普洱熟茶對D-半乳糖衰老模型小鼠腸道菌群的影響

雷舒雯，侯 艷,2，陳德洪，龔加順,*

（1.云南農業大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農業大學茶學院，云南 昆明 650201；3.云南農業大學動物醫學院，云南 昆明 650201）

衰老是指機體的結構、功能的代謝及適應性逐漸衰退的總現象[1]。機體的衰老與其生理機能及各種病理過程密切相關。我國已經進入老齡化嚴重階段，截至2019年底，中國60歲以上老年人口約2.54億，占總人口的18.1%。隨著人口老齡化加快，由衰老導致的慢性病（如帕金森病、阿爾茲海默癥、癌癥、糖尿病等）已成為人們關注和研究的熱點。有研究報道，人類的健康、衰老和長壽與腸道微生物群有關[2]。當人們處于衰老期，腸道生理功能隨著時間的推移，其免疫功能逐漸減退，加之多種外因（生活方式、飲食習慣、運動情況、藥物使用等）使腸道菌群發生質和量的變化，導致腸道微生物群多樣性降低[3-4]。已有研究表明生活在腸道中的微生物或能改變機體的老化進程[5]。

普洱茶是我國云南特有名茶，深受消費者喜愛。現代醫學研究表明，普洱茶具有調節腸道菌群、抗衰老、抗氧化、增強免疫、減肥降脂等功效[6-9]，對人體起到保健的作用。普洱茶能夠避免氧化劑造成的氧化損傷，改善體內氧化還原狀態，進而發揮抗衰老作用[10]。普洱熟茶對腸道菌群失調小鼠有改善作用，并在一定程度上能夠調節腸道內的菌群結構使其趨于多樣性，從而使腸道微生態系統更加健康穩定，維持機體的健康[11]。目前有關普洱熟茶通過調節腸道菌群來改善機體衰老的研究鮮見報道。因此，本研究采用D-半乳糖（D-galactose，D-gal）致衰老模型小鼠，以普洱熟茶水提物為受試物對衰老小鼠進行干預，通過16S rDNA測序技術分析衰老小鼠腸道菌群的變化，探究普洱熟茶能否通過改善小鼠的腸道菌群而達到延緩衰老的作用，以期為普洱熟茶保健功效進一步的開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性C57BL/6小鼠，5～6周齡，體質量為（20±2）g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司（許可證號：SCXK（蘇）2016-0010）；動物飼料 江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司。

大益牌普洱熟茶（‘嘜號7262’，批次1801，2018年7月5日生產） 勐海茶廠；D-gal 美國Sigma-Aldrich公司；0.9%生理鹽水 山東齊都藥業有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度檢測試劑盒上海酶聯生物科技有限公司；4%多聚甲醛通用型組織固定液 廣州賽國生物科技有限公司；無水乙醇、二甲苯、中性樹膠 國藥集團化學試劑有限公司；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染液套裝 賽維爾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；RT-6100酶標儀 濟南駿馳生物科技有限公司；TG16W離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；JJ-12J脫水機、JB-P5包埋機 武漢俊杰電子有限公司；RM2016病理切片機 上海徠卡儀器有限公司；GFL-230烤箱 天津市萊玻瑞儀器設備有限公司；Nikon Eclipse E100正置光學顯微鏡、NIKON DS-U3成像系統 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 普洱熟茶水提物制備

普洱熟茶磨碎80目過篩，將茶樣按1∶50（m/V）茶水比于沸水浸提10 min，趁熱過濾，重復5次，茶湯減壓低溫（（60±1）℃）濃縮至1 g/mL，裝瓶滅菌（120 ℃、15 min），4 ℃低溫冷藏。

1.3.2 普洱熟茶水提物組分的測定

蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍法[12]，標準曲線方程為y=0.531 3x+0.025 2，R2=0.990 4（x為牛血清白蛋白質量濃度/（mg/mL）、y為595 nm波長處吸光度）。氨基酸含量測定采用茚三酮比色法[13]，標準曲線方程為y=1.118 5x－0.035 2，R2=0.996 7（x為谷氨酸質量濃度/（mg/mL）、y為570 nm波長處吸光度）。總糖、多糖含量測定采用蒽酮-硫酸法[14]，標準曲線方程為y=1.762 7x+0.036 6，R2=0.998 9（x為葡萄糖質量濃度/（mg/mL）、y為625 nm波長處吸光度）。總多酚、總黃酮含量測定采用福林-酚比色法[15]，標準曲線方程為y=5.667 7x+0.064 4，R2=0.999 0（x為沒食子酸質量濃度/（mg/mL）、y為765 nm波長處吸光度）。總兒茶素含量測定采用香蘭素比色法[16]，標準曲線方程為y=2.136 8x+0.056 0，R2=0.991 7（x為表兒茶素質量濃度/（mg/mL）、y為500 nm波長處吸光度）。茶色素（茶黃素、茶紅素和茶褐素）含量測定采用Roberts萃取比色法[17]。

1.3.3 動物分組、建模與取樣

將30只小鼠適應性飼養2周后，隨機分為對照組、衰老組和普洱熟茶組，每組各10只。對照組頸背部皮下注射10 mL/kgmb0.9%生理鹽水；其他組頸背部皮下注射500 mg/kgmbD-gal溶液，持續8周建立小鼠衰老模型。在建模的第9周開始，普洱熟茶組灌胃3 g/kgmb普洱熟茶水提物（根據日本東京桑野研究所推薦成人每日平均用茶量6 g，按人體標準體質量60 kg計算得成人每日用茶量為0.1 g/kgmb。小鼠與人的等效劑量約為10 倍，即每只小鼠正常的劑量為1 g/kgmb水提物。同時結合課題組前期研究結果，本實驗采用3 g/kgmb水提物作為灌胃劑量），對照組和衰老組灌胃等量蒸餾水。實驗期間每7 d稱質量1次，按體質量變化調整注射及灌胃劑量。

18周采集小鼠的新鮮糞便（約0.5 g）于滅菌離心管中，－80 ℃凍存待測。實驗結束后，將小鼠脊椎脫臼處死，冰上取出肝臟組織，在冰浴條件下加入一定量的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4）制成組織勻漿液，3 000 r/min離心20 min，取上清液，置于－80 ℃凍存待測。同時冰上取出完整腸道，分離出空腸，于空腸中段剪下約1 cm長的腸段放入4%多聚甲醛組織固定液固定。

1.3.4 小鼠抗氧化指標測定

采用相對應的試劑盒對肝臟組織勻漿中SOD、GSH-Px活力以及MDA含量進行檢測，再根據BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定勻漿蛋白質量濃度，抗氧化指標均以蛋白質量計。

1.3.5 小鼠小腸病理切片

空腸組織→石蠟包埋→切片→脫蠟至水→HE染色→脫水封片→顯微鏡鏡檢→圖像采集分析。

應用Image-Pro Plus 6.0軟件以右下角100 倍和200 倍標尺為標準，100 倍視野下，每張切片從3個視野中選取5 根最高最完整的絨毛，分別測量絨毛高度、隱窩深度和肌層厚度。

1.3.6 16S rDNA高通量測序

采用Qubit?dsDNA Assay Kit試劑盒提取糞便樣品中菌群總DNA，以提取的DNA為模板，使用帶有barcode的特異引物（341F：CCTACGGGRBGCASCAG、806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT）擴增16S rDNA的V3～V4區，運用Illumina NovaSeq測序平臺測序。經過Reads拼接過濾，分類單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類進行物種注釋及豐度分析。基于OTU對測序進行物種多樣性指數分析以及深度檢測；基于分類學信息在各個分類水平上進行群落結構的統計分析。在上述分析的基礎上，對多樣本的群落組成和系統發育信息進行多元分析和差異顯著性檢驗等一系列深入的統計學和可視化分析。

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 普洱熟茶水提物組分

由表1可知，普洱熟茶水提物中蛋白質含量為70.64 g/kg、氨基酸含量為24.86 g/kg、總糖含量為178.34 g/kg、多糖含量為11.28 g/kg、總多酚含量為62.69 g/kg、總黃酮含量為40.61 g/kg、總兒茶素含量為18.85 g/kg，茶色素中茶黃素含量為1.61 g/kg，茶紅素未檢測到，茶褐素含量最高，為249.96 g/kg。

表1 普洱熟茶水提物組分Table 1 Composition of Pu-erh tea infusion

2.2 小鼠衰老模型判定

小鼠衰老模型是否構建成功，是后期實驗進行的基礎。衰老模型的評價初步通過觀察小鼠在實驗過程中毛色、精神狀態、活躍度、攝食量、行動的靈活度等來判定[18-19]。建模8周后，對照組小鼠活躍，毛色光滑，精神狀態良好；衰老模型組小鼠行動較遲緩，毛色、胡須變白并有所脫落，精神狀態較差（圖1）。由此看出，衰老模型建立成功。

圖1 建模8周后小鼠外觀Fig. 1 Mice appearance after eight weeks of modeling

2.3 普洱熟茶對小鼠體質量的影響

體質量常用于反映機體的健康狀況，作為衡量小鼠生長發育的重要指標之一[20]。由圖2可知，前10周（主要為建模期）小鼠體質量增長較快，衰老組小鼠體質量增加量比對照組多，說明注射D-gal影響了小鼠正常發育；第10周后（干預期），普洱熟茶組小鼠體質量逐漸下降。與對照組相比，衰老組小鼠最終體質量略有減輕；與衰老組相比，普洱熟茶組小鼠最終體質量減輕，這可能是普洱熟茶具有減肥效果，對體質量增長有一定的抑制作用。

圖2 普洱熟茶對小鼠體質量的影響Fig. 2 Effect of ripe Pu-erh tea on body mass of mice

2.4 普洱熟茶對小鼠抗氧化指標的影響

表2 普洱熟茶對小鼠抗氧化指標的影響Table 2 Effect of ripe Pu-erh tea on antioxidant indexes in mice

由表2可知，與對照組相比，衰老組小鼠的肝臟組織中SOD和GSH-Px活力均顯著降低（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05）；與衰老組相比，普洱熟茶組小鼠的肝臟組織中SOD和GSH-Px活力均顯著升高（P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05）。這表明D-gal持續攝入會導致小鼠體內氧化應激，促進脂質過氧化，普洱熟茶干預后可提高衰老小鼠肝臟組織的抗氧化能力，清除體內過多的自由基，抑制脂質過氧化，降低MDA含量。

2.5 小鼠小腸組織病理結果的分析

2.5.1 普洱熟茶對小鼠小腸組織形態的影響

由圖3可知，對照組小腸組織結構完整，絨毛均勻細長，呈指狀排列，上皮細胞未見脫落，腸腺排列緊密；衰老組小腸絨毛缺損，腫脹肥大，組織黏膜層損傷，局部黏膜上皮細胞脫落，固有層腸腺排列疏松，間隙增寬；普洱熟茶組小腸絨毛長度較衰老組明顯增長，無肥大現象，黏膜層及上皮細胞未見脫落，固有層腸腺排列緊密。

圖3 普洱熟茶對小鼠小腸組織形態的影響Fig. 3 Effect of ripe Pu-erh tea on small intestinal morphology of mice

2.5.2 普洱熟茶對小鼠小腸組織絨毛長度、隱窩深度及肌層厚度的影響

小腸是機體營養物質消化吸收的主要部位，其結構完整是保證營養物質能夠正常消化吸收的基礎[21]。絨毛長度、隱窩深度及肌層厚度等是衡量小腸消化吸收能力的相關指標[22]。由表3可以看出，與對照組相比，衰老組絨毛長度、隱窩深度和肌層厚度顯著降低（P＜0.05）。與衰老組相比，普洱熟茶組絨毛長度、隱窩深度和肌層厚度顯著升高（P＜0.05）。說明D-gal對小鼠的小腸形態結構有一定影響，而普洱熟茶可以改善衰老小鼠的小腸形態結構。

表3 普洱熟茶對小鼠小腸絨毛長度、隱窩深度及肌層厚度的影響Table 3 Effect of ripe Pu-erh tea on villus length, crypt depth and muscle layer thickness of small intestine in mice

2.6 普洱熟茶對小鼠腸道菌群結構的影響

2.6.1 物種多樣性分析

Shannon指數不僅反映了樣本中物種的數量（即豐富度），還反映了樣本中各物種的豐度分布情況（即均勻度）。由圖4可知，與對照組相比，衰老組Shannon指數顯著升高（P＜0.05），這說明D-gal致衰老小鼠的腸道微生物菌群結構發生了顯著變化。當衰老小鼠攝入普洱熟茶后，腸道菌群Shannon指數顯著降低（P＜0.05），提示普洱熟茶干預有助于改善衰老小鼠腸道菌群結構。

圖4 小鼠腸道微生物多樣性指數Fig. 4 Diversity index of gut microflora in mice

2.6.2 物種組成分析

2.6.2.1 物種Venn圖分析

Venn圖可用于統計多個樣品中所共有和獨有的OTU數目。通常情況下，分析時選用相似水平為97%的OTU樣品表。由圖5可知，衰老組中的OTU數目最多，達到779個，對照組OTU數目最少，有608個，普洱熟茶組OTU數目有695個。對照組特有29個OTU，衰老組特有179個OTU，普洱熟茶組特有106個OTU。各組樣品中共有的OTU是496個，僅對照組與衰老組共有的OTU數目是47個，僅衰老組與普洱熟茶組共有的OTU 數目是57個。

圖5 各組物種Veen圖Fig. 5 Venn diagram between groups species

2.6.2.2 基于門水平的物種組成分析

選取每個組別在門水平上最大豐度排名前10的物種，制作生成物種相對豐度柱形累加圖，以便直觀查看各組別在門水平上相對豐度較高的物種及其比例。由圖6可知，對照組、衰老組和普洱熟茶組小鼠的腸道菌群門水平都以厚壁菌門（Firmicutes）（分別為40.23%、49.65%和33.39%）和擬桿菌門（Bacteroidetes）（分別為54.22%、32.19%和58.94%）為主。

圖6 小鼠腸道菌群門水平相對豐度柱狀圖（豐度前10的菌門）Fig. 6 Relative abundance of top ten most dominant intestinal bacterial phyla in mice

2.6.2.3 基于屬水平的物種組成分析

選取每個組別在屬水平上最大豐度排名前30的物種，制成生成物種相對豐度柱形累加圖。由圖7可知，在屬水平上，與對照組相比，衰老組乳桿菌屬（Lactobacillus）、擬桿菌屬（Bacteroides）、擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）、另枝菌屬（Alistipes）相對豐度降低，杜氏乳桿菌屬（Dubosiella）相對豐度升高；與衰老組相比，普洱熟茶組擬桿菌屬（Bacteroides）、擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）、另枝菌屬（Alistipes）、丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）、勞特氏菌屬（Blautia）相對豐度升高，乳桿菌屬（Lactobacillus）和Dubosiella菌屬相對豐度降低。

圖7 小鼠腸道菌群屬水平相對豐度柱狀圖（豐度前30的菌屬）Fig. 7 Relative abundance of top 30 most dominant intestinal bacterial genus in mice

2.6.3 物種特征性差異分析

由圖8可知，與對照組相比，衰老組小鼠腸道的擬桿菌門與厚壁桿菌門數量比（Bacteroidetes/Firmicutes，B/F）值降低，但差異不顯著（P＞0.05）；與衰老組相比，普洱熟茶組B/F值顯著升高（P＜0.05）。說明在門水平上，衰老組的腸道菌群出現了衰老特征，并且普洱熟茶通過提高B/F值明顯改善了衰老小鼠在門水平上的菌群紊亂現象。

圖8 普洱熟茶對小鼠腸道菌群B/F值的影響Fig. 8 Effect of ripe Pu-erh tea on B/F ratio in mice

圖9 各組小鼠腸道菌群物種線性判別分析值分布圖Fig. 9 Differences in relative abundance of intestinal bacteria between groups species in mice

圖10 各組小鼠腸道菌群科水平相對豐度直方圖Fig. 10 Relative abundance of intestinal bacterial families between groups in mice

圖11 各組小鼠腸道乳桿菌屬水平相對豐度直方圖Fig. 11 Relative abundance of intestinal Lactobacillus between groups in mice

線性判別分析差異貢獻分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）強調統計意義和生物相關性，能夠在組與組之間尋找具有統計學差異的生物標志物，識別不同豐度的特征以及相關聯的類別[23]。圖9展示出各組微生物群落在各分類水平下存在明顯差異的物種，衰老組物種豐度顯著差異的科為乳桿菌科（Lactobacillaceae），普洱熟茶組物種豐度顯著差異的科為瘤胃菌科（Ruminococcaceae）。乳桿菌科中僅包括乳桿菌屬（Lactobacillus）1個屬。由圖9得到圖10、11特征性菌群的相對豐度直方圖，與對照組相比，衰老組小鼠腸道中Lactobacillaceae和Lactobacillus相對豐度顯著降低（P＜0.05），Ruminococcaceae相對豐度顯著升高（P＜0.05）；與衰老組相比，普洱熟茶組小鼠腸道中Lactobacillaceae和Lactobacillus相對豐度顯著降低（P＜0.05），Ruminococcaceae相對豐度顯著升高（P＜0.05）。

3 討 論

小鼠長期注射D-gal可導致自然衰老，并造成動物體內代謝紊亂，產生大量自由基，打破氧化與抗氧化的動態平衡，從而導致氧化應激、認知障礙等衰老相關病理現象的發生[24]。研究發現普洱茶水提取物能減少MDA產生，保護自由基引起的細胞損傷，增加SOD和GSH-Px活性[25]。本研究發現在普洱熟茶干預下，D-gal致衰老小鼠肝臟組織中的SOD和GSH-Px抗氧化酶活力得到顯著改善，同時脂質過氧化物MDA的水平含量顯著降低，說明普洱熟茶可以增強抗氧化系統活性，這可能與普洱熟茶的茶色素含有大量的具有極強清除自由基和抗氧化作用的活性酚羥基等活性因子有關。

小腸在機體衰老的過程中會出現退行性變化。腸絨毛能夠增加小腸吸收面積，提高營養物質的消化利用率；隱窩深度反映小腸細胞的生成率；肌層厚度則反映小腸運動狀態[26-28]。組織結構完整是腸道正常發揮消化吸收功能及免疫機能的基本保證。本研究發現衰老小鼠絨毛長度、隱窩深度和肌層厚度降低，這與彭秀穎等[29]的研究結果一致，普洱熟茶干預的衰老小鼠小腸絨毛長度、隱窩深度和肌層厚度顯著升高，表明普洱熟茶對小腸退行性變化具有保護作用，提高對營養物質的吸收力，增強小腸運動力，緩解衰老導致的小腸黏膜組織損傷，從而保護小腸黏膜免疫功能。

人體腸道微生物群是一個巨大的生態系統，為宿主發育，正常免疫系統的形成新陳代謝均需要菌群的參與。B/F值是衡量機體衰老進程的一個重要指標，老年人的B/F比值低于年輕成年人[30-31]。本研究發現普洱熟茶干預后，小鼠腸道優勢菌群為Bacteroidetes和Firmicutes這兩個細菌門，同時B/F值也顯著上升，與趙祎[32]的研究結果一致。Bacteroidetes可將糖類物質轉化為對身體有益的產物[33]。同時，普洱熟茶干預的衰老小鼠Bacteroides相對豐度上升，這表明普洱熟茶可調節衰老小鼠腸道中Bacteroidetes和Firmicutes的相對豐度，調整腸道菌群結構，從而延緩衰老進程。

腸道菌群組成隨衰老發生改變，但未發現統一的老年菌群特征[34]。Lachnospiraceae中的Blautia、Lachnospira以及Ruminococcaceae中的Faecalibacterium、Oscillospir等被證明是與短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）產生相關的菌屬[35]。SCFAs能夠穩定腸道內環境，改善衰老過程中腸道微生物菌群的失衡狀態，進而起到延緩衰老的作用[36]。Blautia具有防止炎癥發生、維持腸道穩態的功能，具有潛在益生菌特性[37]。Ruminococcaceae是厚壁菌門中產生丁酸鹽的一類菌群，丁酸鹽被證實能夠調節腸道免疫反應，緩解腸道炎癥和氧化損傷[38]。本研究發現普洱熟茶干預的衰老小鼠腸道Blautia相對豐度上升和Ruminococcaceae相對豐度顯著上升，這表明普洱熟茶在一定程度上增加了衰老小鼠腸道內有益菌，調節了腸道微生物結構。Lactobacillus是健康成人腸道內普遍存在的細菌，具有調節腸道菌群、增強免疫力、改善腸道功能、抗氧化等作用[39]。路曉杰[40]通過高通量測序分析發現普洱茶提取物降低了高脂飲食條件下Lactobacillus等與肥胖呈正相關的菌在相應分類水平上的豐度。本研究發現D-gal致衰老小鼠Lactobacillus的相對豐度顯著下降，普洱熟茶干預后其相對豐度也下降，這是否與攝入普洱熟茶小鼠的體質量減輕有關，還需要進一步地深入研究分析。

4 結 論

本研究結果表明普洱熟茶在正常的3 倍高劑量條件下能夠增強衰老小鼠肝臟組織的抗氧化酶活性，保護衰老小鼠的小腸形態結構及小腸黏膜免疫功能，改善衰老小鼠的腸道微生物菌群組成結構，一定程度上增加了腸道內有益菌的相對豐度，維持腸道平衡與穩定，從而延緩衰老。