玉米黃素對(duì)衣霉素誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞周期、自噬、凋亡的保護(hù)作用

章麗娜，李夢(mèng)潔，商迎輝，劉蕓如，黃漢昌，勞鳳學(xué)

（北京市生物活性物質(zhì)和功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京聯(lián)合大學(xué)功能因子與腦科學(xué)研究院，北京 100191）

阿爾茨海默癥（Alzheimer disease，AD）又稱原發(fā)性老年癡呆，是最常見(jiàn)的具有復(fù)雜病理生物學(xué)特性的癡呆癥，伴隨著至少大腦兩個(gè)區(qū)域的思維和記憶功能損傷[1-2]。AD患者的神經(jīng)心理特征包括記憶力以及其他認(rèn)知領(lǐng)域（語(yǔ)言）的減退[3]，其特征性病理表現(xiàn)為老年斑、Tau蛋白磷酸化形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFT）以及神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生丟失等[4]。AD引起的癡呆與整個(gè)疾病過(guò)程中進(jìn)行性疾病發(fā)作有關(guān)，在癥狀發(fā)作的5～12 年內(nèi)通常不可避免地導(dǎo)致死亡的發(fā)生[5]。因此，開(kāi)發(fā)預(yù)防或減慢疾病進(jìn)展速度的疾病改良療法變得十分迫切，中晚期臨床試驗(yàn)的不斷失敗阻礙著AD藥物開(kāi)發(fā)的進(jìn)程[6]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是AD早期階段的重要病理表現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白發(fā)生積累會(huì)觸發(fā)一種稱為未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，在AD患者中其激活量會(huì)增加[7]。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，UPR細(xì)胞有3種感受器可以感應(yīng)出ERS的激活，分別是抑制物阻抗性酯酶1α（inositol-requiring enzyme-1α，IRE1α）、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）[8]。

在體外實(shí)驗(yàn)中，衣霉素（tunicamycin，TM）已廣泛應(yīng)用于ERS模型[9]，其可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]、細(xì)胞周期變化[11]、細(xì)胞自噬[12]。從酵母到哺乳動(dòng)物，細(xì)胞自噬是通過(guò)促進(jìn)衰老和細(xì)胞毒性成分的降解和循環(huán)來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制，在自噬期間，目標(biāo)物被捕獲至雙膜囊泡，形成自噬小體，并通過(guò)溶酶體融合降解[13]。TM可以誘導(dǎo)SH-SY5Y產(chǎn)生細(xì)胞毒性，上調(diào)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、促凋亡蛋白C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）和磷酸化的真核生物起始因子2α（phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2α，p-eIF2α）等ERS標(biāo)記物蛋白水平[14]。ERS誘導(dǎo)劑TM可以誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞細(xì)胞周期發(fā)生G1期阻滯[11]。TM可以誘導(dǎo)自噬，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白質(zhì)的積累是ERS條件下自噬的觸發(fā)因素[12]。此外，TM誘導(dǎo)ERS而引起的自噬能緩解短暫性腦缺血損傷[15]。綜上，細(xì)胞自噬、周期、凋亡與ERS之間存在聯(lián)系，且在機(jī)體中存在協(xié)調(diào)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的作用。

有研究表明，維甲酸和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）分化的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）用以亞致死劑量岡田酸和β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）的可溶性寡聚體聯(lián)合刺激，在不引起細(xì)胞活力顯著下降的情況下，可有效提供一種模擬AD作用下膽堿能神經(jīng)元早期病理生理的體外模型[16]。Aβ42處理SH-SY5Y細(xì)胞后可導(dǎo)致細(xì)胞活力下降、形態(tài)學(xué)改變，從而增加活性氧水平，該研究證明SH-SY5Y細(xì)胞可以作為研究阿爾茨海默病病理的模型[17]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行ERS AD模型的構(gòu)建，以期為后期AD病理的研究提供數(shù)據(jù)支撐。

玉米黃素（zeaxanthin，Zea）是一種類胡蘿卜素，在自然界中分布廣泛，多存在于玉米種子、萬(wàn)壽菊和綠色蔬菜等植物組織以及一些藍(lán)藻、光致性細(xì)菌的光合膜中[18]，其在部分食品中玉米黃素的含量如表1所示。玉米黃素的分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示，其在自然界中絕大多數(shù)以(3R,3’R)-玉米黃素存在，(3R,3’S)-玉米黃素為內(nèi)消旋玉米黃素，(3S,3’S)-玉米黃素型則占少量。玉米黃素在每個(gè)β-紫羅蘭酮環(huán)上具有一個(gè)羥基。這些羥基之一與Aβ的兩個(gè)氨基酸（纈氨酸39和異亮氨酸41）相互作用，另一個(gè)β-紫羅蘭酮環(huán)上的羥基與Aβ的甘氨酸25相互作用，而玉米黃素與Aβ的氨基酸作用都不存在于Aβ位點(diǎn)，因而很可能導(dǎo)致β原纖維的崩解[19]。玉米黃素的生物活性成分在大腦疾病（特別是AD領(lǐng)域）中研究較少，但玉米黃素可以通過(guò)血腦屏障并且存在抗Aβ聚集的相關(guān)結(jié)構(gòu)，具有干預(yù)腦部疾病的研究?jī)r(jià)值。

表1 玉米黃素在食品中的含量Table 1 Contents of zeaxanthin in foods

圖1 玉米黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of zeaxanthin

本實(shí)驗(yàn)用TM處理SH-SY5Y細(xì)胞，建立ERS模型，用玉米黃素對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，測(cè)定細(xì)胞存活率、細(xì)胞周期、自噬和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，以研究玉米黃素對(duì)TM引起的細(xì)胞自噬、凋亡、周期的調(diào)節(jié)作用，為玉米黃素的功能性作用研究及AD的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SH-SY5Y細(xì)胞 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

衣霉素 北京華越洋生物科技有限公司；玉米黃素（純度為85.7%） 上海源葉生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司；雙抗（青霉素-鏈霉素）北京Solarbio公司；胎牛血清、胰蛋白酶 美國(guó)Hyclone公司；噻唑藍(lán)、Anti-β-actin抗體 美國(guó)Sigma公司；Anti-Beclin1抗體、Anti-Beclin1-C 中國(guó)臺(tái)灣Abnova公司；Anti-GAPDH和Anti-LC3B抗體 美國(guó)Cell Signaling Technology公司；Anti-BCL2抗體 英國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶山羊抗鼠免疫球蛋白（immunoglobulins，Ig）G（H+L） 北京中杉金橋公司；BCA蛋白定量測(cè)定試劑、辣根過(guò)氧化物酶山羊抗兔IgG（H+L）北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒 北京四正柏生物公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒武漢Servicebio公司。

1.2 儀器與設(shè)備

E191IR型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國(guó)金西盟公司；CKX41倒置顯微鏡 日本Olympus公司；Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀、ND-1000型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；凝膠成像分析儀 日本Image Quant RTECL公司；5840R型低溫高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；043BR57802轉(zhuǎn)膜裝置、EN027015電泳裝置 美國(guó)BIO-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)

將復(fù)蘇后的SH-SY5Y細(xì)胞與10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基混合均勻后，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞密度占培養(yǎng)皿皿底70%～80%的時(shí)候進(jìn)行傳代，按細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和速度進(jìn)行培養(yǎng)液的更換。

1.3.2 建立損傷模型

用新鮮培養(yǎng)基重懸處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，混勻后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求及培養(yǎng)皿大小接種SH-SY5Y細(xì)胞，在5% CO2、37 ℃條件下過(guò)夜培養(yǎng)，覆蓋率達(dá)到70%～80%時(shí)，使用5 μg/mL TM（TM用二甲基亞砜溶解配制成10 μg/μL的儲(chǔ)存液，－20 ℃保存，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋至所需質(zhì)量濃度）在37 ℃培養(yǎng)箱中靜置36 h誘導(dǎo)ERS模型。

1.3.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程同1.3.1節(jié)，將細(xì)胞分組為空白對(duì)照組、玉米黃素組、TM損傷組、損傷加保護(hù)組，其中空白對(duì)照組不作處理，玉米黃素組僅使用5 μmol/L玉米黃素（玉米黃素用無(wú)水乙醇配制成30 mmol/L的原溶液，使用時(shí)用新鮮培養(yǎng)液稀釋至所需濃度）處理（6 h預(yù)處理加24、36、48 h處理），TM損傷組僅使用5 μg/mL TM處理（24、36、48 h），TM損傷加保護(hù)組為5 μmol/L玉米黃素預(yù)處理6 h后加TM共處理24、36、48 h。

1.3.4 細(xì)胞活性檢測(cè)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SH-SY5Y細(xì)胞，用0.25 g/mL胰蛋白酶溶液于室溫條件下消化，搖晃培養(yǎng)皿直到細(xì)胞在顯微鏡下快速脫落后，按1×105個(gè)/mL細(xì)胞密度接種于96 孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，采用1.3.3節(jié)分組處理，每孔加入提前配好的噻唑藍(lán)溶液，與培養(yǎng)液混勻，使噻唑藍(lán)溶液終質(zhì)量濃度至5 mg/mL，室溫孵育4 h，然后終止培養(yǎng)，1 000 r/min離心10 min使結(jié)晶物沉于96 孔板底部，小心吸棄上清液，每孔中加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min充分溶解結(jié)晶物。利用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。使用下式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率。

1.3.5 細(xì)胞周期檢測(cè)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞按3×104個(gè)/mL接種到6 cm培養(yǎng)皿，放入恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日按1.3.3節(jié)分組加藥處理后，繼續(xù)培養(yǎng)36 h。按照細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)樣品進(jìn)行處理，所得樣品24 h內(nèi)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，收集數(shù)據(jù)于CELL QUEST PRO軟件，細(xì)胞周期分析用Modifit LT軟件進(jìn)行。

1.3.6 Western blot分析

細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理同1.3.1節(jié)和1.3.3節(jié)。用1 mL的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細(xì)胞2～3次后，在6 mL培養(yǎng)皿中加入約150 μL含蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液，使用細(xì)胞刮收集細(xì)胞于培養(yǎng)皿中，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000×g離心10 min后收集上清液，BCA法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。5×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上樣緩沖液按體積比4∶1加入到蛋白裂解液中，于100 ℃條件下煮沸變性5 min。冷卻后置于－20 ℃保存。樣品中目標(biāo)蛋白采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，利用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4 ℃條件下振蕩過(guò)夜孵育。次日，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，二抗37 ℃孵育2 h，用TBST緩沖液洗滌3次。利用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒處理聚偏氟乙烯膜蛋白條帶，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)上曝光膜上條帶。以β-actin和GAPDH為內(nèi)參，使用Image J軟件分析條帶的灰度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

各實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行3組及以上平行，所有數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS 19.0軟件中單因素方差分析法進(jìn)行分析，并通過(guò)Bonferroni法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著；利用Origin 2018軟件作直方圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米黃素與TM共處理時(shí)間篩選

采用玉米黃素預(yù)處理6 h后再與TM共處理24、36、48 h，檢測(cè)各組的細(xì)胞洗滌存活率，由圖2可知，玉米黃素預(yù)處理6 h后TM與玉米黃素共處理24、36、48 h，與單獨(dú)TM處理相比，共處理不同時(shí)間對(duì)TM引起的SH-SY5Y細(xì)胞損傷均存在一定緩解作用，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，損傷加保護(hù)組與TM損傷組之間開(kāi)始出現(xiàn)顯著性差異。由圖2A～C可知，與空白對(duì)照組相比，TM單獨(dú)處理時(shí)在不同時(shí)間下細(xì)胞相對(duì)存活率均極顯著下降（P＜0.01），共處理時(shí)間為24、36、48 h時(shí)TM損傷組SH-SY5Y細(xì)胞的相對(duì)存活率分別為73.38%、59.86%、55.13%（當(dāng)相對(duì)存活率約為40%時(shí)建模效果較好），損傷加保護(hù)組細(xì)胞存活率均高于TM損傷組，分別為77.10%、74.60%、67.97%，其中與TM損傷組相比，36 h時(shí)SH-SY5Y細(xì)胞相對(duì)存活率出現(xiàn)極顯著上升（P＜0.01）。綜合各因素考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇TM與玉米黃素共處理時(shí)間為36 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖2 玉米黃素與TM共處理時(shí)間對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響Fig. 2 Effect of co-treatment time of zeaxanthin and TM on cell viability of SH-SY5Y cells

2.2 玉米黃素對(duì)TM引起的細(xì)胞周期的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TM與玉米黃素處理引起的細(xì)胞周期改變。由圖3A～D和表2可知，與空白對(duì)照組相比，TM損傷組G0/G1期細(xì)胞量均出現(xiàn)極顯著上升（P＜0.01），同時(shí)G2/M期細(xì)胞量極顯著減少（P＜0.01）。玉米黃素預(yù)處理6 h后再與用TM共處理的細(xì)胞，相較于TM損傷組，G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量發(fā)生減少。由圖2E可知，TM損傷組、損傷加保護(hù)組的G2/M和S期樣品數(shù)據(jù)偏小、顏色偏藍(lán)，G0/G1期樣品數(shù)據(jù)偏大、顏色偏紅；空白對(duì)照組、玉米黃素組G2/M和S期的樣品數(shù)據(jù)偏大、顏色偏紅，而G0/G1期的樣品數(shù)據(jù)偏小、顏色偏藍(lán)，結(jié)果同表2結(jié)果一致。說(shuō)明玉米黃素可以延緩TM引起的G1期阻滯。

圖3 玉米黃素處理對(duì)TM引起的SH-SY5Y細(xì)胞周期的影響Fig. 3 Effect of zeaxanthin treatment on cell cycle of SH-SY5Y cells damaged by TM

表2 定量分析玉米黃素對(duì)TM誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞周期的影響Table 2 Effect of zeaxanthin on cell cycle of SH-SY5Y cells damaged by TM

2.3 玉米黃素對(duì)TM處理引起的細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)蛋白的影響

2.3.1 玉米黃素對(duì)TM處理引起的細(xì)胞自噬蛋白的影響

2.3.1.1 玉米黃素對(duì)TM處理引起B(yǎng)eclin1蛋白表達(dá)量的影響

在穩(wěn)態(tài)的平衡中，自噬可能起到雙重作用，一種是保護(hù)細(xì)胞免于凋亡，另一種則是其過(guò)度激活會(huì)促進(jìn)ERS誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。而B(niǎo)eclin1基因被證實(shí)是第一個(gè)在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的自噬基因，其有助于自噬體的形成[20]。如圖4和表3所示，與空白對(duì)照組相比，TM損傷組Beclin1蛋白的表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05），而損傷加保護(hù)組可以使TM引起的Beclin1表達(dá)增加得到緩解。說(shuō)明玉米黃素通過(guò)緩解TM引起的Beclin1表達(dá)增加來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞自噬的減輕作用。

圖4 玉米黃素聯(lián)合TM對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞自噬蛋白Beclin1的影響（n＝ 3）Fig. 4 Effect of zeaxanthin combined with TM on the expression of Beclin1 in SH-SY5Y cells (n = 3)

表3 玉米黃素對(duì)TM誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞自噬和凋亡蛋白的影響Table 3 Effect of zeaxanthin on the expression of protein associated with autophagy and apoptosis in SH-SY5Y cells induced by TM

2.3.1.2 玉米黃素對(duì)TM處理引起B(yǎng)eclin1-C和LC3B蛋白表達(dá)量的影響

自噬蛋白Beclin-1裂解產(chǎn)生N和C末端。C末端片段在細(xì)胞中對(duì)凋亡信號(hào)敏感，N末端則無(wú)活性。因此，Beclin1-C蛋白表達(dá)增加可以誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生，是細(xì)胞自噬轉(zhuǎn)向凋亡的關(guān)鍵蛋白。LC3B是研究最多的自噬家族蛋白，它與自噬體的發(fā)育和成熟有關(guān)，可用于監(jiān)測(cè)自噬活性[13]。如圖5和表3所示，對(duì)Beclin1-C蛋白而言，TM損傷組與空白對(duì)照組相比Beclin1-C表達(dá)量顯著上升（P＜0.05）。與TM損傷組相比，損傷加保護(hù)組Beclin1-C表達(dá)量出現(xiàn)下降但差異不顯著。而對(duì)LC3B蛋白而言，與空白對(duì)照組相比，TM損傷組LC3B表達(dá)量出現(xiàn)極顯著上升（P＜0.01）。與TM損傷組相比，損傷加保護(hù)組能夠下調(diào)TM引起的LC3B表達(dá)量上調(diào)，但效果不顯著。

圖5 玉米黃素聯(lián)合TM對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞自噬蛋白Beclin1-C和LC3B的影響（n＝ 3）Fig. 5 Effect of zeaxanthin combined with TM on the expression of Beclin1-C and LC3B in SH-SY5Y cells (n = 3)

2.3.2 玉米黃素對(duì)TM處理引起凋亡蛋白BCL2表達(dá)量的影響

BCL2是一種抗凋亡蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中BCL2與Beclin-1密切相關(guān)且相互結(jié)合，抑制Beclin-1免受切割，從而起到促進(jìn)自噬的功能。由圖6和表3可知，與空白對(duì)照組相比，TM處理可以極顯著降低BCL2的表達(dá)水平（P＜0.01），起到促進(jìn)凋亡的作用，而損傷加保護(hù)組能顯著緩解該蛋白表達(dá)量的下降（P＜0.05）。說(shuō)明玉米黃素可以緩解TM引起的抗凋亡蛋白BCL2表達(dá)量的下降。

圖6 玉米黃素聯(lián)合TM對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡蛋白BCL2的影響（n＝ 4）Fig. 6 Effect of zeaxanthin combined with TM on the expression of BCL2 protein in SH-SY5Y cells (n = 4)

本研究結(jié)果表明，玉米黃素（5 μmol/L）可有效拮抗TM（5 μg/mL）誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和凋亡。與空白對(duì)照組相比，TM損傷顯著增加Beclin1（P＜0.05）、LC3B（P＜0.01）和Beclin1-C（P＜0.05）的表達(dá)量，降低BCL2表達(dá)量（P＜0.01），而玉米黃素對(duì)TM引起的自噬蛋白表達(dá)量的上升和抗凋亡蛋白表達(dá)量的下降均具有拮抗作用，其中BCL2表達(dá)改變差異顯著（P＜0.05）。由此可知，玉米黃素可以緩解TM誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和凋亡。

3 討 論

2021年，65歲及以上AD患者所支付的醫(yī)療、長(zhǎng)期護(hù)理和臨終關(guān)懷服務(wù)的總金額估計(jì)為3 550億 美元[21]。因此，對(duì)AD的干預(yù)研究刻不容緩。目前為止，細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白磷酸化所形成NFT仍然同細(xì)胞外的Aβ沉積所形成軸突斑塊一起作為AD的主要病理學(xué)特征[22-23]。然而AD的發(fā)病機(jī)制一直未明，缺乏有效的診斷與治療方法[24]。

ERS是AD的早期事件，其被激活時(shí)間在AD病理征狀出現(xiàn)之前。主要是由于AD神經(jīng)元中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的增多引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的失衡[25]。ERS被激活后會(huì)引發(fā)自噬，自噬是哺乳動(dòng)物細(xì)胞清除異常蛋白的重要過(guò)程，是維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)重要防御系統(tǒng)，但過(guò)度的自噬會(huì)引起細(xì)胞的死亡[26]。此外，自噬在細(xì)胞凋亡過(guò)程中扮演雙重角色，分別表現(xiàn)出抗凋亡和促凋亡的特性[27-28]。研究表明，ERS可調(diào)控自噬、凋亡、周期過(guò)程[29]。因此，尋找有效的生物活性物質(zhì)在AD早期階段抑制ERS過(guò)程具有重要意義。

玉米黃素作為類胡蘿卜素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在羥基，對(duì)抗淀粉樣蛋白生成活性至關(guān)重要[30]。在一項(xiàng)針對(duì)AD患者的臨床試驗(yàn)中，與對(duì)照組患者相比，AD患者血清中玉米黃素濃度降低，視力下降，年齡相關(guān)性黃斑變性發(fā)生率增高[31]。此外，類胡蘿卜素的多烯主鏈通過(guò)疏水性相互作用抑制Aβ原纖維的形成[32-33]。綜上，玉米黃素具有抗AD的潛力。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ERS誘導(dǎo)劑TM建立SH-SY5Y ERS損傷模型，研究玉米黃素干預(yù)對(duì)ERS損傷引起的細(xì)胞周期、自噬、凋亡的影響，進(jìn)而探究其在AD細(xì)胞模型中的作用。結(jié)果表明，在共處理時(shí)間（24、36、48 h）篩選中，玉米黃素與TM共處理36 h可合理地對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行損傷保護(hù)。對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞分組進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)與分析，發(fā)現(xiàn)TM明顯具有阻滯G1期細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)變的作用，而玉米黃素處理可以減輕TM誘導(dǎo)的G1期細(xì)胞阻滯。Western blot結(jié)果表明，TM可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬蛋白Beclin1、Beclin1-C、LC3B的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白BCL2的表達(dá)，而玉米黃素均起到逆轉(zhuǎn)作用。

綜上所述，玉米黃素對(duì)TM誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其可能是通過(guò)玉米黃素減輕細(xì)胞在G1期發(fā)生的阻滯、緩解自噬以及抗凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)。