產(chǎn)表面活性劑石油降解菌的篩選及其對石油烴的降解特性

孔萌，邢獻杰，姜巧，彭明國，王晉，張文藝

(1.常州大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇 常州 213164；2.中國石油化工股份有限公司金陵分公司，南京 210033)

隨著工業(yè)化的迅速發(fā)展，石油的需求量大大增加，在石油開采、運輸、儲存等過程中，產(chǎn)生了大量的含油污泥。煉油廠在處理含油廢水時產(chǎn)生的生化污泥、池底污泥和浮渣統(tǒng)稱為“三泥”。煉油廠“三泥”主要是指由石油烴類、膠質(zhì)、瀝青質(zhì)、泥沙、無機絮體、有機絮體以及水和其他有機物、無機物牢固黏結(jié)在一起的穩(wěn)定乳化體系[1]，對土壤、地表水和地下水構(gòu)成重大威脅，油氣揮發(fā)更會影響空氣質(zhì)量。基于“三泥”對于環(huán)境的惡劣影響，含油污泥的無害化處理迫在眉睫。

目前，煉油廠“三泥”的處理方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法[2]，其中，微生物修復(fù)技術(shù)由于成本低、效果好和無二次污染等特點受到廣泛關(guān)注[3]。但石油烴的疏水性阻隔了其與微生物的接觸，會在一定程度上減少微生物的修復(fù)效果[4]。為解決這一問題，往往會添加表面活性劑以起到增溶作用，由于其分子結(jié)構(gòu)同時存在極性親水基(如羥基、酰胺基、醚鍵等)和非極性疏水基(如烴鏈等)，因此，具有一定的表面活性，能有效降低水溶液的表面張力[5]，從而增大微生物與石油的接觸程度，提高微生物降解效率[6]。其中，化學(xué)表面活性劑易產(chǎn)生二次污染和生物毒性，無法成為理想的表面活性添加劑。在一定條件下，部分微生物能代謝出一種次級產(chǎn)物表面活性劑[7]，因此，對于具有產(chǎn)生表面活性劑性能的石油降解菌的篩選及研究成為石油污染修復(fù)中的熱點[8]。曹迪等[9]篩選出了具有高效降解石油烴能力和產(chǎn)生表面活性劑能力的菌株，在20 ℃下，第8天對石油烴的降解率可達64.98%。Zhou等[10]從油污土壤中分離出一株芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的脂肽類表面活性劑具有顯著的降低表面張力和乳化性能。周敏等[11]篩選出了產(chǎn)脂肽類陰離子表面活性劑石油降解菌，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生物表面活性劑不僅可提高乳化性能，還可以促進石油降解菌的生長，提高石油降解率。筆者篩選得到的希瓦氏菌運用于石油降解的案例較少，劉芳明[12]曾篩選到一株南極低溫降解菌NJ49，但與筆者研究不同的是，劉芳明并未證實其具有產(chǎn)生表面活性劑的特性。

筆者采用微生物法降解生化污泥和浮渣，從大慶油田含油污泥中篩選出4株菌，僅一株具有產(chǎn)表面活性劑的性能，命名為GJ，鑒定此產(chǎn)表面活性劑菌為希瓦氏菌屬(Shewanellasp.)，并對其產(chǎn)物進行提取鑒定，分別運用Logistic模型、Luedeking-Piret模型和一級動力學(xué)模型對菌體生長、產(chǎn)物合成和降解石油過程進行動力學(xué)分析，進一步推斷GJ降解石油烴的作用機制。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

菌株篩選自大慶油田的含油污泥。兩種含油污泥來自南京金陵石化，分別為浮渣和生化污泥，其中，浮渣的含水率為57.14%，含油率為16.28%，含渣率為26.58%；生化污泥含水率為35.03%，含油率為8.50%，含渣率為56.47%。

1.2 培養(yǎng)基配方

肉湯蛋白胨培養(yǎng)基(LB)[13]用于分離純化菌株；固體培養(yǎng)基是在LB基礎(chǔ)上加20 g/L瓊脂粉；無機鹽培養(yǎng)基[14]用來降解含油污泥，由NaCl 1 g、(NH4)2SO44 g、K2HPO44 g、KH2PO44 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、微量元素 1 mL(CaCl2·2H2O 1 g、FeSO4·7H2O 1 g、EDTA 1.4 g)加蒸餾水至1 L，pH值調(diào)至6.5，121 ℃滅菌20 min；血平板培養(yǎng)基由酪蛋白胰酶消化物10.0 g、心胰酶消化物3.0 g、玉米淀粉1.0 g、瓊脂14.0 g、肉胃酶消化物5.0 g、酵母浸出粉5.0 g、氯化鈉5.0 g、羊血70 mL加蒸餾水至1 L配制而成，所用血平板培養(yǎng)基購于江門市凱林貿(mào)易有限公司。

1.3 產(chǎn)表面活性劑菌的篩選和鑒定

1.3.1 產(chǎn)表面活性劑石油降解菌的篩選 血平板篩選：取1 μL菌液滴在血平板上，25 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落周圍是否有溶血圈[15]。

油擴散法測定排油活性：在直徑9 cm的培養(yǎng)皿中倒入30 mL蒸餾水，滴入1 mL液體石蠟，待水面形成油膜后，向油膜中央滴入10 μL發(fā)酵液，測量排油圈直徑[16]。

乳化性能表征：向比色管中加入3 mL正己烷和2 mL發(fā)酵液，劇烈晃動60 s后靜置24 h，觀察乳化層高度[17]。

(1)

1.3.2 菌種鑒定

1)生理生化鑒定：觀察菌落的形態(tài)特征，參照《伯杰氏細菌分類鑒定手冊》對細菌進行生理生化試驗鑒定[18]。

2)菌株16S rDNA的鑒定：采用上海生工E2up柱式細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，并進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成PCR產(chǎn)物純化及測序。

1.3.3 表面活性劑的分離與提純 將培養(yǎng)3 d的發(fā)酵液置于離心機中，以4 ℃、8 000 r/min的條件離心20 min，去除菌體。用6 mol/L HCl將上清液pH值調(diào)節(jié)為2.0，于4 ℃冰箱中靜置24 h，觀察是否有沉淀。如有沉淀，則表面活性劑可能有脂肽、脂蛋白存在；如無沉淀，則有可能存在糖脂[19]。取上清液加入等體積的乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、V氯仿∶V甲醇=2∶1、V氯仿∶V甲醇=1∶1，萃取2次，有機相合并并用無水NaSO4干燥，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到的淺黃色濃稠物即為表面活性劑粗產(chǎn)物[20]。

將粗產(chǎn)物溶于0.05 mol/L的NaHCO3溶液中，過濾不溶雜質(zhì)，用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至2.0，置于離心機中，以4 ℃、9 000 r/min的條件離心15 min，收集沉淀，40 ℃烘干后即為純化表面活性劑。

1.3.4 生物表面活性劑的鑒定 薄層層析(TLC)：取0.2 g上述粗產(chǎn)物溶于1 mL氯仿中，點樣于硅膠G板，展開劑為三氯甲烷/甲醇/水(65/15/2，V∶V)，用不同的顯色劑顯色。

1)苯酚-硫酸顯色劑：3 mL苯酚與5 mL濃硫酸溶于95 mL乙醇中，若顯棕色斑點即存在糖脂，反之，無糖脂存在。

2)茚三酮顯色劑：0.5 g茚三酮溶于100 mL丙酮中，若顯紅色斑點即存在脂肽，反之，無脂肽存在。

3)鉬酸銨-高氯酸顯色劑：40 mg溴百里香酚藍溶于100 mL 0.01%的NaOH溶液中，若顯藍紫色斑點即存在磷脂或類脂，反之，無磷脂或類脂存在[21-22]。

紅外光譜掃描分析(FT-IR)：采用KBr壓片法將上述純化后的表面活性劑混合壓成透明薄片后，使用紅外光譜掃描分析測定[23]。

1.4 產(chǎn)表面活性劑生長動力學(xué)

取0.5 mL菌液培養(yǎng)至OD600為1，按5%的接種量接種至9.5 mL新配制的LB中，置于50 mL離心管中，紗布封口，置于振蕩培養(yǎng)箱以25 ℃、150 r/min的條件培養(yǎng)，從第2小時開始每隔2 h取樣，以空白培養(yǎng)基為參比，測量600 nm波長處的OD值[24]。

Logistic模型常用作描述有限環(huán)境下生物種群的S型增長[25]，使用Logistic方程擬合菌體生長曲線，見式(2)。

(2)

式中：y為x時刻的菌株細胞密度(OD600)；x為菌株生長時間，h；a為菌株最大濃度；k為細菌生長瞬時速率，h-1；b為模型參數(shù)。

1.5 表面活性劑合成動力學(xué)

使用Luedeking-Piret方程擬合菌體合成分泌表面活性劑的過程，見式(3)。

(3)

式中：P為表面活性劑產(chǎn)量，g/L；m1為非生長相關(guān)產(chǎn)物形成參數(shù)；m2為生長相關(guān)產(chǎn)物形成參數(shù)；X為最大細胞濃度(OD600)；t為發(fā)酵時間，h。

當(dāng)m1=0、m2≠0時，產(chǎn)物形成于菌體生長階段，為生長偶聯(lián)型，產(chǎn)物直接來源于產(chǎn)能的初級代謝；當(dāng)m1≠0、m2≠0時，產(chǎn)物形成于生長期和穩(wěn)定期，產(chǎn)物形成與細胞生長部分偶聯(lián)；當(dāng)m1≠0、m2=0時，產(chǎn)物形成與細胞生長無關(guān)。

1.6 產(chǎn)表面活性劑菌對生化污泥的降解動力學(xué)

以5%的接種量將種子液接入19 mL降解培養(yǎng)基中，再加入0.1 g經(jīng)研磨并過100目篩的均質(zhì)化含油污泥，置于振蕩培養(yǎng)箱中以150 r/min、25 ℃條件降解7 d，并設(shè)置3個平行對照，運用紅外測油儀測定含油量，每天1次[26]。降解率由式(4)計算得到。

(4)

式中：w1為降解后測定含油量,mg；w2為降解前測定的含油量,mg。

對生化污泥和浮渣進行降解，通過動力學(xué)曲線來比較降解過程中的變化，一級反應(yīng)方程式見式(5)。

(5)

式(5)兩邊積分可得式(6)。

lnS=-kt+lnS0

(6)

式中：S為含油污泥t時刻的含油率，%；t為時間，d；k為一級反應(yīng)速率常數(shù)，d-1；S0為含油污泥初始含油率，%。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)表面活性劑菌的篩選和鑒定

2.1.1 產(chǎn)表面活性劑菌的分離純化 從大慶油田含油污泥中分離純化出4株產(chǎn)表面活性劑菌，用血平板進行初篩后，獲得1株菌在血平板上產(chǎn)生明顯溶血圈，命名為GJ，但血平板溶血現(xiàn)象也有可能由產(chǎn)溶血酶菌產(chǎn)生，易混淆[27]，還需進一步鑒定，因此，保留另外3株排油直徑大于3 cm的菌株，分別命名為CJ、BJ、TJ，以進行進一步研究。

表1是油擴散法和乳化性能復(fù)篩結(jié)果。由表1可以發(fā)現(xiàn)，GJ的排油活性及乳化性能明顯高于其他菌株，因此，選擇GJ作為目標(biāo)菌株。觀察菌株培養(yǎng)特征和形態(tài)特征，GJ菌落較大，為扁平、光滑、半透明、淡粉色菌落。其部分生理生化特性見表2。

表1 細菌復(fù)篩結(jié)果Table 1 Bacterial screening results

表2 菌株GJ的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of GJ

通過測序，獲得的序列輸入Gene Bank后，利用BLAST對比分析同源性并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖1所示，GJ菌在分子系統(tǒng)發(fā)育分類上屬于希瓦氏菌屬(Shewanellasp.)，與GJ最近緣的菌株是ShewanellaputrefaciensstrainFDAARGOS_681 (CP046329.1:771993-773358)，核苷酸同源性為100%。

圖1 GJ菌株16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequence of GJ

2.1.2 產(chǎn)表面活性劑菌生長動力學(xué)、產(chǎn)物合成動力學(xué) 圖2為GJ菌株的生長動力學(xué)模型。由圖2可知，GJ菌在46 h時菌濃度達到最大。2 h后進入對數(shù)生長期，此時營養(yǎng)充足，生長迅速；28 h后進入穩(wěn)定期，由于前期長勢迅猛，營養(yǎng)物質(zhì)消耗較快，46 h后便進入衰亡期[28]。

利用Origin 9.0軟件，根據(jù)試驗數(shù)據(jù)對Logistic方程進行非線性擬合，求解方程中的參數(shù)，a為1.580 5，b為6.959 8，k為0.144 9，此模型的擬合程度良好(R2=0.971 8)，說明Logistic模型可以較好地描述GJ菌體生長的情況。

根據(jù)GJ菌株生長曲線和表面活性劑產(chǎn)量曲線的變化趨勢，發(fā)現(xiàn)生長期和穩(wěn)定期都在進行表面活性劑的合成，此過程為部分生長偶聯(lián)型。因此，Luedeking-Piret方程可變?yōu)?/p>

P=aX+K

(7)

如圖2所示，將P與X進行線性擬合，得到P=0.120 5X-0.481 0，R2=0.984 8。

圖2 GJ動力學(xué)方程模擬曲線Fig.2 GJ dynamics equation simulation

2.2 表面活性劑的提取、純化及鑒定

發(fā)酵液離心后所得上清液用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至2.0，置于4 ℃冰箱中靜置24 h后未產(chǎn)生沉淀，說明產(chǎn)物中沒有脂肽、脂蛋白存在，初步鑒定產(chǎn)生的表面活性劑為糖脂類物質(zhì)。薄層層析分析顯示，GJ菌產(chǎn)物在苯酚-硫酸顯色劑下顯棕色，加入其他顯色劑均無明顯變化。這說明GJ菌主要產(chǎn)糖脂類表面活性劑，不產(chǎn)生或者產(chǎn)生較少的脂肽類、磷脂類物質(zhì)。將GJ菌株產(chǎn)物提純，用紅外光譜儀分析物質(zhì)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖3。3 433.24 cm-1波段吸收峰為—OH伸縮振動；2 926.16 cm-1處的吸收峰為糖類分子中C—H鍵的伸縮振動，表明產(chǎn)物中含飽和脂肪鏈；1 639.59 cm-1處是C=O雙鍵的伸縮振動，表明存在飽和脂肪鏈；1 458.76 cm-1處為脂肪族肽鏈上C—H鍵的變角振動吸收峰，—CH3和—CH2表明存在烷烴的鏈狀結(jié)構(gòu)；1 093.46 cm-1處的吸收峰歸屬于C—O—C鍵的伸縮振動，為酯類吸收峰，說明分子中存在一個五元環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)和糖苷鍵，進一步證實了GJ菌的產(chǎn)物為糖脂類表面活性劑。

圖3 GJ菌產(chǎn)物紅外光譜Fig.3 Infrared spectrogram of strain GJ

2.3 產(chǎn)表面活性劑菌對含油污泥的降解動力學(xué)

在降解培養(yǎng)基中將GJ分別用于降解浮渣和生化污泥，每天測定菌株對含油污泥的降解率。如圖4所示，GJ對浮渣和生化污泥均有較好的降解效果，浮渣的最終降解率為81.11%，生化污泥的降解率最終達到83.21%。GJ對生化污泥的降解速率呈先快后慢的狀態(tài)，對浮渣則呈先慢后快的狀態(tài)。推測GJ在含油量較低的環(huán)境下代謝更加活躍，能在較短時間內(nèi)合成分泌出表面活性劑。而處于含油量較高的環(huán)境中時，由于含油污泥穩(wěn)定的油包水或水包油結(jié)構(gòu)，微生物與石油烴間存在油水界面，導(dǎo)致微生物難以攝取石油烴作為碳源供給自身代謝，需要更長時間來適應(yīng)較高含油量的環(huán)境。之后分泌表面活性劑增大含油污泥乳化程度，從而增大微生物與石油烴的接觸程度，進一步對石油烴進行攝取和分解，最終達到降低含油量的目的。

圖4 菌株GJ對生化污泥和浮渣的降解率Fig.4 Degradation rate of biochemical sludge and scum by strain

圖5為菌株GJ降解生化污泥和浮渣過程中污泥含油率的變化，含油量逐漸減少，基本呈由慢到快再變慢的狀態(tài)，最終菌株GJ降解后的生化污泥含油率為1.61%，浮渣含油率為2.73%。

圖5 GJ作用下污泥含油率的變化Fig.5 Change of sludge oil content under the action of

圖6為lnS與t的擬合結(jié)果。根據(jù)石油烴降解一級反應(yīng)動力學(xué)擬合結(jié)果可知，菌株GJ降解生化污泥的一級動力學(xué)方程為S=e-0.315 2t+2.561 8；降解浮渣的一級動力學(xué)方程為S=e-0.281 6t+2.706 4。此外，一級動力學(xué)模型曲線與菌株GJ降解過程中生化污泥和浮渣含油量的變化擬合度較好，菌株GJ降解生化污泥和浮渣動力學(xué)模型的相關(guān)系數(shù)分別為R2=0.963 1和R2=0.890 6。在降解含油污泥過程中，菌株GJ對含油污泥的降解變化基本遵循一級反應(yīng)動力學(xué)。

圖6 菌株GJ降解含油污泥動力學(xué)模型Fig.6 Kinetic model for degradation of oily

2.4 產(chǎn)表面活性劑菌降解含油污泥機理分析

表面活性劑在產(chǎn)表面活性劑菌降解石油烴的過程中有重要作用，含油污泥是穩(wěn)定的油包水或水包油的乳化體系，微生物與石油烴之間存在穩(wěn)定的油水界面，導(dǎo)致微生物能接觸到的石油烴十分有限，因此，以石油烴為唯一碳源的產(chǎn)表面活性劑菌能攝取到的石油烴極少，這也是產(chǎn)表面活性劑菌在降解初期效率較低的主要原因。產(chǎn)表面活性劑菌生長代謝過程中合成分泌出表面活性劑并排到胞外，打破油水界面，與石油烴進行增溶反應(yīng)，大幅增加微生物與石油烴的接觸程度，從而能攝取石油烴并進行解離，通過活動代謝最終轉(zhuǎn)化為小分子有機物、CO2和H2O[29-30]，同時，又繼續(xù)合成分泌出表面活性劑，整個過程循環(huán)進行，這也是降解中期效果明顯的原因。GJ菌攝取、降解石油烴的作用機制如圖7所示。

圖7 GJ菌攝取、降解石油烴作用機制推測Fig.7 Speculation on the mechanism of GJ bacteria uptake and degradation of petroleum

3 結(jié)論

1)從大慶油田含油污泥中篩選出1株既產(chǎn)表面活性劑又能降解石油烴的菌株GJ，為革蘭氏陰性菌，屬于希瓦氏菌屬(Shewanellasp.)，菌株GJ呈“S”型生長，能與Logistic生長方程較好擬合。

2)薄層層析法和紅外光譜分析鑒定GJ的產(chǎn)物中存在一個五元環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)和糖苷鍵，證明GJ的產(chǎn)物為糖脂類表面活性劑。運用Luedeking-Piret方程擬合菌體合成分泌表面活性劑的情況，所得動力學(xué)方程可較好地模擬GJ分泌表面活性劑的過程。GJ對浮渣和生化污泥中的石油烴均有較好的降解效果，降解率分別為81.11%和83.21%，降解動力學(xué)均符合一級反應(yīng)動力學(xué)方程式。

3)初步推斷GJ菌攝取、降解石油烴的作用機制為：菌株GJ是以石油烴作為碳源的微生物，在生長過程中分泌次級產(chǎn)物為表面活性劑，表面活性劑打破油水界面，增大菌株與石油烴的接觸程度，從而能攝取石油烴并進行解離，促進對石油烴的攝取、代謝及增殖。代謝產(chǎn)物最終轉(zhuǎn)化為小分子有機物、CO2和H2O，同時，又繼續(xù)合成分泌出新的表面活性物質(zhì)，整個代謝過程循環(huán)進行。