體。見表1。細菌培養法檢測標本陽性31 例，標本陽性率為34.44%。嗜麥芽窄食單胞菌、卡他莫拉菌屬、嗜肺軍團菌、肺炎衣原體、肺炎支原體未檢出。見表2。

表1 不同方法病原體檢測情況[例（%）]

2.2 環介導恒溫擴增芯片法耐藥基因檢測情況

本藥敏試驗主要針對KPC、IMP、NDM、VIM、OXA-48/23、mecA、VanA、VanB 這8 種耐藥基因進行檢測，其中KPC、IMP、NDM、VIM、OXA-48/23 為耐碳青霉素類耐藥基因，OXA-23 曾被作為某些腸桿菌治療的首選藥物，OXA-48/23 均是導致細菌耐碳青霉素類耐藥的主要原因；mecA 為耐甲氧西林葡萄球菌標志性基因，耐甲氧西林葡萄球菌耐藥性極強，一般情況下認為檢出mecA 即為耐甲氧西林葡萄球菌陽性；VanA為耐萬古霉素及替考拉寧類耐藥基因，VanB 則為耐萬古霉素類耐藥基因，其中VanA 和VanB 為腸球菌中檢測的耐藥基因。環介導恒溫擴增芯片法耐藥基因陽性檢出率為86.67%（78/90），其中mecA、OXA-48、OXA-23 為檢測率最高的3 種耐藥基因。見表2。

表2 環介導恒溫擴增芯片法耐藥基因檢測情況

2.3 細菌培養法耐藥基因檢測情況

細菌培養法標本陽性31 例，耐藥試驗檢測耐藥頻率最高依次為碳青霉素類、青霉素類、萬古霉素類、替考拉寧類。見表3。

表3 細菌培養法耐藥基因檢測情況

2.4 環介導恒溫擴增芯片法與細菌培養符合情況分析

以每個樣本為單獨整體，分析環介導恒溫擴增芯片法耐藥基因檢出情況與細菌培養法藥敏試驗耐藥情況，環介導溫擴增芯片法在mecA、OXA-48、OXA-23 等耐藥基因的檢測上具有較高檢出率，且與耐藥檢測金標準符合率高，在耐甲氧西林葡萄球菌耐藥基因mecA 和耐碳青霉素耐藥基因OXA-48/23 檢測中，符合率可達100%。

3 討論

細菌培養和藥敏試驗一直以來都是檢測病原體耐藥性的金標準，但其在檢測靈敏度、檢測周期等方面往往難以滿足臨床工作的需求，且其可檢測的耐藥基因較為單一[18-20]。近年來，隨著分子檢測技術的不斷發展，耐藥基因檢測應用日益廣泛，能同時檢測多個病原體和耐藥基因，且特異度高的檢測技術，成為臨床需求的首選。

LAMP 對減少呼吸機相關性肺炎的發生，防止多重耐藥菌傳播，指導臨床合理用藥具有重要的指導意義[21]。為明確恒溫擴增芯片法技術在機械通氣下呼吸道感染患者病原體及耐藥基因檢測中的應用，在保障樣本不受上呼吸道菌群及口腔菌群的污染下[22]。本研究結果顯示，恒溫擴增芯片法病原體陽性標本69 例，陽性率為76.67%，下呼吸道分泌物樣本中細菌培養陽性率（34.44%）明顯低于恒溫擴增芯片法，其檢出病菌31 株，檢出率最高前6 位分別為鮑曼不動桿菌、肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌，與既往研究[23]中重癥監護室細菌種類及分布情況相近。恒溫擴增芯片法檢出的病原菌分布與細菌培養法有一定差異，國內其他通過細菌培養法研究下呼吸道感染的研究多以銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌等為主要致病菌，猜測恒溫擴增芯片法和細菌培養法的檢測差異可能與細菌培養法的實驗室檢測條件受限有關，提示恒溫擴增芯片法對于反映機械通氣合并下呼吸道感染真實性更高[24-25]。

本研究環介導恒溫擴增芯片法陽性檢出率為86.67%，其中mecA、OXA-48、OXA-23 檢測率最高，在本研究中未行腸球菌檢測，故VanA 和VanB 檢出率為0。王詠紅等[26]研究指出，以細菌培養法為金標準，采用芯片法測出的很多陽性患兒會被判定為假陽性，導致芯片法的特異性低，采用細菌培養法作為金標準評判芯片法的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值會存在誤差。基于此，本研究采用兩種不同方法進行耐藥基因檢測，結果顯示，恒溫擴增芯片法對常規耐藥基因的陽性檢出率明顯高于傳統藥敏檢測，且部分樣本存在兩個和/或兩個以上耐藥基因陽性情況。一方面提示恒溫擴增芯片法對于耐藥基因檢測敏感性高，特異性強，一方面也提示臨床抗菌用藥，需要考慮聯合感染并慎重給藥。以每個樣本為單獨整體，分析恒溫擴增芯片法耐藥基因檢出情況與細菌培養法藥敏試驗耐藥情況。結果顯示，溫擴增芯片法耐藥基因陽性檢出率為86.67%（78/90），且其在mecA、OXA-48、OXA-23 等耐藥基因的檢測上均具有較高檢出率，與此同時，細菌培養法藥敏試驗結果顯示，樣本耐藥頻率最高依次為碳青霉素類、青霉素類、萬古霉素類，上述3 類耐藥基因相應抗生素在臨床上也是最常用于抗感染治療的藥物，其相關藥物是否耐藥對于指導臨床抗生素的正確使用具有積極意義。其中碳青霉素類藥物出現頻率在40%以上，與耐藥基因檢出結果比較，耐藥檢測金標準符合率高，但對于耐藥基因數量及耐藥性的檢測還有待進一步實驗分析。

與傳統細菌培養法比較，恒溫擴增芯片法對于檢測機械通氣合并下呼吸道感染患者分泌液病原體具有高陽性檢出率，其耐藥基因檢測特異性好，對于指導臨床藥物干預具有積極作用。